一種表達低過敏性花生過敏原的乳酸乳球菌重組菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達低過敏性花生過敏原的乳酸乳球菌重組菌及其應用。本發(fā)明在保留天然花生過敏原Arah2蛋白免疫原性的基礎上，降低其過敏原性，對Arah2的天然基因進行密碼子優(yōu)化和修飾突變得到優(yōu)化基因mArah2，構(gòu)建了針對mArah2的重組表達質(zhì)粒和重組乳酸乳球菌菌株。用本發(fā)明的重組菌免疫小鼠，可有效抑制花生過敏的發(fā)生，免疫保護作用顯著；因此本發(fā)明在臨床防治花生過敏方面有巨大的潛力。
【專利說明】一種表達低過敏性花生過敏原的乳酸乳球菌重組菌及其應用
【【技術領域】】
[0001]本發(fā)明涉及表達低過敏性花生過敏原mArah2的重組乳酸乳球菌菌株，其構(gòu)建方法及應用，屬于生物工程【技術領域】。
【【背景技術】】
[0002]花生過敏是最常見的食物過敏反應，發(fā)病率較高，會引起嚴重甚至致命的臨床癥狀?；ㄉ^敏通常是終生的，一般不易隨著年齡增長產(chǎn)生免疫耐受。目前，特異性免疫療法是較為有效的花生過敏治療方法。但傳統(tǒng)的特異性免疫療法大都使用過敏原粗提物，提取量小、純度低。利用基因工程方法重組表達過敏原蛋白是一種簡便可行的方法。陶愛林等在專利《一種重組花生過敏原與突變體及其制備方法和應用》中利用大腸桿菌作為表達宿主成功制備一種重組花生過敏原與突變體。但大腸桿菌產(chǎn)內(nèi)毒素,其表達產(chǎn)物需后續(xù)純化，都阻礙了大腸桿菌表達系統(tǒng)的大規(guī)模推廣及應用。
[0003]乳酸乳球菌已被廣泛用于食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領域，是公認安全的食品級微生物。近年來，乳酸乳球菌分子遺傳學研究的重大發(fā)展使得利用乳酸乳球菌表達外源抗原制備粘膜疫苗成為研究的熱點。乳酸乳球菌表達的蛋白可直接連同菌體一起口服，同時其表達的外源蛋白可誘導機體產(chǎn)生有效的免疫應答。
[0004]花生過敏原包括分子量介于0.7-100kDa間的多種糖基化蛋白，Arah2是花生中致敏性最強的組分之一，可被超過90%的花生過敏患者血清中特異性IgE識別。Stanley J S、Chatel J M 等人的研究結(jié)果表明，Arah2的主要線性抗原表位為:aa9_18、aa39_48、aa47_56 及 aa61_66 (StanleyJS, etal.1dentification and mutationalanalysis of the immunodominant IgE binding epitopes of the major peanutallergen Arah2.Arch Biochem Biophys，1997，342 (2):244-253;Chatel J M，etal.1solation and characterization of two complete Arah2 isoforms cDNA.1ntarch Allergy Immyj 2003，131 (I): 14-18)。其中，第一個 IgE 結(jié)合表位 aa9_18 與 CD4+T細胞結(jié)合表位有重合(Prickett S R et al.Arah2 peptides containing dominantCD4+T_cell epitopes:candidates for a peanut allergy therapeutic.J Allergy ClinImmun, 2011, 127(3):608_615)。考慮到天然過敏原在免疫治療中可能誘發(fā)過敏反應，本發(fā)明通過基因工程技術對優(yōu)化后花生過敏原基因nArah2進行合理的修飾突變，在保留其免疫原性的同時降低其過敏原性，獲得了低過敏原性的過敏原基因mArah2。
[0005]因此，本發(fā)明利用乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)作為宿主菌株表達mArah2蛋白，以制備花生過敏口服疫苗，并通過小鼠模型評價其免疫效果。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種低過敏原性的花生過敏原蛋白mArah2，包含該蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌菌株，其中所述菌株可以是乳酸乳球菌NZ9000，得到重組乳酸乳球菌菌株L.lactis NZMH。
[0007]本發(fā)明還涉及包含所述的重組乳酸乳球菌菌株的疫苗，所述疫苗可以是口服制劑，例如膠囊劑、錠劑、粉劑或顆粒劑等。
