一種番茄褪綠病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種番茄褪綠病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫檢測方法。本發(fā)明公開的一組引物，由如下（1）-（4）所示的DNA分子組成：（1）SEQ?ID?No.1所示的DNA分子；（2）SEQ?ID?No.2所示的DNA分子；（3）SEQ?ID?No.3所示的DNA分子；（4）SEQ?ID?No.4所示的DNA分子。本發(fā)明公開的一種快速、靈敏、高度特異的檢測番茄褪綠病毒的方法，為該病毒的快速檢測提供了新的手段。
【專利說明】一種番茄褪綠病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種番茄褪綠病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]番爺裡綠病毒(Tomato Chlorosis Virus, ToCV)為長線形病毒科(Closteroviridae)毛型病毒屬(Crinivirus)成員，主要侵染番爺和辣椒,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上造成嚴(yán)重危害。該病毒于1998年在佛羅里達(dá)州首次報(bào)道，然后在法國、意大利、巴西、以色列等世界各地相繼發(fā)現(xiàn)，可侵染番茄等重要農(nóng)作物，在番茄上產(chǎn)生的典型癥狀為發(fā)病初期葉片脈間變黃，后期葉片發(fā)紅，葉脈顏色加深，葉片增厚，極大降低了番茄產(chǎn)量與品質(zhì)。番茄褪綠病毒可通過多種方式傳播，包括種苗調(diào)運(yùn)、粉虱帶毒等。
[0003]目前，ToCV在中國僅有2例報(bào)道，分別為山東和北京，且在山東多個(gè)番茄產(chǎn)區(qū)都已檢測到，該病毒可造成番茄減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)的嚴(yán)重后果。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)最早是由Notomi T等在2000年發(fā)明的，是一種基于高靈敏鏈置換技術(shù)的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其工作原理為:針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)了 4個(gè)特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶-Bst (Bacillus stearothermophilus) DNA polymerase 在恒溫(65°C )的條件下反應(yīng) I小時(shí)即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物既可通過電泳紫外觀察，亦可通過熒光染色直接目測。該方法操作簡便，無需特殊儀器(如PCR儀)，而且檢測結(jié)果準(zhǔn)確，是一種快捷而有效的檢測方法。目前已廣泛應(yīng)用于人類和動植物各種病毒、細(xì)菌、寄生蟲等引起的疾病的檢測和快速診斷。該方法應(yīng)用范圍廣泛，適于基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速檢測。
[0005]由于ToCV為國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的病毒，所以國內(nèi)對于該病毒的研究較少，目前國際上對于該病毒的檢測還僅僅限于分子生物學(xué)檢測方法，其中以RT-PCR最為常見，但是PCR需要30-35個(gè)循環(huán)反應(yīng)(較費(fèi)時(shí))及特殊的儀器(PCR儀)且操作程序繁瑣復(fù)雜、時(shí)間長，對檢測人員有較高的技術(shù)要求，大大限制了作為快速診斷方法的使用和推廣。而LAMP方法很好的克服了當(dāng)前這類方法的不足，LAMP技術(shù)反應(yīng)時(shí)間短，無需特殊儀器，檢測靈敏度高，特異性好，目前尚未見利用LAMP技術(shù)檢測番茄褪綠病毒的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種番茄褪綠病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫檢測方法。
[0007]本發(fā)明提供的一組引物，由如下(I)- (4)所示的DNA分子組成:
[0008](I) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子；
[0009](2) SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子；
[0010](3) SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子；
[0011](4) SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子。
[0012]一種檢測番茄褪綠病毒的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該試劑盒包含所述的引物、反轉(zhuǎn)錄酶和Bst DNA聚合酶；[0013]所述反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶或AMV反轉(zhuǎn)錄酶。
