一種檢測hiv-1對酶抑制劑抗性的基因芯片及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測HIV-1對逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑抗性的基因芯片及試劑盒。本發(fā)明公開的一組寡核苷酸探針的序列如SEQ?ID?No.1-SEQ?ID?No.126所示。本發(fā)明的基因芯片和試劑盒可同時檢測中國境內的HIV-1對逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑是否耐藥及耐藥程度，該基因芯片和試劑盒操作簡便、準確性高、通量大、耗時短，為協(xié)助臨床及時掌握HIV的治療效果并制定治療方案提供參考。
【專利說明】—種檢測HIV-1對酶抑制劑抗性的基因芯片及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測Hiv-1對逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑抗性的基因芯片及試劑盒。
【背景技術】
[0002]獲得性免疫缺陷綜合癥(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS),俗稱艾滋病，是以人類某些種類淋巴細胞為宿主的HIV引起的一種傳染病。HIV感染后會破壞易感淋巴細胞，使患者免疫系統(tǒng)功能減弱，致使對其它細菌、病毒及腫瘤喪失抵抗力，最終由于感染或腫瘤導致患者死亡。自1985年中國發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病人以來，我國艾滋病感染人數逐年上升，中國疾病預防控制中心艾滋病預防控制中心數據顯示，中國累計報告艾滋病病毒感染者和病人43.4萬，其中死亡8.8萬。據聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署、世界衛(wèi)生組織和衛(wèi)生部聯(lián)合專家組評估，截止2011年年底，估計中國艾滋病感染者和病人78萬，其中存活艾滋病病人15.4萬，當年新感染4.8萬，死亡2.8萬。
[0003]HIV屬于逆轉錄病毒科(Retroviridae),慢病毒屬(Lentivirus)。全球流行的HIV根據血清型和病毒核酸序列分類可分為HIV-1和HIV-2兩型。HIV顆粒直徑約120nm，大致呈球形。HIV外膜是類脂包膜，并嵌有病毒蛋白gpl20和gp41，內部由病毒蛋白pl7形成的球形基質(Matrix)及p24形成的半錐形衣殼(Capsid),衣殼內部包含有病毒的基因組和逆轉錄酶、整合酶和蛋白酶及其它成分。HIV的基因組為兩條相同的正鏈RNA，每條長約9.2-9.8kb,編碼至少9個蛋白，兩端是長末端重復序列(long terminal repeats),含有順式調控序列，控制前病毒的表達?；蚪M中的Pol基因編碼聚合酶前體蛋白，聚合酶前體蛋白經切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉錄酶、核糖核酸酶H，這些酶均為病毒增殖所必需。
[0004]抗HIV藥物是目前唯一延緩艾滋病疾病進展以及降低艾滋病死亡率的有效治療手段。在抗HIV藥物的開發(fā)過程中，逆轉錄酶最先成為抗病毒的靶點。目前已有多種逆轉錄酶抑制劑應用于臨床治療，主要分為兩類，核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTIs)和非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)。其中NRTIs是最先問世的一類藥物，臨床證實對HIV復制具有很強的抑制作用，其結構與核苷類似，為雙脫氧核苷衍生物，可與細胞內核苷競爭性地結合逆轉錄酶，從而終止逆轉錄反應；NNRTIs是一類通過與HIV逆轉錄酶聚合位點附近的疏水結合口袋結合而發(fā)生作用的藥物小分子，通過這種結合終止逆轉錄反應。隨著抗HIV藥物的發(fā)展，蛋白酶抑制劑也發(fā)展起來。蛋白酶主要作用是將病毒復制中產生的前體蛋白裂解，成為有活性的病毒結構蛋白和有活性的酶。蛋白酶抑制劑屬于多肽類化合物，可競爭性或非競爭性地抑制蛋白酶活性，導致蛋白前體不能裂解和形成成熟的病毒顆粒。
[0005]隨著抗艾滋病毒藥物的廣泛應用，隨之而來的耐藥問題已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。如果耐藥毒株一旦形成，在發(fā)展中國家缺乏二線藥物的現(xiàn)實基礎上，意味著被拯救的生命再次陷入死亡的境地，多年來抗病毒治療來之不易的成果將毀于一旦。中國自2003年開始在全國范圍內實施免費的抗艾滋病病毒治療，到2010年10月底接受治療人數已超過10萬人，但接受耐藥檢測的尚不足萬人，大量即將或正在接受抗病毒治療的感染者迫切需要及時準確的耐藥檢測。耐藥檢測對于感染者個體而言，可以適時地調整用藥方案，收到最優(yōu)治療效果，避免承受不必要的副作用。對于艾滋病防治的大局而言，及早發(fā)現(xiàn)耐藥株并及時調整用藥方案，將大大減少耐藥株的傳播幾率，一方面減少耐藥株傳播造成缺少可用的藥物的情況發(fā)生，一方面可使有限的醫(yī)療資源更合理地配置，減少浪費。可見，及時準確地檢測耐藥發(fā)生情況，是實現(xiàn)艾滋病可持續(xù)性治療的關鍵問題。
[0006]現(xiàn)有HIV耐藥檢測技術分為兩大類。
[0007]第一類是表型耐藥檢測，經典的表型耐藥檢測方法需要分離病毒，一般需要8-12周時間，重復性差，不適合臨床應用。改進后的重組病毒表型耐藥檢測方法能直接測出HIV-1對藥物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉耐藥的情況，檢測需2-3周，但是對環(huán)境及人員要求高，且非常昂貴。
[0008]第二類是基因型耐藥檢測，是通過分子生物學方法擴增病人HIV-1藥物靶點周圍基因，以基因測序和序列分析技術或雜交技術確定病毒變異位點，與大型數據庫中已知的耐藥基因變異數據相比較，間接地估計耐藥與否及耐藥程度。其中DNA序列分析是最精確的方法，但耗時約I周，檢測通量小，對環(huán)境及人員要求高，分析基因型耐藥結果時，需要掌握大量相關知識，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的交叉耐藥等，才能對結果進行正確的評價。
[0009]基因芯片是指將許多特定的寡核苷酸片段作為探針，以原位合成法或合成點樣法有規(guī)律地排列固定在支持物表面，形成DNA探針微陣列，然后將標記的樣品與DNA探針微陣列雜交，按照堿基配對原理，最匹配的探針將結合最多的標記物，獲得最強的檢測信號。以玻璃為固相載體支持物，以熒光基團為標記物的樣品信號可以適應自動化的檢測系統(tǒng)，進行自動分析?；蛐酒夹g可實現(xiàn)對生物樣品快速、高通量地檢測，并可使用自動化的檢測系統(tǒng)?，F(xiàn)有的基因芯片僅針對逆轉錄酶耐藥性進行分析，并且由于HIV復制過程中的高突變性，核酸序列多態(tài)性明顯 ，致使大量探針結合程度低，信號無法識別，臨床適用性不強。