[0008]本發(fā)明還涉及所述的重組質(zhì)粒或重組乳酸乳球菌菌株在制備可用于治療花生過敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。
[0009]本發(fā)明中低過敏原性的花生過敏原蛋白mArah2在保留原始蛋白免疫原性的基礎上降低了其過敏原性，可有效避免在免疫治療中天然過敏原可能誘發(fā)的過敏反應，大大降低副作用。并且通過動物實驗結(jié)果表明，低過敏原性的乳酸乳球菌重組菌株可促使免疫反應從Th2型向Thl型轉(zhuǎn)變，對花生過敏起到預防作用。
[0010]因此，mArah2基因可以重組質(zhì)粒疫苗的形式用于防治花生過敏；重組乳酸乳球菌菌株L.lactis NZMH可作為一種新型的低致敏性疫苗應用于花生過敏的臨床預防及免疫治療。
[0011]本發(fā)明涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZMH,于2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.8219 ；
[0012]本發(fā)明涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZNH,于2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.8216。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0013]圖1:nArah2和 mArah2蛋白在乳酸乳球菌中表達的Western blot分析；Μ,非預染蛋白質(zhì)低分子量標準；第I泳道為純化的His-nArah2蛋白；第2泳道為L.lactis NZ ；3和4 泳道分別為 L.lactis NZNH、L.lactis NZMH ；
[0014]圖2:動物實驗流程圖；
[0015]圖3:過敏癥狀的評分:符號(Λ)代表小鼠個體，線段表示平均值。不同字母(a_c)表示組別之間具有顯著性差異(P〈0.05)；
[0016]圖4:重組乳酸乳球菌對小鼠血清特異性抗體的影響:血清CPE特異性的IgE(A)、IgGl (B)和IgG2a (C)含量以450nm處的OD值來表示。符號(▲，.，?)代表小鼠個體，線段表示平均值。不同字母(a-d)表示組別之間具有顯著性差異(p〈0.05)。
[0017]圖5重組乳酸乳球菌對小鼠血清中總IgE抗體和MCP-1的影響:a:與陰性對照組相比，ρ〈0.05 ；b:與模型組相比，ρ〈0.05。
【【具體實施方式】】
[0018]以下通過實施例來進一步闡述本發(fā)明，下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊進行實驗操作，各種試劑如無特殊說明，其濃度均為質(zhì)量百分比濃度。
[0019]實施例1低過敏原性基因mArah2的獲得
[0020](I)天然花生過敏原基因Arah2的優(yōu)化:
[0021]在Arah2的氨基酸序列(genbank:AAN77576.1)中刪除信號肽序列，同時結(jié)合乳酸乳球菌密碼子的偏愛性對Arah2基因序列進行密碼子優(yōu)化，并亞克隆至pUC57上，得到包含天然過敏原優(yōu)化基因nArah2的質(zhì)粒PUC57_nArah2 (由上海生工合成，其中pUC57為商業(yè)化質(zhì)粒)。
[0022](2)天然過敏原優(yōu)化基因nArah2的修飾突變:
[0023]將aa47_56抗原表位斷開，并按50-151-1-49的氨基酸順序重新排列，得到低過敏原性的花生過敏原基因mArah2。相關序列如下:
[0024]優(yōu)化前天然基因序列(genbank:AY158467.1), SEQ ID N0.1。
[0025]修飾突變后的優(yōu)化基因序列(mArah2)，SEQ ID N0.2。
[0026]優(yōu)化前天然氨基酸序列(genbank:AAN77576.1), SEQ ID N0.3。
[0027]修飾突變后的優(yōu)化氨基酸序列，SEQ ID N0.4。
[0028]實施例2含低過敏原性基因mArah2的重組表達載體的構(gòu)建