[0014]一種檢測番茄褪綠病毒的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該方法是以待測樣品的總RNA為模板，以所述的引物為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增，若得到逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，則所述待測樣品中候選含有番茄褪綠病毒，若得不到逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，則所述待測樣品中候選不含有番茄褪綠病毒。
[0015]上述方法中，所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增產(chǎn)物是否得到的判斷方法為如下
(I)和 / 或(2):
[0016](I)將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具有彌散狀核酸電泳條帶的待測樣品為含有番茄褪綠病毒的樣品，不具有彌散狀核酸電泳條帶的待測樣品為不含有番茄褪綠病毒的樣品； [0017](2)將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物與SYBR Green I反應(yīng)得反應(yīng)液，反應(yīng)液呈翠綠色的待測樣品候選為含有番茄褪綠病毒的樣品，反應(yīng)液呈橙色的待測樣品候選為不含有番茄褪綠病毒的樣品。
[0018]上述任一所述的方法中，所述引物中SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子為外引物，SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子為內(nèi)引物；
[0019]所述外引物中SEQ ID N0.1所示的DNA分子與SEQ ID N0.2所示的DNA分子在所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的摩爾濃度比為1:1 ；
[0020]所述內(nèi)引物中SEQ ID N0.3所示的DNA分子與SEQ ID N0.4所示的DNA分子在所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的摩爾濃度比為1:1。
[0021]所述外引物與所述內(nèi)引物在所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的摩爾濃度比具體為1:4。
[0022]上述任一所述的方法中，所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的反應(yīng)溫度為60°C。
[0023]上述任一所述的方法中，所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的反轉(zhuǎn)錄酶的濃度為8U/ μ L ；
[0024]所述反轉(zhuǎn)錄酶的商品名稱具體為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，購自TaKaRa公司，產(chǎn)品目錄號為 2641Α。
[0025]上述任一所述的方法中，所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的體系如下:
[0026]IOXThermopol buffer2.5 μ L, SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子 0.2 μ M，SEQ ID N0.2所示的DNA分子0.2 μ M，SEQ ID N0.3所示的DNA分子0.8 μ M，SEQ ID N0.4所示的DNA分子0.8 μ M，dNTPs2.5mM, MgCl24mM,反轉(zhuǎn)錄酶200U，Bst DNA聚合酶12U，所述待測樣品的總RNA40ng,余量為 ddH20，體系 25 μ L ;
[0027]所述IOXThermopol buffer購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號為 M0275 ；
[0028]所述反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶或AMV反轉(zhuǎn)錄酶；
[0029]所述Bst DNA聚合酶的商品名稱為Bst DNApolymerase,購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號為M0275 ;
[0030]所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:60°C恒溫Ih ；80°C 5min。
[0031]上述任一所述的方法中，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa公司，產(chǎn)品目錄號為2641A ；
[0032]所述樣品具體為待測樣品的葉片。
[0033]上述引物在檢測番茄褪綠病毒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0034]和/ 或，
[0035]上述試劑盒在檢測番茄褪綠病毒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0036]本發(fā)明建立的一種快速、靈敏、高度特異的檢測番茄褪綠病毒的方法，為該病毒的快速檢測提供了新的手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為RT-LAMP方法檢測番茄褪綠病毒的引物篩選電泳結(jié)果。
[0038]圖2為RT-LAMP方法檢測番茄褪綠病毒的引物篩選熒光染色結(jié)果。
