一種硝基還原酶在芳香族硝基化合物降解還原中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種硝基還原酶在芳香族硝基化合物降解還原中的應(yīng)用，所述硝基還原酶具有如SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸殘基序列。本發(fā)明提供的硝基還原酶在芳香族硝基化合物降解還原中的應(yīng)用，當(dāng)苯環(huán)上硝基取代基的數(shù)目大于等于1時，本發(fā)明提供的硝基還原酶都對其具有還原活性，不僅包括對硝基苯甲醛類，硝基甲苯類，硝基苯胺類，硝基酚類，硝基呋喃類，硝基苯類的還原，還包括抗癌前藥CB1954，開辟了其作為前藥激活劑在基因治療中的潛在應(yīng)用。
【專利說明】一種硝基還原酶在芳香族硝基化合物降解還原中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】和基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地涉及一種硝基還原酶在芳香族硝基化合物降解還原中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]氧化葡萄糖酸桿菌被稱為“活著的氧化催化劑”，可不完全氧化各種醇、醛等化合物，在工業(yè)上的有著很重要的應(yīng)用，也是工業(yè)生物技術(shù)中被廣泛應(yīng)用的微生物種之一。
[0003]硝基芳香化合物廣泛存在于自然界中，主要應(yīng)用于染料、殺蟲劑、炸藥、農(nóng)藥、醫(yī)藥及其他化工產(chǎn)品的生產(chǎn)(SHUHEI ZENNO et al，1996)。隨著工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，進(jìn)入環(huán)境中的硝基芳香化合物日益富集，給人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，因硝基的存在而使其難以降解(CHARLES C.SOMERVILLE et all995)。硝基基團(tuán)作為生物醫(yī)藥、抗菌劑和殺蟲劑中常見的官能基團(tuán)，對該硝基基團(tuán)的還原是實(shí)現(xiàn)硝芳基污染物降解的關(guān)鍵步驟。硝基還原酶是一類以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或尼克酰胺二核苷酸(NADPH/NADH)為氫供體的黃素蛋白。近年來，因硝基還原酶參與了爆炸物、硝基化合物類環(huán)境污染物的降解，而逐漸走進(jìn)人們的視野。隨著基因治療新技術(shù)的發(fā)展，L.M.CoBB(1969)合成出CB1954，人們開始挖掘硝基還原酶/CB1954在基因治療中的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種硝基還原酶在芳香族硝基化合物降解還原中的應(yīng)用，不再僅僅局限于對環(huán)境的凈化，并且開辟了硝基還原酶在基因治療新【技術(shù)領(lǐng)域】中的發(fā)展。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0006]提供一種硝基還原酶在芳香族硝基化合物降解還原中的應(yīng)用，所述硝基還原酶具有如SEQ ID N0.1所不的氣基酸殘基序列。
[0007]所述硝基還原酶編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]所述芳香族硝基化合物包括:硝基苯甲醛類，硝基甲苯類，硝基苯胺類，硝基酚類，硝基呋喃類，硝基苯類。
[0009]所述芳香族硝基化合物還包括抗癌前藥CB1954。
[0010]所述硝基還原酶以NADPH為輔酶。
[0011]所述硝基還原酶的輔因子是FMN。
[0012]所述硝基還原酶在30°C~70°C溫度范圍內(nèi)保持最高酶活50%以上的酶活。
[0013]優(yōu)選地，所述硝基還原酶的最適溫度是60°C。
[0014]所述硝基還原酶在pH6~9.5范圍內(nèi)保持最高酶活50%以上的酶活。
[0015]優(yōu)選地,所述硝基還原酶的最適pH是8.5。
[0016]本發(fā)明提供的硝基還原酶在芳香族硝基化合物降解還原中的應(yīng)用，本發(fā)明的硝基還原酶底物譜寬泛，能夠還原多種芳香族硝基化合物，不僅包括對硝基苯甲醛類，硝基甲苯類，硝基苯胺類，硝基酚類，硝基呋喃類，硝基苯類的還原，還對抗癌前藥CB1954表現(xiàn)良好的還原酶活性，開辟了其作為前藥激活劑在基因治療中的潛在應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明的硝基還原酶基因的DNA電泳圖譜；
