一種毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，采用戊二醛鍵合法將神經(jīng)氨酸酶固定在毛細(xì)管出口端。本發(fā)明首次采用戊二醛鍵合的方法將神經(jīng)氨酸酶固定在毛細(xì)管內(nèi)壁，該固定化酶微反應(yīng)器可連續(xù)使用1個月以上；酶的活性沒有明顯降低，大大增強(qiáng)了酶的穩(wěn)定性，從而很大程度地降低了酶的用量。且分離時，酶微反應(yīng)器固定在毛細(xì)管出口端，縮短了樣品分離的有效長度，大大提高了分離效率。本發(fā)明的制備方法步驟簡單，操作方便，篩選速度快，可廣泛應(yīng)用于神經(jīng)氨酸酶抑制劑的篩選。
【專利說明】—種毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及流感病毒藥物篩選領(lǐng)域，具體涉及一種毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在21世紀(jì)，流行性感冒仍然是危害人類身體健康的一大殺手。神經(jīng)氨酸酶是一種從流感病毒表面發(fā)現(xiàn)的糖蛋白，它可以催化水解唾液酸受體的特異性連接，并釋放出病毒顆粒感染新的細(xì)胞。同時，它還可以促進(jìn)病毒顆粒迅速進(jìn)入肺腺上皮細(xì)胞，導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部疾病，從而導(dǎo)致患者死亡。由于其在流感病毒的復(fù)制、傳播、感染及致病方面起著極為關(guān)鍵的作用，神經(jīng)氨酸酶抑制劑的應(yīng)用被認(rèn)為是預(yù)防與治療流感的主要途徑。
[0003]目前，應(yīng)用最多的神經(jīng)氨酸酶抑制劑有奧司他韋和扎那米韋。神經(jīng)氨酸酶抑制劑能同時對抗甲、乙型流感，且對禽流感及對人的傳染均有效。但是，其耐藥株的不斷出現(xiàn)及全球傳播，嚴(yán)重降低了其應(yīng)用療效。流感對人類生命的不斷威脅使得新型酶抑制劑的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)。
[0004]傳統(tǒng)的基于神經(jīng)氨酸酶的抑制劑篩選方法通常是將底物與抑制劑混合，然后加入酶，孵育30-60 min，加入強(qiáng)堿停止反應(yīng)，然后將反應(yīng)的混合溶液采用化學(xué)發(fā)光或熒光檢測。而化學(xué)發(fā)光及熒光檢測存在著顏色淬滅及熒光淬滅效應(yīng)，易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。毛細(xì)管電泳分離方法因其高效快速的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于酶抑制劑的篩選。而將毛細(xì)管電泳分離與固定化酶技術(shù)相結(jié)合，酶被固定在毛細(xì)管內(nèi)壁后，酶可以反復(fù)使用，其穩(wěn)定性也大大提高，從而降低酶的使用量；而且酶的反應(yīng)與分離都在一根毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)反應(yīng)與分離一體化，大大提高了篩選效率；通過多根毛細(xì)管并列使用，還可實(shí)現(xiàn)高通量篩選。
[0005]開管固定化酶技術(shù)一般有兩種:物理吸附法及共價鍵合法。物理吸附法固定條件溫和，能大部分保留酶的活性，反應(yīng)器`也可重復(fù)制備，不足之處在于反應(yīng)器穩(wěn)定性差，酶易被洗脫下來。而共價鍵合法，酶和載體結(jié)合牢固，反應(yīng)器穩(wěn)定性好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，采用戊二醛鍵合法使神經(jīng)氨酸酶與氨基化的硅烷化試劑及戊二醛發(fā)生鍵合反應(yīng)，鍵合固定在毛細(xì)管內(nèi)壁。
[0007]其具體技術(shù)方案為:
一種毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，制備方法包括如下步驟；
1)毛細(xì)管的預(yù)處理:毛細(xì)管依次采用IM NaOH沖洗2 h，H20沖洗30 min，純甲醇沖洗30 min ；
2)將3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液從毛細(xì)管出口端采用50mbar壓力進(jìn)樣6_18s，室溫下放置1-2 h ;然后在毛細(xì)管入口端依次用純甲醇、1120、？!1為7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液沖洗，得到內(nèi)壁涂敷有氨基化的硅烷化試劑的毛細(xì)管；3)配制戊二醛的Na2HPO4-NaH2PO4溶液:將戊二醛溶液加入pH為7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液中，配制成含有體積百分比為2.5%-5%的戊二醛溶液，備用；
4)將上步制得的戊二醛溶液從步驟2)制得的毛細(xì)管的出口端采用在50mbar壓力下進(jìn)樣6-18 s,放置1-3 h ;然后在毛細(xì)管入口端用pH為7.0的磷酸緩沖溶液沖洗,將未反應(yīng)的戊二醛沖出毛細(xì)管；
5)將0.1 U/mL的神經(jīng)氨酸酶溶液從上步制得的毛細(xì)管的出口端采用50 mbar壓力下進(jìn)樣6-18 S，放置30 min，然后將毛細(xì)管兩端封口，于4°C條件下保存24 h，得到毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器。
[0008]作為優(yōu)選項(xiàng):
所述毛細(xì)管為石英毛細(xì)管。
[0009]所述步驟2)中3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液中3-氨基丙基四乙氧硅烷的體積百分比為30%。