[0039]圖3為RT-LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果電泳檢測。
[0040]圖4為RT-LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果熒光染色檢測。
[0041]圖5為電泳分析RT-LAMP方法檢測番茄褪綠病毒的特異性。
[0042]圖6為熒光染色分析RT-LAMP方法檢測番茄褪綠病毒的特異性。
[0043]圖7為電泳分析RT-LAMP方法檢測番茄褪綠病毒的靈敏性。
[0044]圖8為熒光染色分析RT-LAMP方法檢測番茄褪綠病毒的靈敏性。
【具體實(shí)施方式】
[0045]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0046]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0047]未感染任何病毒的番茄、感染番茄褪綠病毒的番茄、感染CMV (黃瓜花葉病毒)的番茄和感染TMV (煙草花葉病毒)的番茄均采自中國壽光，采集樣品保存于_80°C冰箱中。
[0048]Bst DNApolymerase購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號為M0275。
[0049]M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa公司，產(chǎn)品目錄號為2641A。
[0050]dNTPs購自TaKaRa公司，產(chǎn)品目錄號為4019。
[0051]SYBR Green I 購自 Invitrogen 公司。
[0052]IOXThermopol buffer購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號為M0275。
[0053]實(shí)施例1、番茄褪綠病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法
[0054]一、引物設(shè)計(jì):
[0055]根據(jù)NCBI上已報(bào)道的番茄褪綠病毒核酸序列，利用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V4設(shè)計(jì)6套特異引物，引物序列如下:
[0056]第一組引物:
[0057]F3:5 ’ - CCGGTCTTATTAAGCCTGAT-3，；
[0058]B3:5，-GCAACCAGTTATCGATGCA-3 ’ ；
[0059]FIP: 5 ’ -CATCTGAGATATTCATCAACGAACC-TCAAACATGGCGTATTACCAAG-3，；
[0060]BIP: 5’ -CTCGAACCTGCTTATGAAAAGAAAC-GTTAACGTTGTACAGTTCCTTGCC-3，。
[0061]第二組引物:[0062]F3:5 ’ -GGTTCGTTGATGAATATCTCAGATG-3’ ；
[0063]B3:5，-TAATAGAAACCCCCACCG-3，；
[0064]FIP: 5，-ACAGTTCCTTGCCCTCGTTA-ACTTATCTCGAACCTGCT-3，；
[0065]BIP: 5’ -ACAACGTTAACCAACTTGCATC-GAGATCCTCTTGATCCTCAT-3，。
[0066]第三組引物:
[0067]F3:5，-AAGGACGACATAATGCGG-3，；
[0068]B3:5，-GCATTTTCGTAGACAAGACTCT-3 ’ ；
[0069]FIP: 5，-ACTTTGGGAAAAGTCCCACCTT-GATGGTAAGACCAATTCAGCT-3，；
[0070]BIP: 5’ -ATCCCATCTACAATGATGTCAACC-TTCATAACCTCCGTGTGTC-3，。
[0071]第四組引物:
[0072]F3:5 ’ -CCCATCTACAATGATGTCAAC-3，；
[0073]B3:5，-CTCGAAAAAGTGTCAGGAAT-3，；
[0074]FIP: 5 ’ -CGTGCATTTTCGTAGACAAGAC-CGTGGTTAGTATATCCAGACA-3，；
[0075]BIP: 5’ -GGTTGCTGATCATATCATAAGGGA-TGGTCAACCGATAAGTGTT-3，。
[0076]第五組引物:
[0077]F3:5，-CTGCCTCATCTCA`TTTGATG-3’ ；(SEQ ID N0.1)
[0078]B3:5，-GTTTCATACTGTCCGGTCT-3，；(SEQ ID N0.2)
[0079]FIP: 5，-GTTCTGTGCAAAAATTGCATCC-GTCAACGATTTTATGTCAGTGG-3，；(SEQ ID N0.3)
[0080]BIP:5，-ACCTGTTGAGAAGATGGTCCTT-GCCAAGAATTTTCGAGACA-3，。(SEQ ID N0.4)
[0081]第六組引物:
[0082]F3:5，-CGGTTGACCATTGAAGGT-3 ’ ；
[0083]B3:5，-GACCATCTTCTCAACAGGT-3 ’ ；
[0084]FIP: 5 ’ -GACCACTGACATAAAATCGTTGACT-CTGACACTTTTTCGAGACCT-3，；
[0085]BIP: 5，-AACCCGGGATTAGCTTGGAT-GGCATGTCAAAATCACCATAC-3，。
[0086]二、提取感染番茄褪綠病毒的番茄葉片的總RNA為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)提取未感染任何病毒的番茄葉片的總RNA為陰性對照組。
[0087]三、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(RT-LAMP)反應(yīng)
[0088]反應(yīng)體系如下:
