一種高度純化激肽釋放酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高度純化激肽釋放酶的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜，離子交換樹脂DEAE-瓊脂糖快膠分步洗脫等傳統(tǒng)與現(xiàn)代相結(jié)合的蛋白純化技術(shù)，高度純化激肽釋放酶。本發(fā)明具有生產(chǎn)周期短，對化學和熱穩(wěn)定性好、成本低的特點，非常適用于規(guī)?；笊a(chǎn)。
【專利說明】一種高度純化激肽釋放酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜，離子交換樹脂DEAE-瓊脂糖快膠分步洗脫等傳統(tǒng)與現(xiàn)代相結(jié)合的蛋白純化技術(shù)，制備激肽釋放酶。
【背景技術(shù)】
[0002]激肽釋放酶(kallikein)是從豬胰臟中分離純化制得的天然酶類藥物，臨床上又稱血管舒緩素，具有舒展毛細血管和小動脈的作用，在臨床上常用來治療高血脂，防治脂肪肝、動脈粥樣硬化、高血壓、心絞痛等多種疾病，它的開發(fā)具有重要的醫(yī)學和社會價值。在我國，激肽釋放酶生產(chǎn)還存在很大的發(fā)展空間。
[0003]傳統(tǒng)的純化激肽釋放酶的工藝由于工藝復雜、成本較高；離子交換層析是目前是適合激肽釋放酶工業(yè)化生產(chǎn)的最普遍方法；但通常需要采用多種進口離子交換介質(zhì)對激肽釋放酶進行純化，不僅操作繁瑣，且因多次上柱使得回收率很低，以最具有實用價值的周祖萌等人的方法為例 ，通過在PH7.0、pH5.0、pH6.7條件下，依次將所得樣品上DEAE-Cellulose、DEAE-Sepharosecl_6B,得到了比活1500u/mg左右的激肽釋放酶，收率為40%。除此之外，目前國際上大多采用陰離子交換，結(jié)合陽離子交換，最后加一步凝膠過濾層析，并且離子交換過程中激肽釋放酶的洗脫都采用改變PH的方式，由于緩沖溶液的緩沖作用，使得柱內(nèi)PH改變緩慢，周期延長，耗費大量緩沖液，以法國Graham S.Bailey的純化過程，雖然經(jīng)三步純化后，激肽釋放酶比活高達1254u/mg，但收率只有28.4% ;其次有采用離子交換層析與親和層析或疏水層析相結(jié)合，步驟較多，純化周期較長且成本高昂，以英國Talal S.E1.Thaher的純化過程為例，雖然收率達到87%，但激肽釋放酶比活只有156.3u/mg ;再次，采用一種離子交換介質(zhì)想要通過一次純化就獲得高純度和高收率的激肽釋放酶幾乎是不可能完成的任務(wù)，以李立桓等利用Amberlite-CG50 —步從胰酶中分離純化激肽釋放酶，但其比活和收率分別只有107.4u/mg和12.1 %。
[0004]而本發(fā)明是靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜，離子交換樹脂DEAE-瓊脂糖快膠分步洗脫等傳統(tǒng)與現(xiàn)代相結(jié)合的蛋白純化技術(shù)，使用DEAE-瓊脂糖快膠具有高流速、高載量，可以有效的縮短生產(chǎn)周期，且對化學和熱穩(wěn)定性好，產(chǎn)品的收率在同類工藝中處于領(lǐng)先地位；而激肽釋放酶分步洗脫的方法，雖然不能達到國際最高標準，但是依然超過了臨床用藥的要求，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是高度純化從合格的豬胰臟中提取的激肽釋放酶。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜，離子交換樹脂DEAE-瓊脂糖快膠分步洗脫等傳統(tǒng)與現(xiàn)代相結(jié)合的蛋白純化技術(shù)，高度純化激肽釋放酶。本發(fā)明具有生產(chǎn)周期短，對化學和熱穩(wěn)定性好、成本低的特點，非常適用于規(guī)?；笊a(chǎn)。包括如下步驟:
[0007](I)醋酸提取:將豬胰臟制成丙酮粉后，加醋酸溶液攪拌提取，離心，得上清液；
[0008](2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚脫脂、脫水，干燥，得激肽釋放酶粗品；
[0009](3)氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜:將粗品用氯化鈉溶液溶解，用氨水調(diào)PH，攪拌混合，過濾，得濾液；將濾液中加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗滌，干燥，得激肽釋放酶中間品;
[0010](4)離子交換層析:將激肽釋放酶中間品溶于18~22倍量的0.0005~
