一種人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株、其制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2013年11月26日，保藏編號(hào)為CGMCC?No.8510。本發(fā)明的人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株對(duì)白蛋白結(jié)合型紫杉醇和其它多種化療藥物如紫杉醇、多烯紫杉醇及阿霉素均具有明顯耐藥性，對(duì)白蛋白結(jié)合型紫杉醇的耐藥指數(shù)達(dá)100以上；可用于構(gòu)建體內(nèi)、外腫瘤耐藥模型，從而深入研究多藥耐藥機(jī)制，甚至發(fā)現(xiàn)其他新的耐藥機(jī)制，并進(jìn)一步篩選新的抗腫瘤藥物、開發(fā)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)藥物、研發(fā)更加有效的腫瘤治療方法，具有較高的科研和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，預(yù)期能產(chǎn)生良好的科研、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
【專利說明】一種人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株、其制備方法及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株、其制備方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病之一，其死亡率僅次于心腦血管疾病。其中肺癌是當(dāng)今世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，己成為人類因癌癥死亡的主要原因。肺癌按組織病理學(xué)分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌最常見的一種病理類型,約占原發(fā)性肺癌的70%-80%，其總的5年生存率為8%-11%。大多數(shù)肺癌患者就診時(shí)屬中晚期，已錯(cuò)過了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)；即使成功進(jìn)行了肺癌根治術(shù)，術(shù)后患者仍面臨著復(fù)發(fā)的可能，此時(shí)化療成為治療的主要手段。然而，原發(fā)或繼發(fā)耐藥性的發(fā)生，常常導(dǎo)致肺癌化療的失敗，給臨床治療帶來極大的困擾。據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)調(diào)查:90%以上的腫瘤患者的死亡在不同程度上與腫瘤耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。因此，進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制，提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，已成為腫瘤治療亟待解決的問題，亦是目前腫瘤研究的難點(diǎn)及熱點(diǎn)領(lǐng)域。
[0003]近年來，腫瘤耐藥細(xì)胞株已經(jīng)成為研究耐藥機(jī)制的重要工具，已有大量的研究利用它來揭示腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制、研究腫瘤細(xì)胞的耐藥性逆轉(zhuǎn)、開發(fā)及評(píng)價(jià)新的抗癌方法等。因此，建立腫瘤耐藥細(xì)胞株具有重要應(yīng)用價(jià)值。
[0004]腫瘤耐藥細(xì)胞株的建立主要有基因轉(zhuǎn)染法和藥物篩選法，前者所建立的耐藥細(xì)胞株耐藥機(jī)制較為單一，適用于藥物靶點(diǎn)的篩選研究；藥物篩選法是進(jìn)行體外藥物篩選腫瘤細(xì)胞多藥耐藥模型的常用方法，具體分為兩種，一是逐步增加藥物濃度、持續(xù)誘導(dǎo)法，二是大劑量沖擊間斷給藥法。國內(nèi)外均有研究對(duì)這兩種方法進(jìn)行了比較，認(rèn)為不同誘導(dǎo)方式可能獲得不同耐藥機(jī)理的耐藥細(xì)胞`株，同時(shí)也可能影響腫瘤細(xì)胞耐藥程度，持續(xù)誘導(dǎo)比沖擊誘導(dǎo)更易產(chǎn)生耐藥性。持續(xù)誘導(dǎo)法以腫瘤細(xì)胞最終能在特定濃度化療藥物中穩(wěn)定生長作為誘導(dǎo)成功的判定標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞耐藥性穩(wěn)定、直觀。
[0005]白蛋白結(jié)合型紫杉醇(Abraxane)是美國FDA批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療的注射用紫杉醇，是全球首個(gè)獲批的無溶劑型紫杉類化療藥物，通過利用腫瘤攝取營養(yǎng)的生物機(jī)制和納米微粒白蛋白結(jié)合技術(shù)平臺(tái)，使藥物高濃度地聚集在腫瘤組織內(nèi)并發(fā)揮高效抗腫瘤作用。在2012年，美國FDA又批準(zhǔn)Abraxane用于治療非小細(xì)胞肺癌，因此有必要建立肺癌對(duì)Abraxane的耐藥細(xì)胞株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提出一種人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株、其制備方法及用途；本發(fā)明的人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株除對(duì)白蛋白結(jié)合型紫杉醇(Abr axane )耐藥外,對(duì)其它化療藥物如紫杉醇(PTX)、多烯紫杉醇(DTX)、阿霉素(DOX)等有明顯的交叉耐藥；其對(duì)Abraxane的耐藥指數(shù)為100以上，可用于構(gòu)建體內(nèi)、外腫瘤耐藥模型，以及用于篩選新的抗腫瘤藥物。