[0089]IOXThermopol buffer2.5 μ L (20mM Tris-HCl, IOmM KCl，2mM MgSO4,IOmM(NH4)2SO4,體積百分含量 0.1% 的 Triton X-100)，10 μ M 的引物(F3 和 Β3)各 0.5 μ L，ΙΟμΜ的弓 I 物(FIP 和 BIP)各 2.0 μ L，IOmM 的 dNTPs2.5 μ L，25mM 的 MgCl24 μ L，200U/μ L 的M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.5μ L，8000U/mL 的 Bst DNApolymerasel.5 μ L, 20ng/uL 的模板RNA2.0μ L，ddH20 補(bǔ)足體系至 25 μ L。
[0090]反應(yīng)條件:60°C恒溫Ih ；80°C 5min。
[0091]模板RNA分別為步驟二提取的實(shí)驗(yàn)組或陰性對照的總RNA。
[0092]經(jīng)過上述反應(yīng)得到實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。
[0093]四、RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測
[0094](一)電泳檢測:分別取5μ L實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠在0.5 X TBE緩沖液和155V電壓條件下電泳25min，將凝膠在0.5 μ g/mL的溴化乙錠(EB)中染色lOmin，染色后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。
[0095]結(jié)果如圖1所示。
[0096]圖1中，M:Trans2K Plus DNA Marker, 1-6依次為6組引物檢測感染番茄褪綠病毒的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，7-12依次為6組引物檢測未感染任何病毒的番茄(陰性對照組)的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。
[0097]圖1表明，在以感染番茄褪綠病毒的番茄的葉片的總RNA為模板的6組引物中，可以觀察到第5組引物的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物呈彌散狀的核酸泳帶，而其余5組引物的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物則沒有彌散狀核酸電泳帶，在以未感染任何病毒的番茄的葉片的總RNA為模板的6組引物的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中均無核酸電泳條帶。
[0098](二)熒光染料檢測:分別向20 μ L體積實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入 2.5yL SYBR Green 1(1: 1000) (1:1000 是指按照取 I μ L SYBR Green I 加入999 μ L ddH20的比例稀釋SYBR Green I)，染色5min后觀察結(jié)果。
[0099]結(jié)果如圖2所示。
[0100]圖2中，1-6依次為6組引物檢測感染番茄褪綠病毒的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的熒光染色結(jié)果，7-12依次為6組引物檢測未感染任何病毒的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物(陰性對照組)的熒光染色結(jié)果。 [0101]圖2表明，在以感染番茄褪綠病毒的番茄葉片的總RNA為模板的6組引物中，可以觀察到第5組引物的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物染色后呈翠綠色，反應(yīng)為陽性，而其余5組引物的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物以及以未感染任何病毒的番茄葉片的總RNA為模板的6組引物的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物保持染料的橙色，反應(yīng)為陰性。
[0102]實(shí)施例2、RT-LAMP檢測體系的優(yōu)化
[0103]通過實(shí)例I可以篩選出最優(yōu)的引物為第五組引物，但是第五組引物的核酸電泳條帶不是十分清晰，所以通過對構(gòu)建體系的主要影響的兩個(gè)因素M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶濃度和內(nèi)外引物濃度比篩選，確定最優(yōu)檢測體系。
[0104]反應(yīng)體系(25 μ L)如下:
[0105]A: 10 X Thermopol buffer2.5 μ L (20mM Tri s-HCl, IOmM KCl，2mM MgSO4,I OmM (NH4)2SO4，體積百分含量0.1%的Triton X-100)，第五組引物中ΙΟμΜ的引物(F3和Β3)各為0.5 μ L，第五組引物中ΙΟμΜ的引物(FIP和BIP)各為2.5 μ L，dNTPs2.5mM,MgCl24mM，200U/μ L M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μ L，8000U/mL 的 Bst DNApolymerasel.5 μ L, 20ng/μ L的模板RNA2.0 μ L，ddH20補(bǔ)足體系至25 μ L ;
