一種高胰島素型肥胖基因體質(zhì)評估的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高胰島素型肥胖基因體質(zhì)評估方法，其特征在于，通過同時檢測分析個體的LEP基因、LEPR基因、IL-6基因、ADIPOQ基因SNPs位點基因攜帶型為所有的受檢者提供高胰島素型肥胖體質(zhì)評估，可以讓受檢者在考慮以飲食和運動方式進行瘦身之前，先了解自身基因體質(zhì)情況，了解個人的肥胖潛能成因，選擇最適合的個體化營養(yǎng)及運動瘦身方式，將各種肥胖基因表現(xiàn)的型態(tài)一一擊破，達到最有效健康的減重效果。
【專利說明】一種高胰島素型肥胖基因體質(zhì)評估的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高胰島素型肥胖基因體質(zhì)評估方法，可用于評估高胰島素型肥胖基因體質(zhì)情況，針對性的提示受檢者根據(jù)遺傳體質(zhì)選擇不同的減肥策略，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]肥胖癥是一種熱量代謝障礙，攝入熱量超過消耗的熱量，引起體內(nèi)脂肪積聚過多所致。一般認為超過按身高所測標準體重20%即可成為肥胖。肥胖癥是一種與遺傳因素及生活方式密切相關(guān)的慢性疾病，它會引發(fā)血脂升高，容易造成脂肪肝、動脈血管病變、心臟病、糖尿病，肥胖的兒童還會引發(fā)性功能發(fā)育不良并導(dǎo)致成人期各種疾病發(fā)病率和死亡率上升。因此，若通過有效的方法來預(yù)防，就能避免過早地出現(xiàn)高血壓、冠心病、糖尿病、腦血管病等疾患，從而提聞人們的生存質(zhì)量。
[0003]由于至少有40%軀體脂肪量的差異是由遺傳因素引起的，所以很容易明確遺傳對肥胖有很大影響。遺傳體質(zhì)不同的人在患肥胖癥時應(yīng)采取不同的減肥策略，利用現(xiàn)代科學(xué)研究成果，開發(fā)一項基于分子遺傳基礎(chǔ)的體重管理分子檢測產(chǎn)品會對減肥者的減肥計劃提供基因減肥概念的個性化體重管理建議，具有較強的社會意義和市場前景。目前肥胖癥的臨床治療方法主要是飲食和運動療法，但存在著碳水化合物、脂肪以及蛋白質(zhì)攝入量控制“一刀切”和盲目采用減肥藥物的非個體化治療方式。原因主要在于無法明確地將患者區(qū)分成為不同的減重體質(zhì)，從而對不同患者是否需要嚴格控制碳水化合物的攝入，是否需要控制脂肪的攝入，是否需 要使用減肥藥物，以及應(yīng)該使用哪類減肥藥物的治療措施選擇上沒有明確指導(dǎo)。
[0004]高胰島素型肥胖約占肥胖病患55%的比例，在所有肥胖病患中排名第一！胰島素作用在于降低血糖，促進脂肪合成。在正常情況下，多余的血糖會被胰島素掃除，迅速進入饑餓的身體細胞中，被作為能量燃燒掉。如果您胰島素相關(guān)基因變異，血糖的升降導(dǎo)致了胰島素不能正常發(fā)揮作用。
[0005]研究發(fā)現(xiàn)，高胰島素型肥胖相關(guān)基因變異對碳水化合物制品的基礎(chǔ)代謝率功能差，影響細胞脂肪代謝，導(dǎo)致熱量的代謝緩慢，使細胞囤積脂肪造成肥胖。現(xiàn)代人過于精致的飲食，比如蛋糕、西點面包、巧克力、糖果、甜份過高的飲料等等；最容易被一般人所忽略的水果中所含的高糖分，這些食物都很容易使得胰島素快速升高，造成脂肪合成增加；東方人主食大多為淀粉類食物，沒有吃到飯或面往往會有一種沒吃飽的感覺。高胰島素型基因變異者，飲食重點在于食物的GI值。低GI值的食物在攝食后，使胰島素上升的速度較慢且上升的幅度較小，如能以此為飲食原則，可減緩胰島素升高的速度，使血糖維持穩(wěn)定。
[0006]研究發(fā)現(xiàn)LEP，LEPR，IL6、ADIPOQ基因與高胰島素型肥胖體質(zhì)有關(guān)。
[0007]瘦素(LEP)，是肥胖(ob)基因的產(chǎn)物，由146aa組成的單鏈蛋白質(zhì)，分子量為IBkDa0瘦素主要由脂肪組織產(chǎn)生，在食欲控制、脂肪代謝和體重調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。瘦素主要作用在種屬神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是下丘腦來影響食物攝取。瘦素的生物學(xué)作用是通過其受體來實現(xiàn)的，它的受體只要表達在下丘腦。在人類，瘦素的水平與身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)和脂肪含量百分比有關(guān)，在肥胖個體中，瘦素水平是增加的。瘦素具有雙重作用，它在降低食欲的同時增加能量消耗，導(dǎo)致更多的脂肪燃燒。瘦素的分泌是遵循人體生理周期的，也就是說，在肥胖和瘦的個體中，瘦素的水平在夜間升高。肥胖基因的突變會導(dǎo)致瘦素缺乏，從而引起肥胖。內(nèi)源性的瘦素可以標準化人的體重，相反個體對內(nèi)源性瘦素的不敏感則導(dǎo)致肥胖病人體內(nèi)的瘦素水平升高。其它導(dǎo)致肥胖的因子可能影響瘦素的作用:如胰島素、糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺類和性激素。