[0029]目的片段aal-49、aa50_151的重排拼接:以質(zhì)粒pUC57_nArah2 (由上海生工合成，其中PUC57為商業(yè)化質(zhì)粒)為模板，分別利用引物P1F:CAGGTGGTCGTGATCGTTATCGTCAACAATGGGAATTAC/PIR:CCCTCGAGATCTTGTGATGGTGAATATG 和引物 P2F:CGCCATATGCCATATTCTCCTTCACAAG/P2R:GTAATTCCCATTGTTGACG ATAACGATCACGACCACCTG 擴增 aal-49及aa50-151片段基因。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并分別回收純化兩個基因片段的PCR產(chǎn)物。采用重疊區(qū)擴增基因拼接法對目的片段aal-49、aa50_151進行拼接。擴增體系如下(總體積為 50 μ L): 10 XKOD plus buffer:5 μ L ；dNTP:5 μ L ；MgS04:2 μ L ;模板 1-49:2μ L ;模板50-151:2 μ L ;K0D酶:0.5μ L ；ddH20:31.5 μ L。5個循環(huán)后再加入上、下游引物(P1R/P2F)各1μ L。將拼接完成的目的基因片段命名為mArah2和載體pNZ8148 (Mierauand Kleerebezem.1Oyears of the nisin-controlled gene expression system(NICE)inLactococcus lactis.Appl Microbiol Biotechnol.2005，68 (6): 705-717)雙酶切后進行過夜連接反應。
[0030]實施例3重組乳酸乳球菌的制備
[0031]將上述連接反應產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化L.lactis NZ9000 (Kuipers et al.Quorumsensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria.Journal ofBiotechnology.1998，64 (I): 15-21)感受態(tài)細胞。挑取轉(zhuǎn)化子進行測序驗證，將測序正確的重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化子分別命名為pNZ8148-mh2 (自行構(gòu)建)和L.lactis NZMHjf L.1actisNZ9000和重組表達nArah2蛋白的L.lactis NZ9000菌株分別命名為L.lactis NZ和L.lactis NZNH0
[0032]實施例4重組蛋白在乳酸乳球菌中的誘導表達及Western blot檢測分析
[0033](I)重組蛋白在乳酸乳球菌中的誘導表達:`[0034]挑取測序正確的轉(zhuǎn)化子單菌落接種到5mL含10 μ g/mL氯霉素(Cm)的GM17液體培養(yǎng)基(每升GM17培養(yǎng)基配方:大豆蛋白胨5g,細菌蛋白胨5g,牛肉膏5g,酵母粉2.5g,葡萄糖5g，β -磷酸甘油二鈉19g，維生素C0.5g，Imol/LMgSO4ImL)中，30°C培養(yǎng)過夜；按照2%接種量轉(zhuǎn)接于5mL含有10 μ g/mL Cm的GM17培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到OD6tltl為0.5-0.6 ;加入nisin(Sigma,購自上海悠揚生物科技有限公司)誘導物使其終濃度為10ng/mL，30°C繼續(xù)培養(yǎng)6h后，于4°C，6000g離心IOmin收集菌體；PBS洗滌菌體沉淀兩次后，重懸于1/20體積的PBS中。超聲破碎菌液至半透明狀，4°C以12000g離心20min，收集上清液進行Western blot檢測。
[0035](2) Western blot檢測重組蛋白的表達情況:
[0036]將上述制備的樣品和L.lactis NZ (作為陰性對照)經(jīng)12%SDS_PAGE凝膠分離后，于冰浴穩(wěn)流(150mA)轉(zhuǎn)移40min，使得蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，購自中科瑞泰生物科技有限公司)；轉(zhuǎn)印膜經(jīng)PBST (每升10XPBS緩沖液配方:NaC180g，KC12g, Na2HPO4.12H2035.8g, KH2P042g ；每升 PBST 緩沖液配方:10 XPBSlOOml，蒸餾水900ml, Tween-200.05%)洗滌后，用PBST(含5%脫脂奶粉)室溫封閉2h ;—抗(1:1000稀釋度)與轉(zhuǎn)移膜于4°C過夜孵育；用HRP標記羊抗兔二抗(1:1.0X IO4稀釋度，SouthernBiotech,購自上海悠揚生物科技有限公司)和轉(zhuǎn)印膜室溫孵育Ih ;轉(zhuǎn)印膜上滴加顯色液(購自北京康為世紀生物科技有限公司)避光條件下顯色。由圖1的結(jié)果可知:陰性對照(泳道2)中未見條帶，陽性對照(泳道l)His-nArah2為預期19kDa大小，同時在泳道3和4也檢測出同為19kDa的條帶,與預期大小一致,分別對應nArah2和mArah2蛋白。
