人cd3+cd8+cik細(xì)胞的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是一種人CD3+CD8+CIK細(xì)胞的制備方法。本發(fā)明包括如下步驟：(1)采集外周靜脈血并分離外周血單個核細(xì)胞；(2)將細(xì)胞重懸于含10％自體血漿的無血清培養(yǎng)基中，并加入終濃度為1000IU/ml的IFN-γ；(3)培養(yǎng)24小時后加入抗CD3單抗、抗CD28單抗、IL-1α、IL-2，48小時后加入卡介苗；(4)以后每2～3天補加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)21天。通過本發(fā)明所制備的人CD3+CD8+CIK細(xì)胞，其應(yīng)用主要為癌癥病人的治療或者癌癥高危人群的預(yù)防。本發(fā)明的優(yōu)點是總細(xì)胞擴增效率在21天是現(xiàn)有技術(shù)的2倍左右；更為重要的是，本發(fā)明擴增的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞較現(xiàn)有技術(shù)數(shù)量明顯提高，從先現(xiàn)有技術(shù)CIK細(xì)胞比例的60％提高到90％左右，而且其殺瘤活性明顯提高。
【專利說明】人CD3+CD8+CIK細(xì)胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是一種人⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞的制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokineinduced killer cell, CIK)是 Schmidt 等于1986年報的從外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中誘導(dǎo)出的一群異質(zhì)性細(xì)胞。其主要效應(yīng)細(xì)胞因同時表達(dá)⑶3+和⑶56+兩種膜蛋白分子，因此又被稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞(NKT細(xì)胞)。體內(nèi)外的實驗研究表明，CIK細(xì)胞具有殺瘤活性高、增值速度快、抗凋亡及殺瘤效應(yīng)不受癌細(xì)胞多重耐藥的影響等優(yōu)勢。經(jīng)典的同時也是目前最常用的CIK細(xì)胞培養(yǎng)方法是IFN-Y、抗⑶3單抗、IL-1a與IL-2共同培養(yǎng)產(chǎn)生的CIK細(xì)胞，其具體步驟為:將外周血分離的PBMCs用含10%的FCS的RPM1-1640培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整密度為2 X 107ml，培養(yǎng)第O天加入1000U IFNi，24h加入100ng/ml的抗CD3單抗、100U IL-1a與300U IL-2，每3天補加300U IL-2及新鮮培養(yǎng)基，控制細(xì)胞密度為I~2 X 106/ml，連續(xù)培養(yǎng)21天，其主要效應(yīng)細(xì)胞——NKT細(xì)胞，擴增約1000倍，含量占細(xì)胞群體的14%左右。上述經(jīng)典的方案卻存在以下問題= (I)CIK細(xì)胞中絕大部分群體為⑶3+⑶8+T淋巴細(xì)胞，大約占CIK細(xì)胞的60%左右，然而其殺瘤活性卻受到極大的限制；這與目前的Q)3+0)8+T淋巴細(xì)胞,也即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)是抗腫瘤的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞的認(rèn)識存在差異。(2)雖然主要效應(yīng)細(xì)胞——NKT細(xì)胞，擴增1000倍左右，但整體細(xì)胞群體擴增能力較為有限，大約80~100倍左右。目前雖然有很多改進(jìn)的方案，但是這兩個根本的問題依然沒有很好的解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用，在保證原有CIK細(xì)胞主要效應(yīng)細(xì)胞——NKT細(xì)胞殺瘤活性和增值能力不降低的
情況下，使CIK細(xì)胞群體中的主要群體-CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的殺瘤活性和增值能力均
得到極大的提高，實現(xiàn)CIK細(xì)胞更加充分的發(fā)揮殺瘤效應(yīng)。
[0004]本發(fā)明所提供的人⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞，是指以⑶3+⑶8+T淋巴細(xì)胞為主效應(yīng)細(xì)胞，在CIK細(xì)胞異質(zhì)性群體中約90%，NKT細(xì)胞為次效應(yīng)細(xì)胞，在CIK細(xì)胞異質(zhì)性群體中約23%，其中本發(fā)明所制備的人⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞⑶3+⑶8+T，其細(xì)胞毒活性與NKT細(xì)胞相當(dāng)。其中，CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞其表面標(biāo)記為:人白細(xì)胞分化抗原CD3、人白細(xì)胞分化抗原CD8和人α β TCR受體；ΝΚΤ細(xì)胞表面標(biāo)記為:人白細(xì)胞分化抗原CD56和人α β TCR受體。本發(fā)明所制備的人⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞主要應(yīng)用于癌癥病人的治療或者癌癥高危人群的預(yù)防。
[0005]本文中的“⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞”表示CD3和⑶8均為陽性的CIK細(xì)胞。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過在經(jīng)典的CIK細(xì)胞培養(yǎng)方案的基礎(chǔ)上添加新的細(xì)胞因子及非特異性免疫刺激劑，開發(fā)出更加有效的CD3+CD8+CIK細(xì)胞制備方法。設(shè)計人⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟:
[0007](I)采集外周靜脈血，獲取單核細(xì)胞。
[0008](2)將上述PBMCs重懸于含10%自體滅活血漿的商品化無血清培養(yǎng)基中，例如PAA?或者GT-T551?等，調(diào)整細(xì)胞密度(1-3) X 106/ml左右，并加入IFN-Y至終濃度500-1500IU/ml，最后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
[0009](3)培養(yǎng)20-28小時后加入抗⑶3單抗、抗⑶28單抗、IL_1 α、IL-2中的一種或者幾種，40-50小時后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin, BCG)連續(xù)培養(yǎng)14~21天，其中每2~3天補加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，使補加培養(yǎng)基后的細(xì)胞密度控制在(I~
2)XlOVmlo
[0010]作為優(yōu)選，步驟(1)具體為采集外周靜脈血，然后用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心法分離收集，并用生理鹽水洗滌2次，低速離心后獲得PBMCs。
