小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法，通過小麥成熟胚培養(yǎng)的前處理、有機(jī)物的添加及培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化技術(shù)過程的優(yōu)化，獲得了與小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)、再生和轉(zhuǎn)化效率相近的技術(shù)效果，與已報道的成熟胚愈傷組織基因搶轉(zhuǎn)化技術(shù)相比，該成熟胚愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率高，其誘導(dǎo)、分化及轉(zhuǎn)化能力接近于幼胚愈傷組織，克服了以往小麥成熟胚愈傷組織基因搶轉(zhuǎn)化中愈傷組織誘導(dǎo)率、再生頻率和轉(zhuǎn)化效率低的技術(shù)弊端，使小麥遺傳轉(zhuǎn)化不受受體組織取材季節(jié)、時段的限制，利用當(dāng)年收獲或儲藏1年種子成熟胚隨時進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化研究成為可能，提高了小麥遺傳轉(zhuǎn)化和分子育種效率。
【專利說明】小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物之一，自1992年Vasil等將⑶S/Bar基因?qū)胄←溣着哂鷤M織、通過轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生獲得首例轉(zhuǎn)基因小麥以來，轉(zhuǎn)基因小麥研究有了長足的發(fā)展，盡管小麥轉(zhuǎn)基因方法報道不少，但基因槍轉(zhuǎn)化(microprojectile bombardment)仍然是小麥遺傳轉(zhuǎn)化最有效的技術(shù)。目前，小麥基因槍遺傳轉(zhuǎn)化的主要受體為發(fā)育13天左右的小麥幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織，但這一重要外植體的來源受到小麥生長季節(jié)及時段的影響，應(yīng)用上很不方便，小麥成熟胚主要來自于收獲或儲藏的小麥種子，其取材不受小麥生長季節(jié)和時段的影響，非常方便，但小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及再生能力極差，影響了這一技術(shù)的應(yīng)用，盡管目前通過培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基的改進(jìn)，是小麥成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織基本可以達(dá)到基因槍遺傳轉(zhuǎn)化的水平，但與幼胚愈傷組織相比，還有巨大差距。研究、探索小麥成熟胚高效離體培養(yǎng)、再生和轉(zhuǎn)化的條件，使其達(dá)到小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)、再生和轉(zhuǎn)化的水平，可為小麥外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化和應(yīng)用建立重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種小麥成熟胚愈傷組織高效誘導(dǎo)、再生和轉(zhuǎn)化的方法，該方法主要通過小麥成熟胚培養(yǎng)的前處理、有機(jī)物的添加及培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化技術(shù)過程的優(yōu)化，獲得了與小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)、再生和轉(zhuǎn)化效率相近的技術(shù)效果，克服小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)難、再生特性差、轉(zhuǎn)化效率低及轉(zhuǎn)化受體組織取材受生長季節(jié)、時段影響的缺陷。
[0004]為實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明`采用如下的技術(shù)解決方案:
[0005]一種小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]I)成熟胚的選擇與預(yù)處理:
[0007]選取當(dāng)年收獲或儲藏I年左右、籽粒飽滿的小麥種子，用無菌水沖洗2次，在無菌條件下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒5min，然后在濃度為0.1%的升汞溶液中浸泡種子15min，無菌水沖洗4次；
[0008]消毒后的小麥種子置10mg/L的噻二唑苯基脲(TDZ)溶液中于25°C室溫條件下預(yù)處理15h ；
[0009]2)接種與愈傷組織的誘導(dǎo):
[0010]預(yù)處理后的小麥種子用濃度為0.1%的升汞溶液再次消毒lOmin，無菌水洗4次，于無菌條件下剝?nèi)〕墒炫?，接種于成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；
[0011]所述的小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以通用MS培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì):2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D):2.0mg/L，鹽酸硫胺素(VBl):8.0mg/L，水解酪蛋白:500mg/L,L-天門冬酰胺:250mg/L, L-谷氨酰胺:200mg/L,鹿糖:15000mg/L,麥芽糖:15000mg/L,瓊脂:5000mg/L ；
[0012]通用培養(yǎng)基MS的配方為:硝酸鉀(KNO3):1900mg/L,硝酸氨(NH4NO3):1650mg/L，氯化鈣(CaCl2.2H20):440mg/L，硫酸鎂(MgSO4.7H20):370mg/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4):170mg/L，硫酸亞鐵(FeSO4.7H20):27.8mg/L，乙二酸四乙鈉(Na2EDTA):37.3mg/L，硫酸錳(MnSO4.4H20):22.3mg/L，硫酸鋅(ZnSO4.7H20):8.6mg/L，硼酸(H3BO3):6.2mg/L，碘化鉀(KI):0.83mg/L，鑰酸鈉(Na2MoO4.2H20):0.25mg/L，硫酸銅(CuSO4.5H20):0.025mg/L，氯化鈷(CoCl2.6H20):0.025mg/L，肌醇 100mg/L，鹽酸硫胺素:0.5mg/L，鹽酸吡哆鋅:0.5mg/L,煙酸:0.5mg/L,甘氨酸:2mg/L。
[0013]調(diào)整成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力:1.0kg /cm2)滅菌20分鐘；
[0014]3)高滲培養(yǎng):
[0015]小麥成熟胚組織誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后陸續(xù)產(chǎn)生成熟胚愈傷組織，挑選誘導(dǎo)12天、質(zhì)地致密的成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)移到高滲培養(yǎng)基中，于20°C黑暗條件高滲培養(yǎng)6h ；
[0016]所述的高滲培養(yǎng)基為上述小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中再附加0.2mol/L的甘露醇和0.2mol/L的山梨醇；