[0008]LEPRQeptin receptor)為瘦素受體編碼基因，由該基因編碼的蛋白可以識別和轉(zhuǎn)運重要的肥胖相關(guān)蛋白瘦素，調(diào)節(jié)人體的體重、能量代謝和免疫應(yīng)答等通路，并最終控制的超重或者肥胖的發(fā)生或者抑制。國內(nèi)外的眾多研究表明LEPR基因上的多態(tài)現(xiàn)象與血糖、胰島素、血清瘦素、甘油三脂等因素相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，生活方式干預(yù)(低熱卡飲食和運動)3個月后，攜帶Lys656/Lys656基因型者較攜帶Lys656/Asn656和Asn656/Asn656基因型者體重、體重指數(shù)、體脂、腰圍、收縮壓和血瘦素水平顯著下降。
[0009]IL-6是一種多功能細胞因子，參與多種細胞的生長、分化和功能調(diào)節(jié)，在免疫和炎癥反應(yīng)中具有重要作用，是機體重要的免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子。其功能的多樣性于許多細胞表面有IL-6受體的表達，IL-6受體和信號傳導(dǎo)部分GP130將多種生物信號傳給不同的組織和細胞。IL-6可由T細胞、B細胞、單核細胞和非淋巴細胞產(chǎn)生，其基因表達的變化與某些疾病的病理生理和病理變化密切相關(guān)。IL-6的表達狀況受基因調(diào)控，特別是IL-6的基因調(diào)控區(qū)與IL-6的表達具有更自接的關(guān)系；其血清水平的變化與一些疾病的病理生理過程密切相關(guān)。攜帶風(fēng)險基因型時白細胞介素6表達增加，引起胰島素抵抗，導(dǎo)致糖尿病易感性增加。
[0010]ADIPOQ 為 adiponectin,ClQ and collagen domain containing(脂聯(lián)蛋白的 ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域)編碼基因，它編碼一種在結(jié)構(gòu)上與膠原X和VIII以及補體Clq類似的蛋白質(zhì)。這種基因主要在脂肪組織中表達，所編碼的蛋白質(zhì)在血液中循環(huán)，并且和代謝以及激素產(chǎn)生過程有關(guān)。ADIPOQ突變或`異常表達等都會引起血漿脂聯(lián)素濃度偏低，易導(dǎo)致胰島素敏感性下降，脂肪酸氧化減少，從而導(dǎo)致肥胖。
[0011]目前的基礎(chǔ)研究已能從理論上證明基因分型檢測可以用于判斷肥胖體質(zhì)的類型，而且檢測方法簡便、檢測成本在可接受程度中、檢測結(jié)果可信。因此，基因分型檢測用于評估肥胖體質(zhì)的可行性是明確的。根據(jù)基因檢測結(jié)果結(jié)合體重管理測評系統(tǒng)建立個性化體重健康評估報告，有針對的解決體重控制問題，提高人們生活質(zhì)量。因此利用現(xiàn)有科學(xué)、技術(shù)研究成果來開發(fā)這樣一個產(chǎn)品，時機是成熟的。
[0012]本發(fā)明的目的是提供一種高胰島素型肥胖基因體質(zhì)評估方法，可以讓受檢者在考慮以飲食和運動方式進行瘦身之前，先了解自身基因體質(zhì)情況，了解個人的肥胖潛能成因，選擇最適合的個體化營養(yǎng)及運動瘦身方式，將各種肥胖基因表現(xiàn)的型態(tài)一一擊破，達到最有效健康的減重效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的是提供一種高胰島素型肥胖基因體質(zhì)評估方法，可以讓受檢者在考慮以飲食和運動方式進行瘦身之前，先了解自身基因體質(zhì)情況，了解個人的肥胖潛能成因，選擇最適合的個體化營養(yǎng)及運動瘦身方式，將各種肥胖基因表現(xiàn)的型態(tài)一一擊破，達到最有效健康的減重效果。
[0014] 為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供一種高胰島素型肥胖基因體質(zhì)評估方法。其具體步驟為:
步驟1:檢測的樣品類型與采樣方法
用采樣拭在口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮40次以上，以保證采集到足量的細胞樣本； 步驟2:基因組DNA的抽提方法
采用硅膠吸附法抽提每一個口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時一 2.5小時，經(jīng)電泳檢測后，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進入下一步檢測；