[0010]目前艾滋病治療最為 有效的辦法是雞尾酒療法，通常會從核苷類逆轉錄酶抑制劑、非核苷類逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑中選擇幾種組合使用，而對于不同類的藥物都需要做出耐藥分析后才能夠制定藥物的組合，以便能夠達到最好的治療效果。為適應艾滋病抗病毒治療的現(xiàn)狀，開發(fā)一種能同時覆蓋逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑耐藥性檢測的基因芯片成為亟待解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一種檢測Hiv-1對逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑抗性的基因芯片及試劑盒。
[0012]本發(fā)明提供的一組寡核苷酸探針，該組寡核苷酸探針的序列如SEQ ID N0.1-SEQID N0.126 所示；
[0013]所述SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶_10_L野生型位點；
[0014]所述SEQ ID N0.5所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶_46_11野生型位
占.[0015]所述SEQ ID N0.6所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶M46I突變型位點；[0016]所述SEQ ID N0.7所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶M46L突變型位點；
[0017]所述SEQ ID N0.8所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶LlOR突變型位點；
[0018]所述SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶_63_L野生型位點；
[0019]所述SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.16所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶L63P突變型位點；
[0020]所述SEQ ID N0.13所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶_82_V野生型位
占.[0021]所述SEQ ID N0.14所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶V82I突變型位
占.[0022]所述SEQ ID N0.15所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶V82T突變型位
占.[0023]所述SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.21所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶_84_1野生型位點；
[0024]所述SEQ ID N0.18和SEQ ID N0.22所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶I84V突變型位點；
[0025]所述SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.23所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶_90_L野生型位點；
[0026]所述SEQ ID N0.20和SEQ ID N0.24所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶L90M突變型位點；
[0027]所述HIV-1蛋白酶的野生型位點為不耐HIV-1蛋白酶抑制劑的位點；
[0028]所述HIV-1蛋白酶的突變型位點為耐HIV-1蛋白酶抑制劑的位點；
[0029]所述SEQ ID N0.25和SEQ ID N0.29所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_41_11野生型位點；
[0030]所述SEQ ID N0.26,SEQ ID N0.27、SEQ ID N0.30 和 SEQ ID N0.31 所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶M41L突變型位點；
[0031]所述SEQ ID N0.28和SEQ ID N0.36所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_65_K野生型位點；
[0032]所述SEQ ID N0.32和SEQ ID N0.40所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶K65R突變型位點；
[0033]所述SEQ ID N0.33和SEQ ID N0.34所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_62_Α野生型位點；
[0034]所述SEQ ID N0.35所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶A62V突變型位
占.[0035]所述SEQ ID N0.37、SEQ ID N0.38、SEQ ID N0.41 和 SEQ ID N0.42 所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_67_D野生型位點；
[0036]所述SEQ ID N0.39和SEQ ID N0.43所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶D67N突變型位點；
·[0037]所述SEQ ID N0.44所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_75_V野生型位點；
[0038]所述SEQ ID N0.45和SEQ ID N0.46所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_74_L野生型位點；
[0039]所述SEQ ID N0.47所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶L74V突變型位
占.[0040]所述SEQ ID N0.48所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶V75I突變型位
占.[0041]所述SEQ ID N0.49、SEQ ID N0.52和SEQ ID N0.53所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_103_K野生型位點；
[0042]所述SEQ ID N0.50和SEQ ID N0.54所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶Κ103Ν突變型位點；
[0043]所述SEQ ID N0.51和SEQ ID N0.55所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶K103S突變型位點；
[0044]所述SEQ ID N0.56、SEQ ID N0.60所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_70J(野生型位點；
