球孢白僵菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及球孢白僵菌及其菌劑的制備方法和應用，尤其對防治蝗蟲類害蟲有效。本發(fā)明提供的球孢白僵菌Beauveria?bassiana(Bals.-Criv.)Vuill?TRCC16003，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC?No.7998；該菌株產(chǎn)孢能力強，對菱蝗3齡跳蝻殺蟲活性強，LT50(致死中時)為4.13天。利用該菌株能有效控制菱蝗的種群數(shù)量?；认x綠僵菌對其他害蟲松毛蟲、玉米螟、蠐螬等具有很好的防治效果，值得推廣應用。
【專利說明】球孢白僵菌及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術防治領域，具體涉及球孢白僵菌(Beauveriabassiana (Bals.-Criv.) Vui 11 TRCC16003)及其菌劑的制備方法和在防治植物蟲害中的應用。

【背景技術】
[0002]蝗蟲是蝗科，直翅目昆蟲。全世界有超過10，000種。分布于全世界的熱帶、溫帶的草地和沙漠地區(qū)?？谄鲌杂玻俺岐M窄而堅韌，后翅寬大而柔軟，善于飛行，后肢很發(fā)達，善于跳躍?；认x是農(nóng)、林、牧業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，不少有害蝗種對農(nóng)、林、牧業(yè)可造成不同程度危害。全世界的蝗蟲已有I萬種以上，其中對農(nóng)、林、牧業(yè)可造成危害的蝗蟲約300種左右，全球除南極洲、歐亞大陸北緯550以北地區(qū)外均可發(fā)生蝗蟲。
[0003]多年來草原蝗蟲一直采用化學農(nóng)藥防治，對迅速控制蝗害的發(fā)生、擴散起到了積極作用。但化學農(nóng)藥治蝗存在成本高、用量大、安全性差等弊端且大量使用易造成人畜中毒、污染草原同時殺滅蝗蟲天敵危害草原生態(tài)環(huán)境破壞生態(tài)平衡。因此生物防治技術是目前草原災害綜合治理的積極有效的措施。白僵菌是一種半知菌類的蟲生真菌，具有營養(yǎng)器官一菌絲和繁殖器官一分生孢子，菌絲有橫隔有分枝。白僵菌的分布范圍很廣，從海拔幾米至2000多米的高山均發(fā)現(xiàn)過白僵菌的存在，白僵菌可以侵入6個目15科200多種昆蟲、螨類的蟲體內(nèi)大量繁殖，同時不斷產(chǎn)生白僵素(大環(huán)脂類毒素)和草酸鈣結晶，這些物質(zhì)可引起昆蟲中毒，使體液發(fā)現(xiàn)機能發(fā)生變化，打亂新陳代謝以致死亡。所謂白僵蟲就是白僵菌的分生孢子落在昆蟲體上，在合適溫濕條件下，即可發(fā)芽直接侵入昆蟲體內(nèi)，以昆蟲體內(nèi)的血細胞及其他組織細胞作為營養(yǎng)，大量增殖，以后菌絲穿出體表，產(chǎn)生白粉狀分生孢子，從而使害蟲呈白色僵死狀，稱為白僵蟲。白僵菌制劑對人、畜無毒，對作物安全，無殘留、無污染，但能感染家蠶幼蟲，形成僵蠶病。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是提供了一株球孢白僵菌。
[0005]本發(fā)明所提供的球抱白僵菌Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) VuillTRCC16003，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCCN0.7998。該菌株已于2013年08月13日把藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
[0006]本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供一種殺蟲菌劑。
[0007]本發(fā)明提供的殺蟲菌劑，它的活性成分是上述球孢白僵菌Beauveriabassiana(Bals.-Criv.)Vui11 TRCC16003。
[0008]所述殺蟲菌劑用于防治以下害蟲的幾種或一種:松毛蟲、玉米螟、蠐螬、蝗蟲、馬鈴薯甲蟲、松褐天牛、白蟻、茶小綠葉蟬、桃小食心蟲等。
[0009]本發(fā)明的球抱白僵菌Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill TRCC16003 對 3齡蝗蝻具有高致病力。
[0010]菌種名稱:球孢白僵菌
[0011]拉丁名:Beauveriabassiana
[0012]菌種編號:TRCC16003
[0013]保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0014]保藏機構簡稱:CGMCC
[0015]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號
[0016]保藏日期:2013年08月13日
[0017]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.7998
[0018]以下結合具體實施實例詳細描述本發(fā)明，這些實例僅僅是用于理解本發(fā)明而非限制。
[0019]實施實例I球孢白僵菌的菌株鑒定
[0020]分子系統(tǒng)學鑒定
[0021]DNA提取方法:采用石英砂研磨CTAB提取法(Scott et al., 2000)。
[0022]遺傳標記:選用翻譯延伸因子(tef Ι-alpha)基因(tef)，擴增引物=EFlT,EF2T(Bischoff et al.,2006)。
[0023]PCR擴增反應條件:先94攝氏度加熱3分鐘使模板DNA變性，然后進入下列溫度循環(huán):94攝氏度變性30秒，50攝氏度退火30秒，72攝氏度延伸45秒，共進行35個循環(huán)，最后在72攝氏度延伸5分鐘(Wang，2012)。
[0024]PCR產(chǎn)物檢測和測序:PCR產(chǎn)物與 10bp DNA ladder (MBI Fermentas)用 2.0%的瓊脂糖凝膠(agarose gel)在0.5 X TBE電泳緩沖液中于80V電壓下電泳20分鐘，然后置于