[0106]B:10 X Thermopol buffer2.5 μ L (20mM Tri s-HCl, IOmM KCl，2mM MgSO4,I OmM (NH4)2SO4，體積百分含量0.1%的Triton X-100)，第五組引物中ΙΟμΜ的引物(F3和Β3)各為0.5 μ L，第五組引物中ΙΟμΜ的引物(FIP和BIP)各為2.0 μ L，dNTPs2.5mM,MgCl24mM，200U/μ L M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 1.0 μ L，8000U/mL 的 Bst DNApolymerasel.5 μ L, 20ng/μ L的模板RNA2.0 μ L，ddH20補(bǔ)足體系至25 μ L ;
[0107]C:10 X Thermopol buffer2.5 μ L (20mM Tri s-HCl, IOmM KCl，2mM MgSO4,I OmM (NH4)2SO4，體積百分含量0.1%的Triton X-100)，第五組引物中ΙΟμΜ的引物(F3和Β3)各為0.5 μ L，第五組引物中ΙΟμΜ的引物(FIP和BIP)各為2.5 μ L，dNTPs2.5mM,MgCl24mM，200U/μ L M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 1.0 μ L，8000U/mL 的 Bst DNApolymerasel.5 μ L, 20ng/μ L的模板RNA2.0 μ L，ddH20補(bǔ)足體系至25 μ L ;
[0108]D:10 X Thermopol buffer2.5 μ L (20mM Tri s-HCl, IOmM KCl，2mM MgSO4,I OmM (NH4)2SO4，體積百分含量0.1%的Triton X-100)，第五組引物中ΙΟμΜ的引物(F3和Β3)各為0.5 μ L，第五組引物中ΙΟμΜ的引物(FIP和BIP)各為2.0 μ L，dNTPs2.5mM,MgCl24mM，200U/μ L M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μ L，8000U/mL 的 Bst DNApolymerasel.5 μ L, 20ng/μ L的模板RNA2.0 μ L，ddH20補(bǔ)足體系至25 μ L。
[0109]提取感染番茄褪綠病毒的番茄葉片的總RNA為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)提取未感染任何病毒的番茄葉片的總RNA為陰性對照組，以各樣品的RNA為模板分別進(jìn)行上述反應(yīng)，得到RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。
[0110]反應(yīng)條件:60°C恒溫Ih ；80°C 5min。
[0111]RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測如實(shí)施例1中步驟四。
[0112]電泳檢測結(jié)果如圖3所示。
[0113]圖3中，M:Trans2K Plus DNA Marker, 1-4依次為以感染番茄褪綠病毒的番茄葉片的總RNA為模板，在A、B、C和D的體系中進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物，5-8依次為以未感染任何病毒的番茄葉片(陰性對照組)的總RNA為模板，在A、B、C和D的體系中進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物。
[0114]圖3表明，以感染番茄褪綠病毒的番茄的總RNA為模板的B體系得到的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物呈明亮的彌散狀核酸電泳帶，A體系的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的核酸電泳帶較弱，C和D體系的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的核酸電泳帶不清晰，陰性對照組中均無核酸電泳帶。
[0115]熒光染色檢測結(jié)果如圖4所示。
[0116]圖4中，1-4依次為以感染番茄褪綠病毒的番茄的總RNA為模板，在A、B、C和D的體系中進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物的熒光染色結(jié)果，5-8依次為以未感染任何病毒的番茄(陰性對照組)的總RNA為模板，在A、B、C和D的體系中進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物的熒光染色結(jié)果。
[0117]圖4表明，以感染番茄褪綠病毒的番茄的總RNA為模板，在A、B、C和D的體系中進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物的熒光染色結(jié)果均呈現(xiàn)翠綠色，反應(yīng)為陽性，其中B體系的RT-LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物的翠綠色熒光最強(qiáng)，以未感染任何病毒的番茄(陰性對照組)的總RNA為模板，在A、B、C和D的體系中進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的熒光染色結(jié)果均呈橙色，反應(yīng)為陰性。
[0118]以上結(jié)果說明B體系為最優(yōu)體系。
[0119]實(shí)施例3、RT-LAMP方法檢測番茄褪綠病毒的特異性
[0120]提取感染番茄褪綠病毒的番茄、感染CMV (黃瓜花葉病毒)的番茄、感染TMV (煙草花葉病毒)的番茄和未感染任何病毒的番茄樣品(陰性對照)的葉片的總RNA，按實(shí)施例2的方法采用B體系對各組樣品進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。