[0045]所述SEQ ID N0.57和SEQ ID N0.61所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶K70R突變型位點；
[0046]所述SEQ ID N0.58、SEQ ID N0.59、SEQ ID N0.63 和 SEQ ID N0.65 所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶KlOlE突變型位點；
[0047]所述SEQ ID N0.62和SEQ ID N0.64所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_101_1(野生型位點；
[0048]所述SEQ ID N0.66和SEQ ID N0.70所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_106_￥野生型位點；
[0049]所述SEQ ID N0.67和SEQ ID N0.71所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶V106I突變型位點；
[0050]所述SEQ ID N0.68和SEQ ID N0.72所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶V106A突變型位點；
[0051]所述SEQ ID N0.69所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_151_Q野生型位點；
[0052]所述SEQ ID N0.73所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶Q151M突變型位點；
[0053]所述SEQ ID N0.74、SEQ ID N0.75和SEQ ID N0.76所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_108_V野生型位點；
[0054]所述SEQ ID N0.77所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶V108I突變型位點；`
[0055]所述SEQ ID N0.78和SEQ ID N0.82所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_116_?野生型位點；
[0056]所述SEQ ID N0.79和SEQ ID N0.83所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶F116Y突變型位點；[0057]所述SEQ ID N0.80和SEQ ID N0.84所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_181_￥野生型位點；
[0058]所述SEQ ID N0.81和SEQ ID N0.85所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶Y181C突變型位點；
[0059]所述SEQ ID N0.86和SEQ ID N0.90所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_184_11野生型位點；
[0060]所述SEQ ID N0.87和SEQ ID N0.91所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶M184V突變型位點；
[0061]所述SEQ ID N0.88和SEQ ID N0.92所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶M184I突變型位點；
[0062]所述SEQ ID N0.89和SEQ ID N0.93所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_190_6野生型位點；
[0063]所述SEQ ID N0.94和SEQ ID N0.98所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_188_￥野生型位點；
[0064]所述SEQ ID N0.95、SEQ ID N0.96、SEQ ID N0.99 和 SEQ ID N0.100 所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶Y188L突變型位點；
[0065]所述SEQ ID N0.97所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶G190A突變型位點；
[0066]所述SEQ ID N0.101所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶G190S突變型位點；
[0067]所述SEQ ID N0.102、SEQ ID N0.103、SEQ ID N0.104、SEQ ID N0.106SEQ IDN0.107和SEQ ID N0.108所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_210_L野生型位
占.[0068]所述SEQ ID N0.105和SEQ ID N0.109所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶L210W突變型位點；
[0069]所述SEQ ID N0.110和SEQ ID N0.111所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_215_T野生型位點；
[0070]所述SEQ ID N0.112所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶Τ215Υ突變型位點；
[0071]所述SEQ ID N0.113所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶T215F突變型位點；
[0072]所述SEQ ID N0.114和SEQ ID N0.115所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_179_V野生型位點；
[0073]所述SEQ ID N0.116所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶V179D突變型位點；
[0074]所述SEQ ID N0.117所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_219_K野生型位點；
[0075]所述SEQ ID N0.118所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶K219Q突變型位點；[0076]所述SEQ ID N0.119所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶K219E突變型位點；[0077]所述SEQ ID N0.120所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_221_H野生型位點；
