一種提取玻璃酸酶精品的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種提取玻璃酸酶精品的方法，其特征在于，粗品經(jīng)色譜分離、熱原處理、凍干得玻璃酸酶精品，使玻璃酸酶精品的效價(jià)可以達(dá)到350iu/mg。
【專利說(shuō)明】一種提取玻璃酸酶精品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)涉及從新鮮動(dòng)物睪丸中提取玻璃酸酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玻璃酸酶又名透明質(zhì)酸酶，在哺乳動(dòng)物的睪丸里含量很豐富，能水解透明質(zhì)酸，使其粘滯性明顯下降，有利于受精時(shí)精子進(jìn)入卵子。也存在于精子、頜下腺、蜂毒、蛇毒、皮膚、脾臟、水蛭及細(xì)胞的溶酶體中。
[0003]玻璃酸酶的穩(wěn)定性較好，42°C加熱60分鐘活力不損失；100°C加熱5分鐘，活力可保留80%。受熱失活后進(jìn)行冷卻可恢復(fù)部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩(wěn)定。在低濃度水溶液中較易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯膠或0.2%明膠保護(hù)。Fe2+、Cu2+對(duì)酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、Ni2+等對(duì)酶活性沒(méi)有明顯影響。硫酸軟骨素B(皮膚素)、硫酸類肝素、硫酸角質(zhì)素、肝素及高濃度玻璃酸酶對(duì)酶均有抑制作用，但可被0.15mol/L氯化鈉或硫酸魚精蛋白所逆轉(zhuǎn)。
[0004]藥用玻璃酸酶為白色或微黃色粉末，無(wú)氣味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有機(jī)溶劑。生化制藥主要用牛、羊睪丸為原料 進(jìn)行提取制備。
[0005]國(guó)外50年代初已投入生產(chǎn)，并收載于英國(guó)和日本藥典中，商品名Rondas。我國(guó)1965年正式投入生產(chǎn)，從羊睪丸中提取，收入1977版中國(guó)藥典。王彥，周淑敏等曾在2002年15卷(I)期的《黑龍江醫(yī)藥》上發(fā)表了一篇名為《透明質(zhì)酸酶提取工藝的研究》的論文，較詳細(xì)的介紹了工業(yè)生產(chǎn)中從羊睪丸中提取玻璃酸酶的傳統(tǒng)工藝以及在此基礎(chǔ)上由他們改良的新工藝；李丹，郭育濤等曾在2011年8月第40卷第8期的《應(yīng)用化工》上發(fā)表了一篇名為《牛睪丸中透明質(zhì)酸酶提取工藝研究》的論文，介紹了用鹽酸和乙酸的混合液溶解、硫酸銨鹽析方法，從牛睪丸中玻璃酸酶的實(shí)驗(yàn)研究。但是用色譜分離法提取玻璃酸酶精品的工藝，暫時(shí)還沒(méi)有相關(guān)記載。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種提取玻璃酸酶精品的方法，粗品經(jīng)色譜分離、熱原處理、凍干得玻璃酸酶精品。具體步驟如下:
[0007](一 )色譜分離
[0008]設(shè)定柱流速25L/h，用平衡液平衡色譜分離柱2小時(shí)，粗品溶于少量平衡液后上柱，再分別用平衡液和清洗液各清洗柱子25分鐘，然后用洗脫液洗脫30分鐘，收集溶液，加4倍收集液體積的乙醇沉淀12小時(shí)后離心脫水，轉(zhuǎn)速3700r/min ;其中:平衡液為醋酸鈉1090g,加純化水160L，調(diào)pH3.6后的溶液；清洗液為醋酸鈉220g，加純化水16L，調(diào)pH3.6后的溶液；洗脫液為氯化鈉440g，加純化水15L，調(diào)pH3.6后的溶液；
[0009]( 二 )熱原處理:
[0010]將上述溶液離心，過(guò)濾，將濾液放冰浴中冷卻,加入15%磷酸三鈉(Na3PO4.12H20)溶液，在不斷攪拌下，緩緩加入20%醋酸鈣(Ca(CH3COO)2^H2O)溶液，并以NaOH溶液調(diào)PH8.5，離心，收集上清液，之后上清液調(diào)pH6.5~7.0 ;
[0011](三)凍干
[0012]將濾液冷凍干燥，即得無(wú)熱原的玻璃酸酶精品。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0014]本發(fā)明技術(shù)是用色譜分離法提取玻璃酸酶精品，國(guó)內(nèi)暫時(shí)沒(méi)有相關(guān)記載。本發(fā)明技術(shù)是用粗品經(jīng)色譜分離、熱原處理、凍干得玻璃酸酶精品，得到的玻璃酸酶效價(jià)更高，350iu/mg,且玻璃酸酶不含熱原，藥品質(zhì)量符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)易、成本低，原材料來(lái)源廣泛，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。該項(xiàng)成果有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，它不但解決國(guó)內(nèi)外醫(yī)療用藥的需求，還為養(yǎng)殖產(chǎn)品的綜合利用開拓了新路，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展有積極意義。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0016]實(shí)施例1
[0017](一)色譜分離