[0121]電泳檢測結(jié)果如圖5所示。
[0122]圖5中，M為DNA marker ;泳道I為感染番茄褪綠病毒的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道2為感染CMV (黃瓜花葉病毒)的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道3為感染TMV (煙草花葉病毒)的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道4為陰性對照組的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。
[0123]圖5表明，感染番茄褪綠病毒的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物可以觀察到明亮的呈彌散狀的核酸泳帶，而未感染番茄褪綠病毒的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物均沒有核酸電泳條帶。
[0124]熒光染色檢測結(jié)果如圖6所示。
[0125]圖6中，I為感染番茄褪綠病毒的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的熒光染色結(jié)果；2為感染CMV (黃瓜花葉病毒)的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的熒光染色結(jié)果；3為感染TMV (煙草花葉病毒)的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的熒光染色結(jié)果；4為陰性對照組的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的熒光染色結(jié)果。
[0126]圖6表明，感染番茄褪綠病毒的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物熒光染色結(jié)果均呈現(xiàn)翠綠色，反應(yīng)為陽性，其他未感染番茄褪綠病毒的番茄的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物熒光染色結(jié)果均呈橙色，反應(yīng)為陰性。
[0127]結(jié)果表明，按實(shí)施例2的方法采用B體系能夠特異地檢測番茄褪綠病毒，且與其它病毒無交叉反應(yīng)。 [0128]實(shí)施例4、RT-LAMP方法檢測番茄褪綠病毒的靈敏性
[0129]提取感染番茄褪綠病毒的番茄葉片的總RNA，RNA濃度為20ng/ μ L，用ddH20將提取的RNA作IO1-1O8的倍比稀釋，制成不同濃度的RNA。按照實(shí)施例2的方法采用B體系對各濃度的RNA以及ddH20 (作為空白對照)進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。
[0130]電泳檢測結(jié)果如圖7所示。
[0131]圖7中，M為DNA marker ;泳道I為10倍稀釋組；泳道2為IO2倍稀釋組；泳道3為IO3倍稀釋組；泳道4為IO4倍稀釋組；泳道5為IO5倍稀釋組；泳道6為IO6倍稀釋組；泳道7為IO7倍稀釋組；泳道8為IO8倍稀釋組；泳道9為空白對照組。
[0132]圖7表明，以各稀釋度的感染番茄褪綠病毒的番茄的RNA為模板進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物均可以觀察到明亮的呈彌散狀的核酸泳帶，而空白對照組沒有核酸電泳條帶。
[0133]熒光染色檢測結(jié)果如圖8所示。
[0134]圖8中，I為10倍稀釋組；2為IO2倍稀釋組；3為IO3倍稀釋組；4為IO4倍稀釋組；5為IO5倍稀釋組；6為IO6倍稀釋組；7為IO7倍稀釋組；8為IO8倍稀釋組；9為空白對照組。
[0135]圖8表明，當(dāng)20ng/l.! L的感染番茄褪綠病毒的番茄葉片的總RNA在稀釋IO8倍時(shí)，按實(shí)施例2的方法采用B體系進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物SYBR Green I染色后，還能呈現(xiàn)特異的翠綠色熒光，說明采用實(shí)施例2的RT-LAMP方法采用B體系進(jìn)行檢測番茄褪綠病毒靈敏性很高。
【權(quán)利要求】
1.一組引物，由如下(I) - (4)所示的DNA分子組成: (1)SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子； (2)SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子； (3)SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子； (4)SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子。
2.一種檢測番茄褪綠病毒的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物、反轉(zhuǎn)錄酶和Bst DNA聚合酶； 所述反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶或AMV反轉(zhuǎn)錄酶。