[0078]所述SEQ ID N0.121和SEQ ID N0.122所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_227_F野生型位點；
[0079]所述SEQ ID N0.123所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶F227L突變型位點；
[0080]所述SEQ ID N0.124和SEQ ID N0.126所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶H221Y突變型位點；
[0081]所述SEQ ID N0.125所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_221_H野生型位點；
[0082]所述HIV-1逆轉錄酶的野生型位點為不耐HIV-1逆轉錄酶抑制劑的位點；
[0083]所述HIV-1逆轉錄酶的突變型位點為耐HIV-1逆轉錄酶抑制劑的位點；
[0084]所述野生型位點中，數字代表氨基酸的位置，數字后面的字母表示此位置的氨基酸殘基種類；
[0085]所述突變型位點中，中間的數字代表突變氨基酸的位置，數字前面的字母表示此位置氨基酸突變前的氨基酸殘基種類，數字后面的字母表示此位置氨基酸突變后的氨基酸殘基種類，以HIV-1蛋白酶LlOR突變型位點和HIV-1逆轉錄酶M41L突變型位點為例，LlOR的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突變?yōu)镽，M41L的意思是HIV-1病毒的逆轉錄酶的第41位氨基酸由M突變成L。
[0086]所述寡核苷酸探針大小均為15-50個核苷酸，優(yōu)選15-30個核苷酸。
[0087]上述寡核苷酸探針中，所述寡核苷酸探針的5 ’端用NH2- (T ) η修飾，其中(T ) η表示η個寡聚dT，其中η為10-35，優(yōu)選15-25，具體為20。
[0088]一種用于檢測HIV-1中與逆轉錄酶抑制劑耐藥性和/或蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點的基因芯片也屬于本發(fā)明的保護范圍，該基因芯片包含固相載體和設于固相載體上的探針；
[0089]所述固相載體為硅片、用功能基團修飾的玻片或用功能基團衍生的膜；
[0090]所述功能基團具體為醛基基團；
[0091]所述設于固相載體上的探針包含上述任一所述的寡核苷酸探針組；
[0092]所述耐藥性的相關突變位點如下:L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V、L90M、M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V751、K101E、K103N/S、V106I/A、V1081、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/1、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y 和 F227L ；
[0093]所述L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V 和 L90M 為 HIV-1 蛋白酶中與 HIV-1 蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點；
[0094]所述M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V751、K101E、K103N/S、V106I/A、V1081、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/1、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L為HIV-1逆轉錄酶中與HIV-1逆轉錄酶抑制劑耐藥性相關的突變位點；
[0095]所述突變位點中，中間的數字代表突變氨基酸的位置，數字前面的字母表示此位置氨基酸突變前的氨基酸殘基種類，數字后面的字母表示此位置氨基酸突變后的氨基酸殘基種類，以HIV-1蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點LlOR和HIV-1逆轉錄酶抑制劑耐藥性相關的突變位點M41L為例，LlOR的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突變?yōu)镽，M41L的意思是HIV-1病毒的逆轉錄酶的第41位氨基酸由M突變成L ；
[0096]所述逆轉錄酶抑制劑為HIV-1核苷類逆轉錄酶抑制劑和/或HIV-1非核苷類逆轉錄酶抑制劑。
[0097]上述基因芯片中，所述設于固相載體上的探針還包含表面化學質控探針和雜交質控探針，所述表面化學質控探針如SEQ ID N0.130所示,所述雜交質控探針如SEQ IDN0.131 所示。
[0098]所述表面化學質控探針的5’端用熒光基團-(T) m修飾，3’端被NH2修飾，(T) m表示m個寡聚dT，m為10-35，優(yōu)選15-25，具體為20，熒光基團具體為HEX ；
[0099]所述雜交質控探針的5’端被NH2- (T)k修飾，(T)k表示k個寡聚dT，k為10_35，k具體為20。
[0100]一種用于檢測Hiv-1中與逆轉錄酶抑制劑耐藥性和/或蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍，該試劑盒包含上述任一所述的探針或上述任一所述的基因芯片和引物組； [0101]所述引物組由三條引物組成，其序列分別如SEQ ID N0.127,SEQ ID N0.128和SEQID N0.129 所示；
[0102]所述SEQ ID N0.127 為正向引物，SEQ ID N0.128 和 SEQ ID N0.129 為反向引物;
[0103]所述正向弓丨物在PCR體系中的濃度是上述任一所述反向弓丨物在PCR體系中濃度的2-10倍，具體為8倍；
[0104]所述引物的大小均為15-50個核苷酸，優(yōu)選15-40個核苷酸；
[0105]所述正向引物的5’端用熒光基團標記，熒光基團具體為TAMRA。
[0106]所述耐藥性的相關突變位點如下:L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V、L90M、M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V751、K101E、K103N/S、V106I/A、V1081、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/1、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y 和 F227L ；
[0107]所述L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V 和 L90M 為 HIV-1 蛋白酶中與 HIV-1 蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點；