[0007]為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]第一方面，本發(fā)明提供了一種人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株(簡稱A549/Abr)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2013年11月26日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8510。
[0009]對(duì)本發(fā)明所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及生物特性鑒定發(fā)現(xiàn)，與普通人肺腺癌細(xì)胞株A549相比，本發(fā)明所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株具有以下不同:細(xì)胞較小，形態(tài)不規(guī)則，多核細(xì)胞更常見；生長速度明顯減慢。
[0010]本發(fā)明所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株對(duì)白蛋白結(jié)合型紫杉醇(Abraxane)、紫杉醇、多烯紫杉醇以及阿霉素均具有明顯的耐藥性。檢測發(fā)現(xiàn)，所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株除對(duì)Abraxane耐藥外，對(duì)其他化療藥物如紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素有明顯的交叉耐藥。
[0011]本發(fā)明所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株對(duì)Abraxane的耐藥指數(shù)(RI)為100以上。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株對(duì)Abraxane的耐藥指數(shù)為118.76。
[0012]第二方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株的制備方法，該制備方法包括如下步驟:
[0013](I)將人肺腺癌細(xì)胞株A549在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，加入白蛋白結(jié)合型紫杉醇至紫杉醇有效濃度為IOnM ；
[0014](2)逐步增加白蛋白結(jié)合型紫杉醇的濃度，維持藥物濃度至細(xì)胞能在該濃度穩(wěn)定生長、傳代；
[0015](3)重復(fù)步驟(2)，直到獲得能`在紫杉醇有效濃度為400nM的含白蛋白結(jié)合型紫杉醇的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長、傳代及復(fù)蘇的人肺腺癌細(xì)胞株，即為所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株。
[0016]上述制備方法中，優(yōu)選地，步驟(1)中，所述生長培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基；
[0017]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)為在37°C、CO2濃度為5%的環(huán)境中培養(yǎng)。
[0018]優(yōu)選地，步驟(2)中，所述逐步增加白蛋白結(jié)合型紫杉醇的濃度的過程為:
[0019]早期，以每次增加IOnM紫杉醇有效濃度的方式，增加白蛋白結(jié)合型紫杉醇的濃度；待紫杉醇有效濃度增加至IOOnM時(shí)，以每次增加20nM紫杉醇有效濃度的方式，增加白蛋白結(jié)合型紫杉醇的濃度；待紫杉醇有效濃度增加至200nM時(shí)，以每次增加40nM紫杉醇有效濃度的方式，增加白蛋白結(jié)合型紫杉醇的濃度。
[0020]具體地，本發(fā)明的人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株是按以下步驟建立的:
[0021](I)人肺腺癌細(xì)胞株A549，復(fù)蘇后用含10%胎牛血清、青霉素100U/mL、鏈霉素100 μ g/mL的DMEM培養(yǎng)基于37°C、CO2濃度為5%的環(huán)境中培養(yǎng)；
[0022](2)取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞，換新鮮培養(yǎng)液，加入Abraxane，使其作用濃度(即紫杉醇有效濃度，下同)為ΙΟηΜ，在37°C、5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)，適時(shí)換液，維持IOnM藥物濃度直至存活細(xì)胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；
[0023](3)適當(dāng)增加Abraxane的作用濃度,在37°C、5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng),適時(shí)換液,維持藥物濃度直至存活細(xì)胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；[0024](4)重復(fù)步驟(3)直到獲得能在400nM Abraxane中穩(wěn)定生長、傳代及復(fù)蘇的細(xì)胞株，即為所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株。
[0025]在誘導(dǎo)過程中，掌握適當(dāng)?shù)腁braxane濃度增加幅度是非常重要的，理想狀況是既能通過增加藥物濃度篩選出少數(shù)耐藥細(xì)胞又不至于使全部細(xì)胞死亡，從而不斷獲得耐藥性增強(qiáng)的A549細(xì)胞。
[0026]發(fā)明人通過大量地探索發(fā)現(xiàn)，采用早期每階段增加ΙΟηΜ，待藥物作用濃度增加到IOOnM每階段增加20nM，待藥物作用濃度增加到200nM每階段增加40nM的方案取得了較好的效果，并歷時(shí)6個(gè)月建立了本發(fā)明的人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株。