步驟3:熒光定量PCR反應(yīng)
將每一個被測者樣本分別放入4個反應(yīng)孔，同時檢測4個位點，即瘦素(LEP)rsl3306517 ;瘦素受體(LEPR) rsl805094 ;白介素 6 (IL-6) rsl800795 ;脂聯(lián)素(ADIPOQ)rs2241766,另外根據(jù)實驗需要增設(shè)不含DNA模版的NTC空白對照孔；
每一個反應(yīng)孔的基因分型可以根據(jù)下表的引物和探針設(shè)計，采用TaqMan?_MGB技術(shù)，進行檢測試劑合成；
在每一個反應(yīng)孔中加入試劑為熒光定量PCR反應(yīng)體系，總體積為IOMl,即濃度為20ng/m的DNA模板2W ,m IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液ABI Taqman ? MGB、0.1W 25mMd NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0.5W 25mM MgCl2溶液、0.02W (5unitsM)TaqDNA聚合酶、去離子水4.98W、4個位點分別采用不同的正向引物(20剛，0.225W )、反向弓丨物(20剛，0.225|^1)、￥1(:熒光探針(10剛，0.25W )和FAM熒光探針(10剛，0.25W)工具進行檢測，基因序列及其引物探針如下:
瘦素(LEP) rsl3306517
aataatcctc tttctaaggg gatgcatttc attaatacat atgtagatca tgaattgtct
ttgactttga ggggatggta gccagagcag aaagcaaagc tgattttcat ccccgtctgg
taatgtggtt ggtaatgtga agatgggtgt attctgagat accggctcct tgcagtgtgt
ggttccttct gttttcaggc ccaagaagcc catcctggga aggaaaatgc attggggaac
cctgtgcgga ttcttgtggc tttggcccta tcttttctat gtccaagctg tgcccatcca
naaagtccaa gatgacacca aaaccctcat caagacaatt gtcaccagga tcaatgacat
ttcacacacg gtaaggagag tatgcgggga caaagtagaa ctgcagccag cccagcactg
gctcctagtg gcactggacc cagatagtcc aagaaacatt tattgaacgc ctcctgaatg
ccaggcacct actggaagct gagaaggatt tgaaagcaca gggctccact ctttctggtt
gtttcttttg gcccctctgc ctgctgagat tccaggggtt agtggttcta attctaaacc
帶Vic熒光A型探針 CCAaAAAGTCCAA
帶FAM熒光G型探針 CCAgAAAGTCCAA
正向引物 CTTCTGITITCAGGCCCAAG
反向引物 CTTTGTCCCCGCATACTCTC
瘦素受體(LEPR) rs 1805094
tgacttgaag gagtttacaa tccaagccta attgtgacta tttctgaagg cagagaacacagaatcagtt ctcttaattt tggaatagtg ttaaggttta aaataaaatg tacttcagggccctttagat acatatgtgt tggtaatgat caatctaatg ctttgactta ttttacagat
gtatgaggtt tatgatgcaa aatcaaaatc tgtcagtctcccagttccag acttgtgtgc
agtctatgct gttcaggtgc gctgtaagag gctagatgga ctgggatattggagtaattg
gagcaatcca gcctacacag ttgtcatgga tataaaaggtctgcagagattttgtaaatg
tgttttgaaa gtgcataagt gtgtgcttca aatatggctg aaaagtatttcttcaaaaac
atatacacaa cttgtcattt tgcagttcct atgagaggacctgaattttg gagaataatt
aatggagata ctatgaaaaa ngagaaaaat gtcactttactttggaaggtattcccaatt
ttaatattaa tcttaaattg tatttttata ctcttaaaaa tttacttcatggtccataat
cctgttatta atcttcggaa agctcaacaa tcctgtattttcattgcatttatgagatgtatttaaagag agctaagatg tacagtggct gaagcactgg catagtgtta ggagactttc