[0108]所述M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V751、K101E、K103N/S、V106I/A、V1081、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/1、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L為HIV-1逆轉錄酶中與HIV-1逆轉錄酶抑制劑耐藥性相關的突變位點；
[0109]所述突變位點中，中間的數字代表突變氨基酸的位置，數字前面的字母表示此位置氨基酸突變前的氨基酸殘基種類，數字后面的字母表示此位置氨基酸突變后的氨基酸殘基種類，以HIV-1蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點LlOR和HIV-1逆轉錄酶抑制劑耐藥性相關的突變位點M41L為例，LlOR的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突變?yōu)镽，M41L的意思是HIV-1病毒的逆轉錄酶的第41位氨基酸由M突變成L ；
[0110]所述逆轉錄酶抑制劑為Hiv-1核苷類逆轉錄酶抑制劑和/或HIV-1非核苷類逆轉錄酶抑制劑。
[0111]上述試劑盒中，所述試劑盒還包含PCR擴增試劑、雜交緩沖液、芯片洗滌液I以及芯片洗滌液II和產品說明書；
[0112]所述PCR擴增試劑由ddH20、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶組成；
[0113]所述雜交緩沖液由SSC、Denhardt's液、硫酸葡聚糖、十二烷基硫酸鈉、SEQ IDN0.132所示的DNA分子和ddH20組成；
[0114]所述SSC在雜交緩沖液中的濃度為3.33X，Denhardt’ s在雜交緩沖液中的濃度為
8.33 X，硫酸葡聚糖在雜交緩沖液中的濃度為4.17%，十二烷基硫酸鈉在雜交緩沖液中的濃度為0.67%，SEQ ID N0.132所示的DNA分子在雜交緩沖液中的濃度為0.83nM，%代表質量體積百分數g/100ml ； [0115]所述SEQ ID N0.132為SEQ ID N0.131所示的雜交質控探針的靶標序列，該序列的5’端被熒光基團標記，熒光基團具體為TAMRA ；
[0116]所述芯片洗滌液I由SSC、十二烷基硫酸鈉和水組成，SSC在芯片洗滌液I的濃度為2X，十二烷基硫酸鈉在芯片洗滌液I中的濃度為0.2%，％代表質量體積百分數g/100ml ；
[0117]所述芯片洗滌液II由SSC和水組成，SSC在芯片洗滌液II中的濃度為0.2X ;
[0118]產品說明書記載如下內容:所述PCR為不對稱PCR，該PCR反應可分為四個步驟，第一個步驟是95°C變性600s，第二個步驟是由35-45個(優(yōu)選45個)循環(huán)組成，每個循環(huán)由95°C變性30s、55°C退火30s和72°C延伸80s組成，第三個步驟由10-25個(優(yōu)選20個)循環(huán)組成，每個循環(huán)由95°C變性30s和60-80°C (優(yōu)選72°C)延伸80s組成，第四個步驟是60-800C (優(yōu)選 720C )延伸 420s。
[0119]上述任一所述的探針、上述任一所述的基因芯片、上述任一所述試劑盒在制備檢測HIV-1的耐藥性相關的突變位點的產品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0120]上述任一所述的探針、上述任一所述的基因芯片、上述任一所述試劑盒在制備檢測HIV-1對HIV-1逆轉錄酶抑制劑耐藥性和/或HIV-1蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點的產品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0121]上述任一所述的應用中，所述耐藥性相關的突變位點如下:L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V、L90M、M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V751、K101E、K103N/S、V106I/A、V1081、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/1、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y 和 F227L ；
[0122]所述L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V 和 L90M 為 HIV-1 蛋白酶中與 HIV-1 蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點；
[0123]所述M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V751、K101E、K103N/S、V106I/A、V1081、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/1、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L為HIV-1逆轉錄酶中HIV-1逆轉錄酶抑制劑耐藥性相關的突變位點；
[0124]所述突變位點中，中間的數字代表突變氨基酸的位置，數字前面的字母表示此位置氨基酸突變前的氨基酸殘基種類，數字后面的字母表示此位置氨基酸突變后的氨基酸殘基種類，以HIV-1蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點LlOR和HIV-1逆轉錄酶抑制劑耐藥性相關的突變位點M41L為例，LlOR的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突變?yōu)镽，M41L的意思是HIV-1病毒的逆轉錄酶的第41位氨基酸由M突變成L。
[0125]上述任一所述的應用中，所述逆轉錄酶抑制劑為HIV-1核苷類逆轉錄酶抑制劑和/或HIV-1非核苷類逆轉錄酶抑制劑。
[0126]本發(fā)明的基因芯片將HIV-1逆轉錄酶和蛋白酶基因同時作為檢測突變位點的區(qū)域，通過PCR擴增的樣品目的片段與探針雜交的信號強弱來判定病毒基因組中是否存在某種耐藥相關位點突變，并且通過在寡核苷酸探針上引入連續(xù)簡并堿基，增強了探針對非檢測位點堿基多態(tài)性的耐受性。本發(fā)明的基因芯片和試劑盒可同時檢測中國境內的HIV-1對逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑是否耐藥及耐藥程度，該基因芯片和試劑盒操作簡便、準確性高、通量大、耗時短，為協(xié)助臨床及時掌握HIV的治療效果并制定治療方案提供參考。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0127]圖1為基因芯片、點陣位置及點陣中探針排列示意圖。
[0128]圖2為81份臨床樣本各檢測位點的總檢測成功率。
[0129]圖3為發(fā)生耐藥性突變的病毒株的基因芯片檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0130]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0131 ] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0132]一、寡核苷酸探針的合成