[0027]第三方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株在構(gòu)建體內(nèi)、外腫瘤耐藥模型中的用途。所構(gòu)建的耐藥腫瘤模型可用于以下相關(guān)研究:研究耐藥腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特點(diǎn)、研究腫瘤多藥耐藥機(jī)制、分析化療藥物敏感性及篩選化療藥物、開發(fā)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)藥物、研發(fā)更加有效的腫瘤治療方法等。
[0028]第四方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株在篩選新的抗腫瘤藥物中的用途。
[0029]第五方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株在開發(fā)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的用途。
[0030]本發(fā)明發(fā)明人以人肺腺癌細(xì)胞株A549為誘導(dǎo)對(duì)象，采用逐步增加化療藥物Abraxane濃度、間歇作用于細(xì)胞的體外誘導(dǎo)法建立了本發(fā)明的人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株。
[0031]本發(fā)明的人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株提高了肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，能在紫杉醇有效濃度為IOOnM的含Abraxane培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長、傳代及復(fù)蘇,對(duì)Abraxane的耐藥指數(shù)(RI)為118.76，除對(duì)Abraxane耐藥外，對(duì)其他化療藥物如紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素有明顯的交叉耐藥，與敏感細(xì)胞相比P〈0.01。
[0032]本發(fā)明的人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株可用于構(gòu)建體內(nèi)、外腫瘤耐藥模型，從而深入研究多藥耐藥機(jī)制，甚至發(fā)現(xiàn)其他新的耐藥機(jī)制，并進(jìn)一步篩選新的抗腫瘤藥物、開發(fā)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)藥物、研發(fā)更加有效的腫瘤治療方法，具有較高的科研和生產(chǎn)應(yīng)用的價(jià)值，預(yù)期能產(chǎn)生良好的科研、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
[0033]保藏信息
[0034]保藏日期:2013年11月26日；
[0035]保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱:CGMCC)，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，100101 ；
[0036]保藏編號(hào):CGMCCN0.8510。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1是普通人肺腺癌細(xì)胞株A549的顯微圖。
[0038]圖2是本發(fā)明人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株A549/Abr的顯微圖。
[0039]圖3是本發(fā)明人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株A549/Abr與普通人肺腺癌細(xì)胞株A549的細(xì)胞生長曲線圖。
[0040]圖4是普通人肺腺癌細(xì)胞株A549的細(xì)胞周期圖。
[0041]圖5是本發(fā)明人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株A549/Abr的細(xì)胞周期圖。[0042]圖6是本發(fā)明人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株A549/Abr與普通人肺腺癌細(xì)胞株A549的細(xì)胞周期分布比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面通過【具體實(shí)施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0044]本文的所有濃度數(shù)據(jù)均指紫杉醇的有效濃度。
[0045]實(shí)施例1本發(fā)明人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株A549/Abr的誘導(dǎo)建立 [0046]采用逐步增加Abraxane濃度、間歇作用的體外誘導(dǎo)法建立人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株，具體步驟如下:
[0047](I)人肺腺癌細(xì)胞株A549，復(fù)蘇后用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、青霉素100U/mL、鏈霉素100 μ g/mL)于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)；
[0048](2)取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞，換新鮮培養(yǎng)液，加入Abraxane，使其作用濃度為ΙΟηΜ，在37°C、5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)，適時(shí)換液，維持IOnM藥物濃度直至存活細(xì)胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；
[0049](3)適當(dāng)增加Abraxane的作用濃度,在37°C、5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng),適時(shí)換液,維持該藥物濃度直至存活細(xì)胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；