[0037]實施例5動物實驗
[0038](I)菌體制備:
[0039]將過夜培養(yǎng)的重組菌株按照1:50的比例轉(zhuǎn)接到含10 μ g/mL氯霉素(Cm)的新鮮GMl7液體中，30°C培養(yǎng)至OD600約0.5-0.6左右時，加入10ng/mL的nisin (Sigma,購自上海悠揚生物科技有限公司)進行誘導。30°C誘導6h后6000g，離心IOmin收集誘導后的菌體。用無菌的PBS溶液洗滌菌體沉淀兩次后，重懸于適量的PBS溶液中，調(diào)整菌體濃度為1X101CICFU。
[0040](2)動物實驗程序
[0041]動物實驗流程如圖2所示；采用Balb/c小鼠建立花生過敏模型，對其灌胃重組菌L.lactis NZNH和L.lactis NZMH，通`過觀察小鼠的過敏癥狀，測定小鼠血清中總IgE、特異性抗體及MCP-1水平，從而對重組菌預防小鼠花生過敏的效果進行評估。動物實驗程序:30只4周齡雌性Balb/c小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限公司)適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分成5組，每組6只。整個動物實驗過程分為三個階段:(I)預防階段--第1-4、7-10天連續(xù)灌胃0.2mL誘導后的菌液(2X IO9CFU) ; (2)致敏階段:第17、22、28、34、40、46天灌胃6mg花生蛋白粗提物(CPE)和10 μ gCT ；(3)激發(fā)階段:最后一次灌胃后第7天，即第53天時灌胃12mg CPE進行激發(fā)。
[0042]設第I組為PBS對照組，每只小鼠在預防及致敏階段均灌胃0.2mL PBS。第2組為陽性對照模型組，在預防階段灌胃等量PBS，而在致敏階段灌胃CPE和CT。第3組為實驗對照組，在預防階段灌胃L.lactis NZ9000 ;第4、5組均為實驗組，在預防階段分別灌胃重組菌L.lactis NZNH和L.lactis NZMH。第3、4和5組在致敏階段中均灌胃CPE和CT。所有組別的小鼠均在第53天灌胃CPE進行激發(fā)。
[0043]實驗結(jié)果表明，通過灌胃重組乳酸乳球菌L.lactis NZNH和L.lactis NZMH 口服疫苗，花生過敏小鼠的過敏癥狀顯著減輕，肥大細胞脫粒和體內(nèi)Th2型免疫反應(血清IgE抗體)明顯受到抑制，而Thl型特異性IgG2a抗體水平顯著增加；且與L.lactis NZNH相比，L.lactis NZMH對小鼠肥大細胞脫粒、總IgE及特異性IgE抗體分泌的抑制作用更顯著。這些結(jié)果表明，低過敏原性重組乳酸乳球菌口服疫苗能更有效地抑制過敏性的免疫反應，從而預防花生過敏。[0044]由圖3可知:激發(fā)后，PBS對照組的小鼠無明顯的過敏癥狀。相對于陰性組，模型組小鼠過敏癥狀較為明顯，100%的小鼠在激發(fā)后有頻繁搔撓鼻子及頭部的行為，此外還出現(xiàn)眼周水腫，腹瀉等癥狀。在益生菌組中，小鼠均出現(xiàn)輕微的過敏癥狀，頻繁搔撓鼻子及頭部的行為也普遍存在，但僅有一兩只小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀。結(jié)果表明，灌胃L.lactis NZ9000和重組乳酸乳球菌均能減緩小鼠花生過敏癥狀。
[0045]由圖4可知，與陰性組相比，模型組中CPE特異性IgE和IgGl抗體含量顯著增加(Ρ〈0.05)。重組菌L.lactis NZNH和L lactis NZMH均能明顯地降低CPE特異性IgE抗體，但是對IgGl抗體的影響 并不顯著；并且灌胃L.lactis NZMH組特異性IgE水平較L.1actisNZNH組下降更為顯著。同時，原始菌株L.lactis NZ9000對特異性IgE和IgGl抗體并沒有產(chǎn)生影響。重組菌L.lactis NZNH和L.lactis NZMH均能誘導產(chǎn)生大量的Thl型CPE特異性IgG2a抗體，與模型組和陰性組的差異顯著。
[0046]由圖5可知，與模型組相比，L lactis NZNH和L lactis NZMH組總IgE和肥大細胞脫粒均受到顯著抑制，且L.lactis NZMH的抑制效果比L.lactis NZNH更為顯著。
[0047]以上結(jié)果表明，重組菌L.lactis NZNH和L.lactis NZMH均能促使小鼠體內(nèi)Th2型反應向Thl型轉(zhuǎn)變，調(diào)節(jié)Thl/Th2平衡；但1 lactis NZMH對于花生過敏小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用優(yōu)于重組菌L.lactis NZNH，其預防花生過敏的功效更優(yōu)越。