[0018]設(shè)定柱流速25L/h，用平衡液平衡色譜分離柱2小時(shí)，粗品800g溶于80L平衡液后上柱，再分別用平衡液和清洗液各清洗柱子25分鐘，然后用洗脫液洗脫30分鐘，收集溶液12.8L，加51.2L乙醇沉淀12小時(shí)后離心脫水，轉(zhuǎn)速3700r/min ;其中:平衡液為醋酸鈉1090g,加純化水160L，調(diào)pH3.6后的溶液；清洗液為醋酸鈉220g，加純化水16L，調(diào)pH3.6后的溶液；洗脫液為氯化鈉440g，加純化水15L，調(diào)pH3.6后的溶液；
[0019](二)熱原處理:
[0020]將上述溶液離心，過(guò)濾，將濾液放冰浴中冷卻,加入15%磷酸三鈉(Na3PO4.12H20)溶液8mL，在不斷攪拌下，緩緩加入20%醋酸鈣(Ca(CH3COO)2.H2O)溶液4mL，并以NaOH溶液調(diào)pH8.5，離心，收集上清液，之后上清液調(diào)pH6.5~7.0 ;
[0021](三)凍干
[0022]將濾液冷凍干燥，即得無(wú)熱原的玻璃酸酶精品306.18g。
[0023]實(shí)施例2
[0024](一 )色譜分離
[0025]設(shè)定柱流速25L/h，用平衡液平衡色譜分離柱2小時(shí)，粗品400g溶于40L平衡液后上柱，再分別用平衡液和清洗液各清洗柱子25分鐘，然后用洗脫液洗脫30分鐘，收集溶液8.2L，加32.8L乙醇沉淀12小時(shí)后離心脫水，轉(zhuǎn)速3700r/min ;其中:平衡液為醋酸鈉1090g,加純化水160L，調(diào)pH3.6后的溶液；清洗液為醋酸鈉220g，加純化水16L，調(diào)pH3.6后的溶液；洗脫液為氯化鈉440g，加純化水15L，調(diào)pH3.6后的溶液；
[0026]( 二)熱原處理:
[0027]將上述溶液離心，過(guò)濾，將濾液放冰浴中冷卻,加入15%磷酸三鈉(Na3PO4.12H20)溶液4mL，在不斷攪拌下，緩緩加入20%醋酸鈣(Ca(CH3COO)2.H2O)溶液2mL，并以NaOH溶液調(diào)pH8.5，離心，收集上清液，之后上清液調(diào)pH6.5~7.0 ;
[0028](三)凍干[0029]將濾液冷凍干燥，即得無(wú)熱原的玻璃酸酶精品154.64g。
[0030]經(jīng)測(cè)算，實(shí)施例1中玻璃酸酶精品效價(jià)為352.76iu/mg,收率38.27%;實(shí)施例2中玻璃酸酶精品效價(jià)為354.45iu/mg，收率38.69%。
[0031]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型`，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種提取玻璃酸酶精品的方法，其特征在于，粗品經(jīng)色譜分離、熱原處理、凍干得玻璃酸酶精品，所述玻璃酸酶精品的效價(jià)可以達(dá)到350iu/mg。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: (一)色譜分離 設(shè)定柱流速25L/h，用平衡液平衡色譜分離柱2小時(shí)，粗品溶于少量平衡液后上柱，再分別用平衡液和清洗液各清洗柱子25分鐘，然后用洗脫液洗脫30分鐘，收集溶液，加4倍收集液體積的乙醇沉淀12小時(shí)后離心脫水，轉(zhuǎn)速3700r/min ;其中:平衡液為醋酸鈉1090g,加純化水160L，調(diào)pH3.6后的溶液；清洗液為醋酸鈉220g，加純化水16L，調(diào)pH3.6后的溶液；洗脫液為氯化鈉440g，加純化水15L，調(diào)pH3.6后的溶液； (二)熱原處理: 將上述溶液離心，過(guò)濾，將濾液放冰浴中冷卻，加入15%磷酸三鈉(Na3PO4.12H20)溶液，在不斷攪拌下，緩緩加入20%醋酸鈣(Ca(CH3COO)2 -H2O)溶液，并以NaOH溶液調(diào)ρΗ8.5，離心，收集上清液，之后上清液調(diào)ΡΗ6.5~7.0 ; (三)凍干 將濾液冷凍干燥，即得無(wú)熱原的玻璃酸酶精品。
3.權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，在步驟(一)中，色譜柱流速為25L/h。
4.權(quán)利要求書2所述的 方法，其特征在于，在步驟(一)中，得到收集液后，要加4倍收集液體積的乙醇沉淀12小時(shí)后再離心脫水，其轉(zhuǎn)速為3700r/min。
5.權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，在步驟(一)中，平衡液為醋酸鈉1090g，加純化水160L，調(diào)pH3.6后的溶液。
6.權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，在步驟(一)中，清洗液為醋酸鈉220g，加純化水16L，調(diào)pH3.6后的溶液。
7.權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，在步驟(一)中，洗脫液為氯化鈉440g，加純化水15L，調(diào)pH3.6后的溶液。
8.權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，步驟(二)中的“上述溶液”在過(guò)濾前以及調(diào)pH值至8-9后都要進(jìn)行離心，離心時(shí)間:20分鐘~30分鐘，轉(zhuǎn)速:2700~3200r/min。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK103740677SQ201310643506
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月30日
【發(fā)明者】劉乃山, 宋超龍, 葛翠鳳, 劉振海 申請(qǐng)人:青島康原藥業(yè)有限公司