[0011]作為優(yōu)選，所述步驟(2)中調(diào)整細(xì)胞密度為2X106/ml左右，并加入IFN-Y至終濃度 1000IU/ml。
[0012]進(jìn)一步地,所述步驟(3)所加入的抗⑶3單抗?jié)舛葹?0~500ng/ml,抗⑶28單抗的濃度為50~500ng/ml，IL-1 α的濃度為0.5~5ng/ml，IL-2的濃度為50~1000IU/ml ο
[0013]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述抗⑶3單抗?jié)舛葹?00ng/ml。
[0014]進(jìn)一步優(yōu)選地,所述抗0)28單抗的濃度為200ng/ml。
`[0015]進(jìn)一步優(yōu)選地,所述IL-1 α的濃度為lng/ml。
[0016]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述IL-2的濃度為1000IU/ml。
[0017]進(jìn)一步地，所述步驟(3)所加入的BCG的濃度為5~20 μ g/ml。
[0018]進(jìn)一步優(yōu)選地,所述BCG的濃度為10 μ g/ml。
[0019]進(jìn)一步地，所述步驟(3)中每2~3天補加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基時，IL_2的濃度為 50 ~1000IU/ml。
[0020]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述IL-2的濃度為1000IU/ml。
[0021 ] 本發(fā)明所用的原料和試劑除有特殊說明外，均市售可得。
[0022]與現(xiàn)有CIK細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明的優(yōu)勢體現(xiàn)在以下幾方面:本發(fā)明所制備的⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞，總細(xì)胞擴增效率在21天是現(xiàn)有技術(shù)的2倍左右。其中NKT細(xì)胞擴增的效率和殺瘤活性與現(xiàn)有技術(shù)相比無明顯降低；更為重要的是，本發(fā)明擴增的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞較現(xiàn)有技術(shù)數(shù)量明顯提高，從先現(xiàn)有技術(shù)CIK細(xì)胞比例的60%提高到90%左右，而且其殺瘤活性明顯提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]1.圖1不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs生長曲線(n=8);外周血來源的PBMCs。通過不同方式培養(yǎng)，在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分別用細(xì)胞計數(shù)板和細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)，將當(dāng)前細(xì)胞總數(shù)除以開始培養(yǎng)時(第O天)的細(xì)胞總數(shù)，所得數(shù)值即為細(xì)胞增殖倍數(shù)。CIK組:指采用斯坦福大學(xué)應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞KD3⑶8CIK組:指本發(fā)明采用的培養(yǎng)方法。[0024]2.圖2采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫表型檢測(n=8)。外周血來源的PBMCs，通過不同方式培養(yǎng)，在第14天取細(xì)胞進(jìn)行流式熒光抗體:抗⑶3-FITC、⑶4-PE、⑶8-PECY5.5、CD56-APC進(jìn)行表面染色并檢測。CIK組:指采用斯坦福大學(xué)應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞；⑶3⑶8CIK組:指本發(fā)明采用的培養(yǎng)方法。
[0025]3.圖3采用CCK-8細(xì)胞毒活性檢測試劑盒對不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測。通過不同方式培養(yǎng)，在第14天取細(xì)胞通過CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒活性檢測。CIK組:指采用經(jīng)典最常用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞KD3⑶8CIK組:指本發(fā)明采用的培養(yǎng)方法KD3⑶8T組:培養(yǎng)13天的⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞，首先對⑶3+細(xì)胞進(jìn)行流式分選，然后通過抗CD8流式熒光抗體進(jìn)行分選，所獲得的細(xì)胞則為CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞；NKT組:培養(yǎng)13天的⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞，首先對⑶3+細(xì)胞進(jìn)行流式分選，然后通過抗⑶56流式熒光抗體進(jìn)行分選，所獲得的細(xì)胞則為NKT淋巴細(xì)胞。橫坐標(biāo):E:T=10:1表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值為10:1，E:T=20:1表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值為20:1，E:T=40:1表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值為40:1。
【具體實施方式】
[0026]下面用實例來具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實例中凡未注明具體條件的實驗方法，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。
[0027]實施例1
[0028]本實施例1是分離獲得的PBMCs并進(jìn)行⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞的培養(yǎng)。包括以下步驟:
[0029]1.采集患者外周靜脈血，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個核細(xì)胞。具體步驟為:1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56°C滅活30分鐘后離心備用，用生理鹽水對倍稀釋沉淀的血細(xì)胞，人淋巴細(xì)胞分離液與稀釋血液按1:2的比例加入離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)速分別為1600轉(zhuǎn)/分，1300轉(zhuǎn)/分，均離心7分鐘，即得到PBMCs。
[0030]2.將上述PBMCs重懸于含10%自體滅活血漿的PAA?或者GT-T551TM等商品化無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度2 X 106/ml左右，并加入IFN-Y至終濃度1000IU/ml，最后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