[0048]雖然本發(fā)明專利已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種改動與修飾。因此本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【權(quán)利要求】
1.一種低過敏原性的花生過敏原蛋白mArah2,其特征在于,其是將天然Arah2蛋白的aa47-56抗原表位斷開，并按50_151_1_49的氨基酸順序重新排列得到的低過敏原性花生過敏原基因mArah2,如SEQN0.2所示。
2.一種包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的低過敏原性花生過敏原蛋白mArah2的編碼基因的重組質(zhì)粒。
3.包含根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乳酸乳球菌菌株，其特征在于，所述菌株是用包含低過敏原性的花生過敏原mArah2的編碼基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000后所獲得的菌株Lactococcus lactis NZMH,于2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為 CGMCC N0.8219。
5.包含權(quán)利要求4所述的重組乳酸乳球菌菌株的疫苗，其特征在于，所述疫苗為口服制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的包含重組乳酸乳球菌菌株的疫苗，其特征在于，所述口服制劑為膠囊劑、錠劑、粉劑或顆粒劑。
7.權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)?；驒?quán)利要求3-4任一項所述的重組乳酸乳球菌菌株在制備可用于治療花生過敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。
8.一種制備權(quán)利要求3所述的重組乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟: a)對花生過敏原Arah2的天然基因序列進行密碼子優(yōu)化和修飾突變得到低過敏原性的花生過敏原基因mArah2 ； b)構(gòu)建重組表達質(zhì)粒； c)利用重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌并進行篩選鑒定獲取重組乳酸乳球菌菌株。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備重組乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于步驟a)、b)中構(gòu)建重組表達質(zhì)粒包括以質(zhì)粒PUC57-nArah2為模板，分別利用引物P1F:CAGGTGG TCGTGATCGTTATCGTCAACAATGGGAATTAC/P1R:CCCTCGAGATCTTGTGA TGGTGAATATG 和引物P2F:CGCCATAT GCCATATTCTCCTTCACAAG/P2R: GTA ATTCCCATTGTTGACGATAACGATCACGACCACCTG擴增aal-49及aa50_151片段基因；利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并分別回收純化兩個基因片段的PCR產(chǎn)物；采用重疊區(qū)擴增基因拼接法對目的片段aal-49、aa50_151進行拼接，以及將拼接完成的目的基因片段mArah2和載體pNZ8148雙酶切后進行過夜連接反應的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備重組乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于步驟c)中的轉(zhuǎn)化方法是電轉(zhuǎn)化。
【文檔編號】C12N1/21GK103626860SQ201310647930
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】陳衛(wèi), 張秋香, 任晟誠, 王剛, 田豐偉, 劉小鳴, 趙國忠, 趙建新, 張灝, 郭敏 申請人:江南大學