[0133](一)針對HIV-1逆轉錄酶23個耐藥性相關的氨基酸殘基的29種突變類型和蛋白酶6個耐藥性相關的氨基酸殘基的8種突變類型，設計了包括全部野生型位點的核苷酸序列以及突變型位點的核苷酸序列共126條寡核苷酸探針，如表1所示。
[0134]表1寡核苷酸探針
`[0135]
【權利要求】
1.一組寡核苷酸探針，該組寡核苷酸探針的序列如SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.126所示；所述SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶_10_L野生型位點； 所述SEQ ID N0.5所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶_46_M野生型位點； 所述SEQ ID N0.6所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶M46I突變型位點； 所述SEQ ID N0.7所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶M46L突變型位點； 所述SEQ ID N0.8所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶LlOR突變型位點； 所述SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶_63_ L野生型位點； 所述SEQ ID N0.1U SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.16所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶L63P突變型位點；所述SEQ ID N0.13所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶_82_V野生型位點；所述SEQ ID N0.14所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶V82I突變型位點；所述SEQ ID N0.15所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶V82T突變型位點；所述SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.21所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶_84_I野生型位點； 所述SEQ ID N0.18和SEQ ID N0.22所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶I84V突變型位點； 所述SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.23所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶_90_L野生型位點； 所述SEQ ID N0.20和SEQ ID N0.24所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1蛋白酶L90M突變型位點； 所述HIV-1蛋白酶的野生型位 點為不耐HIV-1蛋白酶抑制劑的位點； 所述HIV-1蛋白酶的突變型位點為耐HIV-1蛋白酶抑制劑的位點； 所述SEQ ID N0.25和SEQ ID N0.29所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_41_M野生型位點； 所述 SEQ ID N0.26,SEQ ID N0.27、SEQ ID N0.30 和 SEQ ID N0.31 所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶M41L突變型位點； 所述SEQ ID N0.28和SEQ ID N0.36所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_65J(野生型位點； 所述SEQ ID N0.32和SEQ ID N0.40所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶K65R突變型位點； 所述SEQ ID N0.33和SEQ ID N0.34所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_62_A野生型位點； 所述SEQ ID N0.35所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶A62V突變型位點；所述 SEQ ID N0.37,SEQ ID N0.38、SEQ ID N0.41 和 SEQ ID N0.42 所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_67_0野生型位點； 所述SEQ ID N0.39和SEQ ID N0.43所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶D67N突變型位點；所述SEQ ID N0.44所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_75)野生型位點；所述SEQ ID N0.45和SEQ ID N0.46所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_74_L野生型位點； 所述SEQ ID N0.47所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶L74V突變型位點；所述SEQ ID N0.48所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶V75I突變型位點；所述SEQ ID N0.49、SEQ ID N0.52和SEQ ID N0.53所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_103_K野生型位點； 所述SEQ ID N0.50和SEQ ID N0.54所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶Κ103Ν突變型位點； 所述SEQ ID N0.51和SEQ ID N0.55所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶K103S突變型位點； 所述SEQ ID N0.56,SEQ ID N0.60所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_70_K野生型位點； 所述SEQ ID N0.57和SEQ ID N0.61所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶K70R突變型位點； 所述 SEQ ID N0.58,SEQ ID N0.59、SEQ ID N0.63 和 SEQ ID N0.65 所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶KlOlE突變型位點； 所述SEQ ID N0.62和SEQ ID N0.64所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_101J(野生型位點； 所述SEQ ID N0.66和S`EQ ID N0.70所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_106_V野生型位點； 所述SEQ ID N0.67和SEQ ID N0.71所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶V1061突變型位點； 所述SEQ ID N0.68和SEQ ID N0.72所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶V106A突變型位點； 所述SEQ ID N0.69所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_151_Q野生型位占.