0.5 μ g / ml的溴乙淀(EB, ehidium bromide)溶液中染色15分鐘,在波長365和254nm的紫外光下檢測為明顯單一條帶的產(chǎn)物由擎科生物技術有限公司純化后用ABI3700 (AppliedB1systems)進行雙向直通測序。測序結果見附圖1。
[0025]數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析:原始序列用生物軟件B1edit7.0.9(Hall，1999)編輯后得到準確無誤的序列，與GenBank下載的模式和權威菌株序列組成序列數(shù)據(jù)矩陣。對于序列矩陣，在B1edit7.0.9下做必要的人工編輯和調(diào)整得到的新矩陣。將該矩陣用MEGA5.0 (Tamura et al., 2011)進行鄰居連接法(neighbor-joining, NJ)分析，推斷出系統(tǒng)發(fā)育樹，并用自展法(bootstrap)進行1000次重復評估各分支的可靠性(附圖2，見下頁)。
[0026]菌株TRCC16003tef 序列:
[0027]TRCC16003
[0028]5，-TCACATCAACGTCGTCGTTATCGGGTGCGTTTAACGCTGAACGCCTTCGACCTCGACGAGCAATAAATACTGACCACCAGACAGCCACGTCGATTCCGGCAAGTCTACCACCGTAAGTTTTTTTTCAGGTCGAGTGGCTTTTGAGCTCTCGAACCAGCAATCTTCCGCCTCGCCGGTACCTGAGAGCAAAGAGCTAACTCATGTATACAGACTGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTATTGACAAGCGTACTTGAGAAGTTCGAGAAGGTAAGCATAGTATCCAACTCTTTTCTACTGTCAAATGGACCTTGATCGCTTGCTGCGCAATTTTTTTTTCGTCGTATCGCGCTGGCCACCAGCACTCACTACCCCTCCCGTGCGGCAAAAATTTTCAGTGCCTTATCAATTCAGTGGGGCCAGTGAGAGTACCCCGCCACCTTGTCGCAAGCTTTCCCCTCATCTATTAGGTCGAAGCAGCAGAAGAAGAGATATCGCGTGCACCAGCAACAGATCGCTAACCTACCGTCTACAGGAAGCCGCTGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTATGCCTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATTGATATCGCCTCTGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACCACGTCACCGTCATTGATGCTCCCGGTCACCGTGATTTCATCAAGAACAT-3’
[0029]球孢白僵菌Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill TRCC16003 的系統(tǒng)發(fā)育樹見附圖2。
[0030]實施實例2球孢白僵菌的室內(nèi)殺蝗特性測定:
[0031]該實驗設兩個處理，分別是球抱白僵菌Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) VuillTRCC16003實驗組和空白對照組。
[0032]實驗處理方法如下:25攝氏度下，接種孢子量為1.0X 18個/ mL，處理籠放入菱蟲皇(pygmy grasshoppers) 3齡幢蝻,每個處理有3個重復,每組處理30頭幢蟲,藥劑用量為5ml / 30頭，利用小噴霧器直接噴霧于養(yǎng)蟲籠內(nèi)。計錄死蟲數(shù)，記錄存活率。經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計分析得到LT5tl (致死中時)。結果表明，球孢白僵菌Beauveria bassiana (Bals.-Criv.)Vuill, TRCC16003 對菱蟲皇(pygmy grasshoppers) 3 齡蟲皇蝻的 LT50 為 4.13 天。
[0033]表1球孢白僵菌CC16003室內(nèi)殺蝗活性測定
[0034]

【權利要求】
1.一種球抱白僵菌,其拉丁名稱為Beauveria bassiana(Bals.-Criv.) Vuill,其特征在于:所述的球抱白僵菌 Beauveria bassiana(Bals.-Criv.) Vuill 菌株號為 TRCC16003,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.7998。
2.權利要求1所述的球孢白僵菌在產(chǎn)生分生孢子或菌絲體中的應用。
3.一種殺蟲菌劑，它的活性成分是權利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。
4.根據(jù)權利要求3所述的殺蟲菌劑，其特征在于:所述的球孢白僵菌為分生孢子或菌絲體。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的菌劑，其特征在于:所述殺蟲菌劑用于防治以下害蟲的幾種或一種:松毛蟲、玉米螟、蠐螬、蝗蟲、馬鈴薯甲蟲、松褐天牛、白蟻、茶小綠葉蟬、桃小食心蟲。
6.權利要求1所述的球孢白僵菌,其拉丁名稱為Beauveriabassiana,在制備殺蟲劑中的應用。
7.權利要求3或4所述的殺蟲菌劑在制備殺蟲劑中的應用。
【文檔編號】C12N3/00GK104073439SQ201310646189
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權日:2013年12月6日
【發(fā)明者】梁小文, 王根豪, 陳曉燕, 周立峰, 李肖宇, 馬忠?guī)r, 吳俊杰, 劉麗君, 李源 申請人:江西天人生態(tài)股份有限公司