[0010]所述步驟2)中MeOH沖洗時間為5 min，H2O沖洗時間為3 min，pH為7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液沖洗時間為5 min。
[0011]所述步驟4)中磷酸緩沖溶液沖洗時間為10 min。
[0012]所述石英毛細(xì)管柱 長為35.5-40.5 cm。
[0013]本發(fā)明所述的細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器可應(yīng)用于在線篩選神經(jīng)氨酸酶抑制劑，所述應(yīng)用的方法為:待篩選化合物用甲醇配成I mg/mL的樣品溶液，取一定體積，分別與底物(溶解在50 mM pH5.0 NaAc-HAc緩沖溶液中)混合?；旌虾螅孜锱c待篩選化合物的終濃度分別為120 μ M和60 μ Μ。將底物或者底物與待篩選化合物的混合物分別在50 mbar壓力下進(jìn)樣6 S，進(jìn)入毛細(xì)管出口端，孵育5 min，使其與出口端的固定化酶反應(yīng)，比較底物或者底物與待篩選化合物的混合物進(jìn)樣后產(chǎn)生的產(chǎn)物的峰面積大小，若混合物進(jìn)樣后，峰面積減小，則說明待篩選化合物對神經(jīng)氨酸酶有抑制效果。
[0014]本發(fā)明首次采用戊二醛鍵合的方法將神經(jīng)氨酸酶固定在毛細(xì)管內(nèi)壁，使毛細(xì)管柱內(nèi)酶的反應(yīng)次數(shù)大大增加，該固定化酶微反應(yīng)器可連續(xù)使用I個月以上；酶的活性沒有明顯降低，大大增強(qiáng)了酶的穩(wěn)定性和使用壽命，從而很大程度地降低了酶的用量。且分離時，酶微反應(yīng)器固定在毛細(xì)管出口端，縮短了樣品分離的有效長度，大大提高了分離效率，與溶液中的篩選方法比，很大程度地降低了試劑用量和篩選成本。
[0015]本發(fā)明的制備方法步驟簡單，操作方便，篩選速度快，可廣泛應(yīng)用于神經(jīng)氨酸酶抑制劑的篩選。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器的示意圖。
[0017]圖2為補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對神經(jīng)氨酸酶的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0018]其中:曲線I為純底物進(jìn)樣后得到的電泳圖譜；
曲線2為底物與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚混合進(jìn)樣后得到的電泳圖譜；
曲線3為底物與補(bǔ)骨脂乙素混合進(jìn)樣后得到的電泳圖譜；
曲線4為底物與補(bǔ)骨脂甲素混合進(jìn)樣后得到的電泳圖譜?！揪唧w實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明通過下列非限制的實(shí)施實(shí)例進(jìn)一步加以說明，但非用以限制本發(fā)明的范圍。
[0020]實(shí)施例1:
選用內(nèi)徑為50 μ m的石英毛細(xì)管，管長35.5 cm，首先用I M NaOH沖洗2 h，H2O沖洗30 min，純甲醇沖洗30 min ;然后將毛細(xì)管固定在毛細(xì)管電泳儀上，將體積百分比為30%為3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液從毛細(xì)管出口端采用50 mbar壓力進(jìn)樣6s,室溫下放置I h后，然后從毛細(xì)管入口端依次用純甲醇沖洗5 min, H2O沖洗3 min,PH7.0 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液沖洗5 min ;接著將2.5%的戊二醛溶液從毛細(xì)管出口端采用50 mbar壓力進(jìn)樣6 s,室溫下放置I h后,然后從毛細(xì)管入口端用pH為7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液沖洗5 min ;最后將0.1 U/mL的神經(jīng)氨酸酶溶液，從毛細(xì)管出口端采用50 mbar壓力進(jìn)樣6 s,室溫下放置30 min后,放入4°C冰箱內(nèi)保存24 h。
[0021]將底物分別與補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚混合，底物終濃度為120 μ M，篩選化合物的終濃度為60 μ Μ，在50 mbar壓力下進(jìn)樣6 S，使混合物進(jìn)入毛細(xì)管出口端，孵育5 min，使其與出口端的固定化酶反應(yīng)，觀察產(chǎn)生的產(chǎn)物的峰面積變化。三個篩選的化合物與底物混合后，產(chǎn)生的產(chǎn)物的峰面積明顯下降，說明其對神經(jīng)氨酸酶有明顯的抑制作用，結(jié)果見圖2。
[0022]實(shí)施例2:
選用內(nèi)徑為50 μ m的石英毛細(xì)管·，管長38.5 cm，首先用I M NaOH沖洗2 h，H20沖洗30 min,純甲醇沖洗30 min ;然后將毛細(xì)管固定在毛細(xì)管電泳儀上,將體積百分比為30%為3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液從毛細(xì)管出口端采用50 mbar壓力進(jìn)樣12s，室溫下放置I h后,然后從毛細(xì)管入口端依次用純甲醇沖洗5 min, H2O沖洗3 min, pH為7.0Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液沖洗5 min ;接著將3%的戊二醛溶液從毛細(xì)管出口端采用50 mbar壓力進(jìn)樣12s，室溫下放置2 h后，然后從毛細(xì)管入口端用pH為7.0 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液沖洗5 min ;最后將0.1 U/mL的神經(jīng)氨酸酶溶液,從毛細(xì)管出口端采用50 mbar壓力進(jìn)樣12s，室溫下放置30 min后，放入4°C冰箱內(nèi)保存24 h。