0.0015mol/L醋酸緩沖液(pH4.5)中，離心，得上清液；取上清液，按1:8~12的體積比上DEAE-瓊脂糖快膠柱吸附，吸附平衡后，用含0.15~0.25mol/L氯化鈉的0.01mol/L醋酸緩沖液洗脫至基線，再用含0.25~0.45mol/L氯化鈉的0.01mol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液透析脫鹽，凍干，得激肽釋放酶精品。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0012]實施例1
[0013]所述的以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜，離子交換樹脂DEAE-瓊脂糖快膠分步洗脫等傳統(tǒng)與現(xiàn)代相結(jié)合的蛋白純化技術(shù)，制備激肽釋放酶，包括如下步驟:
[0014](I)醋酸提取:將豬胰臟IOKg制成丙酮粉后，加入30倍量的醋酸溶液，攪拌提取，離心，得上清液29.8L。
[0015](2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚脫脂、脫水，干燥，得激肽釋放酶粗品93g。
[0016](3)氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜:將粗品用50倍量氯化鈉溶液溶解，用氨水調(diào)PH，攪拌混合，過濾，得濾液；，加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗滌，干燥，得激肽釋放酶中間品60g。
[0017](4)離子交換層析:將激肽釋放酶中間品溶于20倍量的0.001mol/L醋酸緩沖液(pH4.5)中，離心，得上清液；取上清液，按1: 10的體積比上DEAE-瓊脂糖快膠柱吸附，吸附平衡后，用含0.2mol/L氯化鈉的0.01mol/L醋酸緩沖液洗脫至基線，再用含0.35mol/L氯化鈉的0.01mol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液透析脫鹽，凍干，得激肽釋放酶精品42g。
[0018]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、`等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種高度純化激肽釋放酶的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)醋酸提取:將豬胰臟制成丙酮粉后，加醋酸溶液攪拌提取，離心，得上清液； (2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚脫脂、脫水，干燥，得激肽釋放酶粗品； (3)氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜:將粗品用氯化鈉溶液溶解，用氨水調(diào)PH，攪拌混合，過濾，得濾液；將濾液中加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗滌，干燥，得激肽釋放酶中間品; (4)離子交換層析:將激肽釋放酶中間品溶于醋酸緩沖液中，離心，得上清液；取上清液，上DEAE-瓊脂糖快膠柱吸附，吸附平衡后，用含氯化鈉的醋酸緩沖液洗脫至基線，再用含氯化鈉的醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液透析脫鹽，凍干，得激肽釋放酶精品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，激肽釋放酶中間品與醋酸溶液的比例為=IKg:18~22L，醋酸溶液的濃度為:0.0005~0.0015mol/L, pH值為4.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，洗脫至基線的含氯化鈉的醋酸緩沖液為含0.15~0.25mol/L氯化鈉的0.01mol/L醋酸緩沖液；第二次洗脫用的含氯化鈉的醋酸緩沖液為含0.25~0.45mol/L氯化鈉的0.01mol/L醋酸緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中用新型的陰離子交換柱吸附，所用的離子交換介質(zhì)為DEAE -瓊脂糖快膠，DEAE-瓊脂糖快膠與上清液的體積比為:(8~12):lo
【文檔編號】C12N9/64GK103725664SQ201310638653
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】劉乃山, 李靜潔, 劉君, 張曉涵 申請人:青島康原藥業(yè)有限公司