[0018]圖2是本發(fā)明的質(zhì)粒pET28a-gox0834的構(gòu)建圖；
[0019]圖3是本發(fā)明的基因工程菌發(fā)酵表達(dá)的粗酶液的SDS-PAGE驗(yàn)證圖；
[0020]圖4是本發(fā)明的基因工程菌發(fā)酵表達(dá)的粗酶液經(jīng)過鎳柱純化所得純硝基還原酶的SDS-PAGE驗(yàn)證圖；
[0021]圖5是本發(fā)明的硝基還原酶在不同溫度下的相對活力；
[0022]圖6是本發(fā)明的硝基還原酶在不同pH值下的相對活力；
[0023]圖7A、圖7B和圖7C是測定gox0834輔因子的HPLC洗脫圖，其中圖7A是FMN，圖7B是FAD，圖7C是gox0834的輔因子，橫坐標(biāo)代表時間，單位是分鐘；
[0024]圖8A和圖8B是本發(fā)明的硝基還原酶還原間二硝基苯產(chǎn)物鑒定的GC-MS圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0026]1、氧化葡萄糖酸桿菌總DNA的提取
[0027]將氧化葡萄酸桿菌Gluconobacter oxydans DSM2003 (德國微生物菌種保藏中心)接種于培養(yǎng)基，30°C 200rpm振蕩過夜培養(yǎng)收集菌體，用TIANamp Bacteria DNA Kit(TIANGEN)提取基因組DNA，作為擴(kuò)增基因的模板。
[0028]2、硝基還原酶基因的克隆和篩選
[0029]根據(jù)氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003的硝基還原酶編碼基因gox0834 (其氨基酸殘基序列如SEQ ID N0.1所示，基因序列如SEQ ID N0.2所示)設(shè)計引物，得到兩條引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，引物序列分別為:
[0030]5’ -ACGGAATTCATGTCGGGCACCTCTTCC (帶下劃線的堿基為 EcoR I 識別位點(diǎn))；
[0031]5’ -ATTAAGCTTTTAGCGGAGCGGAAAGCCGAGCCTG (帶下劃線的堿基為 Hind III識別位點(diǎn)，粗體為終止密碼子)。
[0032]取步驟I中提取的氧化葡萄酸桿菌基因組DNA為模板，采用上述引物PCR擴(kuò)增本發(fā)明的硝基還原酶編碼基因。其中，50 μ I PCR反應(yīng)體系為:模板(lOOng/μ 1)2μ I ;PCRmix (東盛)25 μ I ;引物(各20ng/y 1)1.5μ I ；ddH2020 y L.PCR反應(yīng)程序如下:第一階段變性950C，5min ;第二階段變性95°C，30s，退火58°C，30s,延伸72°C，Imin,共進(jìn)行25個循環(huán)；第三階段延伸72°C，10min。得到的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，其中 Marker 購自東盛，分子量從小到大分別為 200bp，500bp,800bp, 1200bp, 2000bp, 3000bp,4500bp。
[0033]PCR 產(chǎn)物用 EcoR I 和 Hind III (TAKARA)雙酶切，用 Cycle-Pure Kit (OMEGA)直接回收酶切片段，與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶酶切并直接回收的質(zhì)粒pET28a鏈接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5a后，涂布于含有Kan的LB固體培養(yǎng)基上。37°C培養(yǎng)14h，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，有正確條帶的，挑取單克隆轉(zhuǎn)接到5ml LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，然后用PlasmidMini Kit (OMEGA)提取質(zhì)粒鑒定和測序。經(jīng)測序正確的質(zhì)粒命名為pET28a_gox0834，如圖2，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌(E.Co I i ) BL21，構(gòu)建出含有重組質(zhì)粒的菌株Gox0834_pET28a。
[0034]其中酶切及連接反應(yīng)體系如表1所示。
[0035]表1