[0023]將底物分別與補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚混合，底物終濃度為120 μ Μ，篩選化合物的終濃度為60 μ Μ，在50 mbar壓力下進(jìn)樣12 s,使混合物進(jìn)入毛細(xì)管出口端，孵育5 min，使其與出口端的固定化酶反應(yīng)，觀察產(chǎn)生的產(chǎn)物的峰面積變化。三個篩選的化合物與底物混合后，產(chǎn)生的產(chǎn)物的峰面積明顯下降，說明其對神經(jīng)氨酸酶有明顯的抑制作用。
[0024]實(shí)施例3:
選用內(nèi)徑為50 μ m的石英毛細(xì)管，管長40.5 cm，首先用I M NaOH沖洗2 h，H20沖洗30 min,純甲醇沖洗30 min ;然后將毛細(xì)管固定在毛細(xì)管電泳儀上,將體積百分比為30%為3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液從毛細(xì)管出口端采用50 mbar壓力進(jìn)樣18 S，室溫下放置2 h后,然后從毛細(xì)管入口端依次用純甲醇沖洗5 min, H2O沖洗3 min, pH為7.0Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液沖洗5 min ;接著將5%的戊二醛溶液從毛細(xì)管出口端采用50 mbar壓力進(jìn)樣18s，室溫下放置3 h后，然后從毛細(xì)管入口端用pH為7.0 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液沖洗5 min ;最后將0.1 U/mL的神經(jīng)氨酸酶溶液,從毛細(xì)管出口端采用50 mbar壓力進(jìn)樣18s，室溫下放置30 min后，放入4°C冰箱內(nèi)保存24 h。
[0025]將底物分別與補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚混合，底物終濃度為120 μ Μ，篩選化合物的終濃度為60 μ Μ，在50 mbar壓力下進(jìn)樣18 s,使混合物進(jìn)入毛細(xì)管出口端，孵育5 min，使其與出口端的固定化酶反應(yīng)，觀察產(chǎn)生的產(chǎn)物的峰面積變化。三個篩選的化合物與底物混合后，產(chǎn)生的產(chǎn)物的峰面積明顯下降，說明其對神經(jīng)氨酸酶有明顯的抑制作用。`
【權(quán)利要求】
1.一種毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于:制備方法包括如下步驟； 1)毛細(xì)管的預(yù)處理:毛細(xì)管依次采用IM NaOH沖洗2 h，H20沖洗30 min，純甲醇沖洗30 min ； 2)將3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液從毛細(xì)管出口端采用50mbar壓力進(jìn)樣6_18s，室溫下放置1-2 h ;然后從毛細(xì)管入口端依次用純甲醇、1120、？!1為7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液沖洗，得到內(nèi)壁涂敷有氨基化的硅烷化試劑的毛細(xì)管； 3)配制戊二醛的Na2HPO4-NaH2PO4溶液:將戊二醛溶液加入pH為7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液中，配制成含有體積百分比為2.5%-5%的戊二醛溶液，備用； 4)將上步制得的戊二醛溶液從步驟2)制得的毛細(xì)管的出口端采用在50mbar壓力下進(jìn)樣6-18 s,放置1-3 h ;然后從毛細(xì)管入口端用pH為7.0的磷酸緩沖溶液沖洗,將未反應(yīng)的戊二醛沖出毛細(xì)管； 5)將0.1 U/mL的神經(jīng)氨酸酶溶液從上步制得的毛細(xì)管的出口端采用50 mbar壓力下進(jìn)樣6-18 S，放置30 min，然后將毛細(xì)管兩端封口，于4°C條件下保存24 h，得到毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器。
2.如權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于:所述毛細(xì)管為石英毛細(xì)管。
3.如權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于:所述步驟2)中3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液中3-氨基丙基四乙氧硅烷的體積百分比為30%。`
4.如權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于:所述步驟2)中MeOH沖洗時間為5 min, H2O沖洗時間為3 min, pH為7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液沖洗時間為5 min。
5.如權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管內(nèi)固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于:所述步驟4)中磷酸緩沖溶液沖洗時間為10 min。
6.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)氨酸酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于:所述石英毛細(xì)管柱長為35.5-40.5 cm。
【文檔編號】C12Q1/34GK103627634SQ201310629452
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】陳子林, 趙海燕 申請人:武漢大學(xué)