[0050](4)重復(fù)步驟(3)直到獲得能在400nM Abraxane中穩(wěn)定生長、傳代及復(fù)蘇的A549/Abr細(xì)胞株。
[0051]在篩選早期每階段增加ΙΟηΜ，待藥物作用濃度增加到IOOnM每階段增加20nM，待藥物作用濃度增加到200nM每階段增加40nM，歷時(shí)6個(gè)月建立了本發(fā)明人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株A549/Abr。
[0052]當(dāng)細(xì)胞依次對(duì)10nM、50nM、100nM、160nM、240nM、280nM、320nM、360nM、400nM
Abraxane穩(wěn)定耐藥后，及時(shí)凍存該濃度耐藥細(xì)胞于液氮中。凍存液由20%胎牛血清、10%DMS0、70%DMEM培養(yǎng)液組成，凍存過程采用細(xì)胞凍存盒達(dá)到使細(xì)胞從室溫梯度降溫至-80°C的目的，最后放置液氮中長期保存。凍存細(xì)胞的復(fù)蘇按以下程序進(jìn)行:在直徑為IOcm的培養(yǎng)皿中加入IOmL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，在15mL離心管中加入4mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液；從液氮中取出裝有細(xì)胞的凍存管，立即放入37°C水浴輕輕搖動(dòng)使凍存細(xì)胞在Imin內(nèi)解凍，用酒精棉球擦拭凍存管外壁后拿入超凈臺(tái)；將解凍后的細(xì)胞懸液移入已加了培養(yǎng)液的離心管中，立即混勻擰緊管口，1000r/min離心4min ;去上清，用2mL培養(yǎng)液混懸沉淀細(xì)胞，最后將細(xì)胞懸液加至已有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，吸管混勻后平放入培養(yǎng)箱中，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，約24小時(shí)細(xì)胞貼壁后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
[0053]實(shí)施例2對(duì)已建立的人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株A549/Abr進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及生物學(xué)特性鑒定:
[0054]1.形態(tài)學(xué)觀察
[0055]取對(duì)數(shù)生長期的人肺腺癌細(xì)胞株A549和本發(fā)明人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株A549/Abr，于倒置顯微鏡下觀察活細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果分別如圖1、圖2所示。
[0056]圖1顯示:A549細(xì)胞呈長梭形，形態(tài)較一致，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)均勻；
[0057]圖2顯示:A549/Abr細(xì)胞變小，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞易堆積成團(tuán)。
[0058]2.細(xì)胞生長曲線和群體倍增時(shí)間(Td)的測定(MTT法)[0059]取對(duì)數(shù)生長期A549、A549/Abr細(xì)胞，用胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞密度。每種細(xì)胞均以2000個(gè)/孔種于96孔板，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)接種7塊96孔板，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)ld、2d、3d、4d、5d、6d、7d ;將96孔板進(jìn)行MTT染色，每孔加入10 μ L MTT (5mg/mL)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h ;棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μ L DMSO溶解，搖床上低速震蕩IOmin ； λ =570nm，酶標(biāo)儀讀出每孔的OD值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。A549、A549/Abr的細(xì)胞生長曲線見圖3。
[0060]經(jīng)檢測計(jì)算，A549細(xì)胞的 Td 為 49.56h, A549/Abr 細(xì)胞的 Td 為 54.65h ；A549/Abr細(xì)胞較A549細(xì)胞的群體倍增時(shí)間延長了 5.09h，增加了 1.10倍。
[0061]實(shí)施例3PI染色法檢測細(xì)胞周期
[0062]用0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2 X IO5個(gè)/mL，接種于6孔板，培養(yǎng)24h ；0.25%胰酶消化，收取細(xì)胞；用4°C預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入4°C預(yù)冷的70%乙醇，于-20°C固定30min以上；2000r/min室溫離心5min，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1_2次，加入ImL PBS (含50 μ g/mL PI, 100 μ g/mLRNase Α)重懸細(xì)胞，4°C避光孵育30min ;用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為488nm，接收波長為600nm。A549細(xì)胞和A549/Abr細(xì)胞的細(xì)胞周期圖分別見圖4和圖5。