DNA酶切體系__DNA連接體系_ DNA_20ul__pET28a_5 ul IOXBuffer_5_ul__目的基因片段_3 ul [0036]限制性內(nèi)切酶I 2.5 ulIOXBuffer_Iul 限制性內(nèi)切酶 II 2.5 ulT4 DNA Iigase_I ul CldH2O_20ul__ 總體積_50ul__總體積_10 ul
[0037]3、重組菌株的培養(yǎng)以及硝基還原酶的表達(dá)
[0038]將步驟2中獲得的陽性克隆接種于5ml液體培養(yǎng)基，接種量1%，37°C 200rpm培養(yǎng)8小時，后轉(zhuǎn)接200ml搖瓶，培養(yǎng)1-2小時，至OD600達(dá)到0.6-0.8時，加入一定量IPTG，25°C培養(yǎng)12小時。然后離心收集菌體，再用20mM PBS (pH7.4)緩沖液洗滌兩次，最后沉淀用75ml50mM PBS (pH7.4)懸浮，再經(jīng)超聲破碎獲得粗酶液，其超聲功率為300W，超聲3min，停5min，超聲99個循環(huán)。粗酶液用SDS-PAGE鑒定，如圖3所示，泳道1，2，3，4均為粗酶液。其中 Marker 購自 TaKaRa，分子量從小到大分別為 14.4KD, 18.4KD, 2KD, 35KD, 45KD, 66.2KD,116.0KD0
[0039]4、硝基還原酶純化
[0040]取步驟3中所得粗酶液10，OOOrpm離心30分鐘,上清液用于鎳柱純化。所用鎳柱為安捷倫His Trap，流程為常規(guī)流程，`所得樣品用SDS-PAGE鑒定，鑒定結(jié)果如圖4所示，泳道I中的明顯條帶即為純化所得的硝基還原酶純酶，其分子量約為30KD。其中Marker購自TaKaRa，分子量從大到小分別為 14.4KD, 18.4KD, 2KD, 35KD, 45KD, 66.2KD, 116.0KD。
[0041]5、硝基還原酶的活性測定及功能鑒定
[0042]將步驟4中所得純酶用于酶活研究，硝基還原酶以NADPH、NADH為輔酶，用酶標(biāo)儀測定單位時間內(nèi)340nm處的光吸收值來評價硝基還原酶的活力。所用酶標(biāo)儀為MD1900，測定方法為:在50mM PBS (pH8.5)緩沖液195ul中，加純硝基還原酶Iul (5ug)，37°C溫育lOmin，后加 NADPH 或 NADH (IOmM) (Roche) 3ul，底物 Iul (20mM，溶解于 DMS0)，立即振蕩5s后酶標(biāo)儀檢測Imin內(nèi)340nm吸光值的變化。酶活力單位定義為:在上述條件下，每分鐘消耗Imol NADPH為一個酶活力單位。
[0043]結(jié)果顯示gOX0834只在以NADPH為輔酶時，才對一系列芳香族硝基化合物表現(xiàn)還原活性；而以NADH為輔酶，則沒有酶活。
[0044]其中底物及針對不同底物硝基還原酶比活力如下表所示:
[0045]表2
【權(quán)利要求】
1.一種硝基還原酶在芳香族硝基化合物降解還原中的應(yīng)用，其特征在于，所述硝基還原酶具有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸殘基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述硝基還原酶編碼基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芳香族硝基化合物包括:硝基苯甲醛類，硝基甲苯類，硝基苯胺類，硝基酚類，硝基呋喃類，硝基苯類。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芳香族硝基化合物還包括抗癌前藥CB1954。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述硝基還原酶以NADPH為輔酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述硝基還原酶的輔因子是FMN。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述硝基還原酶在30°C~70°C溫度范圍內(nèi)保持最高酶活50%以上的酶活。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述硝基還原酶的最適溫度是60°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述硝基還原酶在pH6~9.5范圍內(nèi)保持最高酶活50%以上的酶活。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述硝基還原酶的最適pH是8.5。
【文檔編號】C12P17/04GK103642861SQ201310627211
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】林金萍, 魏東芝, 楊圓圓 申請人:華東理工大學(xué)