attctcttct tagcttcaca tattatagtt acgtcagtactatttgggca aagttacttagactctttgg gcctcagttt tctcatctgt gtaaatgtaa tattgaacta gatgataggc
agtgtttctt ggagtctaa a aattgtattc atatttaatcctgaacaatg taaatgtcac
cttccccgca caccccaagg gcatctaaca catgacagag tattccatttatgtgatggcataaaaacag tggatagtcc catatatgat ggctgtttag帶VIC熒光C型探針 AAAcGAGAAAAAT帶FAM熒光G型探針 AAAgGAGAAAAAT正向引物 TGAGAGGACCTGAAITITGGA反向引物 TGCTTCAGCCACTGTACATCTT白介素 6 (IL-6)rsl800795
agaagccacg cggtggcaaa aaggagtcac acactccacctggagacgccttgaagtaac
tgcacgaaat ttgaggatgg ccaggcagtt ctacaacagccgctcacagg gagagccaga
acacagaaga actcagatga ctggtagtat taccttcttcataatcccag gcttgggggg
ctgcgatgga gtcagaggaa actcagttca gaacatctttggtttttaca aatacaaatt
aactggaacg ctaaattcta gcctgttaat ctggtcactg aaaaaaaatttttttttttt
caaaaaacat agctttagct tatttttttt ctctttgtaa aacttcgtgcatgacttcag
ctttactctt tgtcaagaca tgccaaagtg ctgagtcactaataaaagaa aaaaagaaag
taaaggaaga gtggttctgc ttcttagcgc tagcctcaatgacgacctaa gctgcacttt
tccccctagt tgtgtcttgc natgctaaag gacgtcacattgcacaatcttaataaggtt
tccaatcagc cccacccgct ctggccccac cctcaccctccaacaaagatttatcaaatg
tgggattttc ccatgagtct caatattaga gtctcaacccccaataaata taggactgga
gatgtctgag gctcattctg ccctcgagcc caccgggaacgaaagagaag ctctatctcc
cctccaggag cccagctatg actccttctc cacaagtaag tgcaggaaatccttagccct
ggaactgcca gcggcggtcg agccctgtgt gagggagggg tgtgtggcccagggagggct
ggcgggcggc cagcagcaga ggcaggctcc cagctgtgctgtcagctcacccctgcgctc
gctcccctcc ggcacaggcg ccttcggtcc agttgccttctccctggggctgctcctggtgttgcctgct gccttccctg ccccagtacc cccaggagaa帶Vic熒光C型探針 TGCcATGCTAAAG
【權(quán)利要求】
1.一種高胰島素型肥胖基因體質(zhì)評估方法，其特征在于，具體步驟為 步驟1:檢測的樣品類型與采樣方法 用采樣拭在口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮40次以上，以保證采集到足量的細胞樣本； 步驟2:基因組DNA的抽提方法 采用硅膠吸附法抽提每一個口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時一 2.5小時，經(jīng)電泳檢測后，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進入下一步檢測； 步驟3:熒光定量PCR反應(yīng) 將每一個被測者樣本分別放入4個反應(yīng)孔，同時檢測4個位點，即瘦素(LEP)rsl3306517 ;瘦素受體(LEPR) rsl805094 ;白介素 6 (IL-6) rsl800795 ;脂聯(lián)素(ADIPOQ)rs2241766,另外根據(jù)實驗需要增設(shè)不含DNA模版的NTC空白對照孔； 每一個反應(yīng)孔的基因分型可以根據(jù)下表的引物和探針設(shè)計，采用TaqMan?