所述SEQ ID N0.73所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶Q151M突變型位點；所述SEQ ID N0.74、SEQ ID N0.75和SEQ ID N0.76所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_108_V野生型位點； 所述SEQ ID N0.77所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶V108I突變型位點；所述SEQ ID N0.78和SEQ ID N0.82所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_116_F野生型位點； 所述SEQ ID N0.79和SEQ ID N0.83所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶F116Y突變型位點； 所述SEQ ID N0.80和SEQ ID N0.84所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_181_Y野生型位點； 所述SEQ ID N0.81和SEQ ID N0.85所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶Y181C突變型位點；所述SEQ ID N0.86和SEQ ID N0.90所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_184_M野生型位點； 所述SEQ ID N0.87和SEQ ID N0.91所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶M184V突變型位點； 所述SEQ ID N0.88和SEQ ID N0.92所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶M184I突變型位點； 所述SEQ ID N0.89和SEQ ID N0.93所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_190_G野生型位點； 所述SEQ ID N0.94和SEQ ID N0.98所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_188_Y野生型位點； 所述 SEQ ID N0.95、SEQ ID N0.96、SEQ ID N0.99 和 SEQ ID N0.100 所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶Y188L突變型位點； 所述SEQ ID N0.97所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶G190A突變型位點； 所述SEQ ID N0.101所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶G190S突變型位占.所述 SEQ ID N0.102、SEQ ID N0.103、SEQ ID N0.104、SEQ ID N0.106SEQ ID N0.107和SEQ ID N0.108所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_210_L野生型位點；所述SEQ ID N0.105和SEQ ID N0.109所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶L210W突變型位點； 所述SEQ ID N0.110和SEQ ID N0.111所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_215_T野生型位點； 所述SEQ ID N0.112所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶Τ215Υ突變型位占.所述SEQ ID N0.113所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶T215F突變型位占.所述SEQ ID N0.114和SEQ ID N0.115所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_179_V野生型位點； 所述SEQ ID N0.116所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶V179D突變型位占.所述SEQ ID N0.117所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_219_K野生型位占.所述SEQ ID N0.118所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶K219Q突變型位占.所述SEQ ID N0.119所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶Κ219Ε突變型位占.所述SEQ ID N0.120所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_221_Η野生型位占.所述SEQ ID N0.121和SEQ ID N0.122所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_227_F野生型位點；所述SEQ ID N0.123所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶F227L突變型位占.所述SEQ ID N0.124和SEQ ID N0.126所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶H221Y突變型位點； 所述SEQ ID N0.125所示的寡核苷酸探針序列檢測HIV-1逆轉錄酶_221_H野生型位占.所述HIV-1逆轉錄酶的野生型位點為不耐HIV-1逆轉錄酶抑制劑的位點； 所述HIV-1逆轉錄酶的突變型位點為耐HIV-1逆轉錄酶抑制劑的位點； 所述野生型位點中，數字代表氨基酸的位置，數字后面的字母表示此位置的氨基酸殘基種類； 所述突變型位點中，中間的數字代表突變氨基酸的位置，數字前面的字母表示此位置氨基酸突變前的氨基酸殘基種類，數字后面的字母表示此位置氨基酸突變后的氨基酸殘基種類，以HIV-1蛋白酶LlOR突變型位點和HIV-1逆轉錄酶M41L突變型位點為例，LlOR的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突變?yōu)镽，M41L的意思是HIV-1病毒的逆轉錄酶的第41位氨基酸由M突變成L。