3.—種檢測番茄褪綠病毒的方法，該方法是以待測樣品的總RNA為模板，以權(quán)利要求1所述的引物為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增，若得到逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，則所述待測樣品中候選含有番茄褪綠病毒，若得不到逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，則所述待測樣品中候選不含有番茄褪綠病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增產(chǎn)物是否得到的判斷方法為如下(I)和/或(2): (1)將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具有彌散狀核酸電泳條帶的待測樣品為含有番茄褪綠病毒的樣品，不具有彌散狀核酸電泳條帶的待測樣品為不含有番茄褪綠病毒的樣品； (2)將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫`核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物與SYBRGreen I反應(yīng)得反應(yīng)液，反應(yīng)液呈翠綠色的待測樣品候選為含有番茄褪綠病毒的樣品，反應(yīng)液呈橙色的待測樣品候選為不含有番茄褪綠病毒的樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述權(quán)利要求1所述的引物中SEQIDN0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子為外引物，SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子為內(nèi)引物； 所述外引物中SEQ ID N0.1所示的DNA分子與SEQ ID N0.2所示的DNA分子在所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的摩爾濃度比為1:1 ; 所述內(nèi)引物中SEQ ID N0.3所示的DNA分子與SEQ ID N0.4所示的DNA分子在所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的摩爾濃度比為1:1。 所述外引物與所述內(nèi)引物在所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的摩爾濃度比具體為1:4。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的方法，其特征在于:所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的反應(yīng)溫度為60 V。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一所述的方法，其特征在于:所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的反轉(zhuǎn)錄酶的濃度為8υ/μ L ; 所述反轉(zhuǎn)錄酶的商品名稱具體為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，購自TaKaRa公司，產(chǎn)品目錄號為2641Α。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7任一所述的方法，其特征在于:所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的體系如下:
IOXThermopol buffer2.5 μ L, SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子 0.2 μ M，SEQ ID N0.2 所示的DNA分子0.2 μ M，SEQ ID N0.3所示的DNA分子0.8 μ M，SEQ ID N0.4所示的DNA分子0.8 μ M，dNTPs2.5mM, MgCl24mM,反轉(zhuǎn)錄酶200U，Bst DNA聚合酶12U，所述待測樣品的總RNA40ng,余量為 ddH20，體系 25 μ L ; 所述IOXThermopol buffer購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號為M0275 ； 所述反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶或AMV反轉(zhuǎn)錄酶； 所述Bst DNA聚合酶的商品名稱為Bst DNApolymerase,購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司，產(chǎn)品目 錄號為M0275 ； 所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:60°C恒溫Ih ；80°C 5min。
9.根據(jù)權(quán)利要求3-8任一所述的方法，其特征在于:所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa公司，產(chǎn)品目錄號為2641A ； 所述樣品具體為待測樣品的葉片。
10.權(quán)利要求1所述的引物在檢測番茄褪綠病毒中的應(yīng)用； 和/或， 權(quán)利要求2所述的試劑盒在檢測番茄褪綠病毒中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK103667530SQ201310645611
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】竺曉平, 趙黎明, 李剛 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)