[0031]3.培養(yǎng)24小時后加入抗⑶3單抗、抗⑶28單抗、IL-1 α、IL-2,48小時后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin, BCG)連續(xù)培養(yǎng)14~21天，其中每2~3天補加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，使補加培養(yǎng)基后的細(xì)胞密度控制在I~2X 106/ml。其中24小時后所使用的抗CD3單抗?jié)舛葹?00ng/ml，抗CD28單抗的濃度為200ng/ml，IL-1 α的濃度為Ing/ml，IL-2的濃度為1000IU/ml ；48小時后加入BCG的濃度為10 μ g/m ;每2~3天補加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基時，IL-2的濃度為1000IU/ml。
[0032]實施例2
[0033]本實施例2是對⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)和增值能力檢測。包括以下步驟:
[0034]1.細(xì)胞培養(yǎng)24小時即可見⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞沉于培養(yǎng)瓶的底部，仍呈單細(xì)胞狀態(tài)，48小時趨于集落化，培養(yǎng)3天后就可以看到大的集落和不規(guī)則的單個核細(xì)胞。對培養(yǎng)12~14天的細(xì)胞進(jìn)行瑞姬氏染色，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞體積增大，呈橢圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞核大多為橢圓形或圓形，核染色疏松，核膜不規(guī)則，有突起，每個細(xì)胞可見I個小核仁，呈深藍(lán)色；胞質(zhì)豐富，染成灰藍(lán)色，形態(tài)不規(guī)則，有偽足，近核處有淡染現(xiàn)象，也有呈不規(guī)則形。取培養(yǎng)12~14天的細(xì)胞100 μ 1，加入100 μ 10.4%臺盼藍(lán)染色液，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，顯微鏡下計數(shù)。本發(fā)明制備的細(xì)胞活力大于95%。
[0035]2.在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分別用細(xì)胞計數(shù)板和細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)，
將當(dāng)前細(xì)胞總數(shù)除以開始培養(yǎng)時的細(xì)胞總數(shù)，所得數(shù)值即為細(xì)胞增殖倍數(shù)，以此進(jìn)行動態(tài)觀察細(xì)胞增殖情況并作為細(xì)胞補加新鮮培養(yǎng)基時的參考，細(xì)胞擴增倍數(shù)見圖1、表1。
[0036]表1:不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs擴增倍數(shù)(η=8)
[0037]
【權(quán)利要求】
1.人CD3+CD8+CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，采用如下制備步驟: 1)采集外周靜脈血，獲取單核細(xì)胞； 2)將步驟I)獲取的單核細(xì)胞重懸于含10%自體滅活血漿的商品化無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度(1-3) X 106/ml，并加入IFN-Y至終濃度500-1500IU/ml，最后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)； 3)培養(yǎng)20-28小時后加入抗⑶3單抗、抗⑶28單抗、IL-1a、IL-2中的一種或者幾種，40-50小時后加入卡介苗連續(xù)培養(yǎng)14~21天，制備得到⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞；其中每2~3天補加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，使補加培養(yǎng)基后的細(xì)胞密度控制在(I~2) X106/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人CD3+CD8+CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于:步驟I)具體為采集外周靜脈血，然后用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心法分離收集，并用生理鹽水洗滌2次，低速離心后獲得PBMCs。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述人CD3+CD8+CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟3)加入抗CD3單抗?jié)舛葹?0~500ng/ml，抗CD28單抗的濃度為50~500ng/ml，IL-1 a的濃度為0.5~5ng/ml，IL-2的濃度為50~1000IU/ml ;加入卡介苗的濃度為5~20 μ g/ml ;每2~3天補加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基時，IL-2的濃度為50~1000IU/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述人CD3+CD8+CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述抗CD3單抗?jié)舛葹?00ng/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或4所述人CD3+CD8+CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述抗CD28單抗的濃度為200ng/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或4所述人CD3+CD8+CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述IL-1a的濃度為lng/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述人CD3+CD8+CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述IL-2的濃度為 1000IU/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或4或7所述人CD3+CD8+CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述卡介苗的濃度為10 μ g/mL.
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述人CD3+CD8+CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中加入 IFN-Y 至終濃度 1000-1200IU/ml。
【文檔編號】C12N5/0783GK103642752SQ201310638798
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】馬飛, 王宇環(huán), 羅曉玲 申請人:深圳市合一康生物科技有限公司