[0063]圖4和圖5的結(jié)果顯示，A549細(xì)胞的G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為83.58%,6.28%、9.62%，A549/Abr 細(xì)胞的 G0/G1 期、S 期、G2/M 期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為 76.01%、
9.85%、12.22%。
[0064]因此，與A549細(xì)胞相比，A549/Abr細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞數(shù)減少，S期、G2/M期細(xì)胞數(shù)增多，兩種細(xì)胞周期分布量化比較圖如圖6所示。
`[0065]實(shí)施例4藥物敏感試驗(yàn)
[0066]將A549/Abr細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，配制成3X104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μ L細(xì)胞懸液(每孔3 X IO3個(gè)細(xì)胞)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ;用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入100 μ L相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基；繼續(xù)將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h ;將96孔板進(jìn)行MTT染色，每孔加入10 μ L MTT (5mg/mL)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h ;棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μ L DMSO溶解，搖床上低速震蕩IOmin ； λ =570nm，酶標(biāo)儀讀出每孔的OD值；計(jì)算各組別抑制率及藥物IC50。試驗(yàn)結(jié)果參見表1。
[0067]根據(jù)表1的結(jié)果可以看出，A549/Abr細(xì)胞對(duì)白蛋白結(jié)合型紫杉醇(Abraxane)、紫杉醇(PTX)、多烯紫杉醇(DTX)、阿霉素(DOX)都有明顯的耐藥性，耐藥指數(shù)分別是118.79、164.88,270.27,2.99，對(duì)順鉬(CDDP)和氟尿嘧啶(5-FU)沒有耐藥性。
[0068]表1細(xì)胞株對(duì)各種化療藥物的IC50和耐藥指數(shù)
[0069]
化療藥物|IC50(A549) |IC50(A549/Abr)~[--
Abraxane(nM) 11.071314.66118.79
PTX(nM)8.571412.44164.88
【權(quán)利要求】
1.一種人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2013年11月26日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8510。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株，其特征在于，所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株對(duì)白蛋白結(jié)合型紫杉醇、紫杉醇、多烯紫杉醇及阿霉素均具有耐藥性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株，其特征在于，所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株對(duì)白蛋白結(jié)合型紫杉醇的耐藥指數(shù)為100以上。
4.一種如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將人肺腺癌細(xì)胞株A549在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，加入白蛋白結(jié)合型紫杉醇至紫杉醇有效濃度為IOnM ； (2)逐步增加白蛋白結(jié)合型紫杉醇的濃度，維持藥物濃度至細(xì)胞能在該濃度穩(wěn)定生長、傳代； (3)重復(fù)步驟(2)，直到獲得能在紫杉醇有效濃度為400nM的含白蛋白結(jié)合型紫杉醇的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長、傳代及復(fù)蘇的人肺腺癌細(xì)胞株，即為所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述生長培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基； 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)為在37°C、CO2濃度為5%的環(huán)境中培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述逐步增加白蛋白結(jié)合型紫杉醇的濃度的過程為: 早期，以每次增加IOnM紫杉醇有效濃度的方式，增加白蛋白結(jié)合型紫杉醇的濃度；待紫杉醇有效濃度增加至IOOnM時(shí)，以每次增加20nM紫杉醇有效濃度的方式，增加白蛋白結(jié)合型紫杉醇的濃度；待紫杉醇有效濃度增加至200nM時(shí)，以每次增加40nM紫杉醇有效濃度的方式，增加白蛋白結(jié)合型紫杉醇的濃度。
7.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株在構(gòu)建體內(nèi)、外腫瘤耐藥模型中的用途。
8.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株在篩選新的抗腫瘤藥物中的用途。
9.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株在開發(fā)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK103627674SQ201310627925
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】胡志遠(yuǎn), 雷春妮 申請(qǐng)人:國家納米科學(xué)中心