2.根據權利要求1所述的探針，其特征在于:所述寡核苷酸探針的5’端用NH2-(T) η修飾，其中(T) η表示η個寡聚dT，其中η為10-35，優(yōu)選15-25，具體為20。
3.一種用于檢測HIV-1中與逆轉錄酶抑制劑耐藥性和/或蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點的基因芯片，該基因芯片包含固相載體和設于固相載體上的探針； 所述固相載體為硅片、用功能基團修飾的玻片或用功能基團衍生的膜； 所述功能基團具體為醛基基團； 所述設于固相載體上的探針包含權利要求1或2所述的寡核苷酸探針。
4.根據權利要求3所述的基因芯片，其特征在于:所述設于固相載體上的探針還包含表面化學質控探針和雜交質控探針，所述表面化學質控探針如SEQ ID N0.130所示，所述雜交質控探針如SEQ ID N0.131所示； 所述表面化學質控探針的5’端用熒光基團-(T) m修飾，3’端被NH2修飾，(T) m表示m個寡聚dT，m為10-35，優(yōu)選15-25，具體為20，所述熒光基團具體為HEX ； 所述雜交質控探針的5’端被NH2- (T) k修飾，(T) k表示k個寡聚dT，k為10-35，k具體為20。
5.一種用于檢測HIV-1中與逆轉錄酶抑制劑耐藥性和/或蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點的試劑盒，該試劑盒包含權利要求1或2所述的探針和/或權利要求3或4所述的基因芯片和引物組； 所述引物組由三條引物組成，其序列分別如SEQ ID N0.127,SEQ ID N0.128和SEQ IDN0.129 所示； 所述SEQ ID N0.127為正向引物，SEQ ID N0.128和SEQ ID N0.129為反向引物； 所述正向引物的5’端用熒光基團標記。
6.根據權利要求5所述的 試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包含PCR擴增試劑、雜交緩沖液、芯片洗滌液I以及芯片洗滌液II和產品說明書； 所述PCR擴增試劑由ddH20、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶組成；所述雜交緩沖液由SSC、Denhardt’s溶液、硫酸葡聚糖、十二烷基硫酸鈉、SEQ IDN0.132所示的DNA分子和ddH20組成； 所述SSC在雜交緩沖液中的濃度為3.33X，Denhardt's在雜交緩沖液中的濃度為.8.33 X，硫酸葡聚糖在雜交緩沖液中的濃度為4.17%，十二烷基硫酸鈉在雜交緩沖液中的濃度為0.67%，SEQ ID N0.132所示的DNA分子在雜交緩沖液中的濃度為0.83nM，%代表質量體積百分數g/100ml ； 所述SEQ ID N0.132為SEQ ID N0.131所示的雜交質控探針的靶標序列； 所述雜交質控探針的祀標序列的5’端被突光基團標記，突光基團具體為TAMRA ； 所述芯片洗滌液I由SSC、十二烷基硫酸鈉和水組成，SSC在芯片洗滌液I的濃度為2X，十二烷基硫酸鈉在芯片洗滌液I中的濃度為0.2%，％代表質量體積百分數g/100ml ；所述芯片洗滌液II由SSC和水組成，SSC在芯片洗滌液II中的濃度為0.2X ； 產品說明書記載如下內容:所述PCR為不對稱PCR，該PCR反應可分為四個步驟，第一個步驟是95°C變性600s，第二個步驟是由45個循環(huán)組成，每個循環(huán)由95°C變性30s、55°C退火30s和72°C延伸80s組成，第三個步驟由20個循環(huán)組成，每個循環(huán)由95°C變性30s和.72°C延伸80s組成，第四個步驟是72°C延伸420s。
7.權利要求1或2所述的探針、權利要求3或4所述的基因芯片、權利要求5或6所述的試劑盒在制備檢測HIV-1的耐藥性相關的突變位點的產品中的應用。
8.權利要求1或2所述的探針、權利要求3或4所述的基因芯片、權利要求5或6所述的試劑盒在制備檢測HIV-1對HIV-1逆轉錄酶抑制劑耐藥性和/或HIV-1蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點的產品中的應用。
9.根據權利要求7或8所述的應用，其特征在于:所述耐藥性相關的突變位點如下:L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V、L90M、M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V751、K101E、K103N/S、V106I/A、V1081、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/1、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y 和 F227L ； 所述 L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V 和 L90M 為 HIV-1 蛋白酶中與 HIV-1 蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點；
所述 M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V751、K101E、K103N/S、V106I/A、V1081、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/1、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y 和 F227L為HIV-1逆轉錄酶中與HIV-1逆轉錄酶抑制劑耐藥性相關的突變位點； 所述突變位點中，中間的數字代表突變氨基酸的位置，數字前面的字母表示此位置氨基酸突變前的氨基酸殘基種類，數字后面的字母表示此位置氨基酸突變后的氨基酸殘基種類，以HIV-1蛋白酶抑制劑耐藥性相關的突變位點LlOR和HIV-1逆轉錄酶抑制劑耐藥性相關的突變位點M41L為例，LlOR的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突變?yōu)镽，M41L的意思是HIV-1病毒的逆轉錄酶的第41位氨基酸由M突變成L。
10.根據權利要求7-9任一所述的應用，其特征在于:所述逆轉錄酶抑制劑為HIV-1核苷類逆轉錄酶抑制劑和/或HIV-1非核苷類逆轉錄酶抑制劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667465SQ201310627516
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權日:2013年11月29日
【發(fā)明者】劉瑩瑩, 蔣迪, 項光新, 尚紅, 韓曉旭, 趙彬, 邢婉麗 申請人:博奧生物有限公司, 清華大學, 中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院