_MGB技術(shù)，進行檢測試劑合成； 在每一個反應(yīng)孔中加入試劑為熒光定量PCR反應(yīng)體系，總體積為IOMl,即濃度為20ng/m的DNA模板2W ,m IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液ABI Taqman ? MGB、0.1W 25mMd NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0.5W 25mM MgCl2溶液、0.02W (5unitsM)TaqDNA聚合酶、去離子水4.98W、4個位點分別采用不同的正向引物(20剛，0.225W )、反向弓丨物(20剛，0.225|^1)、￥1(:熒光探針(10剛，0.25W )和FAM熒光探針(10剛，0.25W)工具進行檢測，引物探針如下: 瘦素(LEP) rsl3306517 帶VIC熒光A型探針 CCAaAAAGTCCAA 帶FAM熒光G型探針 CCAgAAAGTCCAA 正向引物 CTTCTGITITCAGGCCCAAG 反向引物 CTTTGTCCCCGCATACTCTC 瘦素受體(LEPR) rs 1805094 帶VIC熒光C型探針 AAAcGAGAAAAAT 帶FAM熒光G型探針 AAAgGAGAAAAAT 正向引物 TGAGAGGACCTGAAITITGGA 反向引物 TGCTTCAGCCACTGTACATCTT 白介素 6 (IL-6)rsl800795 帶VIC熒光C型探針 TGCcATGCTAAAG 帶FAM熒光G型探針 TGCgATGCTAAAG 正向引物 GCCTCAATGACGACCTAAGC 反向引物 ACTCATGGGAAAATCCCACA 脂聯(lián)素(ADIPOQ) rs2241766 帶VIC熒光G型探針 CGGgCATGACCAG 帶FAM熒光T型探針 CGGtCATGACCAG 正向引物 TGGACGGAGTCCTTTGTAGG 反向引物 AGTCGTGGITTCCTGGTCAT將反應(yīng)孔和空白對照在PCR擴增儀上進行反應(yīng)，先進行預(yù)熱:50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，然后再進行60個循環(huán)的95°C、30秒，60°C、1分鐘、反應(yīng)結(jié)束后取出后再放入熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到瘦素(LEP) rsl3306517，瘦素受體(LEPR) rsl805094，白介素 6 (IL-6)rsl800795，脂聯(lián)素(ADIPOQ) rs2241766 四張圖； 步驟4:SNP基因型分析 將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號的4個圖和一個NTC空白對照進行比較，每個位點理論上存在三種不同的信號，純VIC熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM熒光信號，分別代表該位點三種不同的基因型； (1)、瘦素(LEP)rsl3306517 在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域為空白對照、坐標軸左上區(qū)域為AA基因型、坐標軸右上區(qū)域為AG基因型、坐標軸右下區(qū)域為GG基因型， (2)、瘦素受體(LEPR)rs 1805094 在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域為空白對照、坐標軸左上區(qū)域為CC基因型、坐標軸右上區(qū)域為CG基因型、坐標軸右下區(qū)域為GG基因型，
(3)、白介素6 (IL-6) rsl800795 在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域為空白對照、坐標軸左上區(qū)域為CC基因型、坐標軸中間區(qū)域為CG基因型、坐標軸右下區(qū)域為GG基因型， (4)、脂聯(lián)素(ADIPOQ)rs2241766 在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域為空白對照、坐標軸左上區(qū)域為GG基因型、坐標軸右上區(qū)域為GT基因型、坐標軸右下區(qū)域為TT基因型。
2.權(quán)利要求書I中的所述的瘦素(LEP)rsl3306517、瘦素受體(LEPR) rsl805094、白介素6 (IL-6) rsl800795、脂聯(lián)素(ADIPOQ) rs2241766基因的組合檢測方法。
【文檔編號】C12Q1/68GK103602749SQ201310645947
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】傅詠南, 王校, 毛丹丹, 張奕, 卞雪蓮, 潘峰, 樂涵駿 申請人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司