[0017]4)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化:
[0018]經(jīng)高滲處理后的成熟胚愈傷組織用常規(guī)的基因槍轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轟擊轉(zhuǎn)化，基因槍轟擊參數(shù)為:金粉直徑1.0 μ m，阻擋網(wǎng)與轟擊材料之間的距離為9.0cm，可裂膜壓力為IlOOPa,每槍金粉/DNA用量為I· μ g/60 μ g，每皿材料轟擊2次；
[0019]5)恢復(fù)培養(yǎng):
[0020]基因槍轟擊后的成熟胚愈傷組織在上述高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)暗培養(yǎng)18h后，將愈傷組織從高滲培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基中，于26°C暗培養(yǎng)13天；
[0021]所述的小麥成熟胚愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基以通用MS培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì):2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D):1.5mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤(KT):0.5mg/L，水解酪蛋白:500mg/L, L-天門冬酰胺:250mg/L，L-谷氨酰胺:200mg/L，鹽酸硫胺素(VBl):8.0mg/L，蔗糖:15000mg/L，麥芽糖:15000mg/L，瓊脂:5000mg/L ；
[0022]調(diào)整小麥成熟胚愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力:1.0kg / cm2)滅菌 20 分鐘；
[0023]6)抗性篩選:
[0024]恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到抗性篩選培養(yǎng)基上，于26°C、30001x光照下進(jìn)行抗性細(xì)胞篩選，所述抗性篩選培養(yǎng)基以通用MS培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì):2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D):1.0mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤(KT):0.5mg/L, α-萘乙酸(NAA):0.01mg/L,水解酪蛋白:500mg/L，L-天門冬酰胺:250mg/L，L-谷氨酰胺:200mg/L，鹽酸硫胺素(VBl):
8.0mg/L,卡拉霉素:100mg/L,鹿糖:15000mg/L,麥芽糖:15000mg/L,瓊脂:5000mg/L ；
[0025]調(diào)整抗性篩選培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力:1.0kg / cm2)滅菌20分鐘；
[0026]7 )分化培養(yǎng):
[0027]恢復(fù)及篩選培養(yǎng)后的成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25~28°C，光照度30001x，每天光照12h ;篩選獲得的成熟胚愈傷組織，在分化培養(yǎng)基上分化出芽苗；
[0028]所述的分化培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基MS為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì):6 —呋喃基氨基嘌呤(KT):2.0mg/L, α-萘乙酸(NAA):0.01mg/L，酪蛋白:500mg/L，生物素:0.5mg/L，鹽酸硫胺素(VBl):8.0mg/L，蔗糖:15000mg/L，麥芽糖:15000mg/L，瓊脂:5000mg/L ；
[0029]調(diào)整分化培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力:1.0kg / cm2)滅菌20分鐘；
[0030]8)壯苗、生根培養(yǎng):
[0031]待成熟胚愈傷組織分化的芽苗長至2~3片葉時轉(zhuǎn)移到生根、壯苗培養(yǎng)基上，于25°C>3000Lx光照條件下進(jìn)行壯苗、生根培養(yǎng)；
[0032]所述的生根、壯苗培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基MS為基準(zhǔn)，且將MS通用培養(yǎng)的無機(jī)鹽濃度降低一半，其中添加α —奈乙酸(NAA) 0.5mg/L,鹿糖:30000mg/L,瓊脂:5000mg/L ;
[0033]調(diào)整壯苗、生根培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力:1.0kg / cm2)滅菌20分鐘；
[0034]9)移植:
[0035]在生根、培壯苗養(yǎng)基上，生長健壯的成熟胚愈傷組織再生植株及時移栽到營養(yǎng)缽中，于15°C、3000Lx光照條件下緩苗，待完全緩苗且進(jìn)一步生長10天后，在3_4°C低溫春化條件下處理20天，即得到轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因株；
[0036]10)分子檢測并篩選:
[0037]用常規(guī)的分子檢測技術(shù)對轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因的抗性個體進(jìn)行分子檢測。
[0038]本發(fā)明的小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法，與報道的成熟胚愈傷組織基因搶轉(zhuǎn)化相比，成熟胚愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化效率高，其誘導(dǎo)、分化及轉(zhuǎn)化能力接近于幼胚愈傷組織，克服了以往小麥成熟胚愈傷組織基因搶轉(zhuǎn)化中愈傷組織誘導(dǎo)率、再生頻率和轉(zhuǎn)化效率低的技術(shù)弊端，使小麥遺傳轉(zhuǎn)化不受受體組織取材季節(jié)、時段的限制，利用當(dāng)年收獲或儲藏I年種子成熟胚隨時進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化研究成為可能，提高了小麥遺傳轉(zhuǎn)化和分子育種效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1是小麥成熟胚誘導(dǎo)的能高效再生的愈傷組織圖片；
[0040]圖2是基因槍轉(zhuǎn)化后成熟胚抗性愈傷組織的再生圖片；
[0041]以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
【具體實施方式】
[0042]本實施例給出一種小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟:
[0043]1)成熟胚的選擇與預(yù)處理:
[0044]選取當(dāng)年收獲或儲藏I年左右、籽粒飽滿的小麥種子，用無菌水沖洗2次，在無菌條件下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒5min，然后在濃度為0.1%的升汞溶液中浸泡種子15min，無菌水沖洗4次；
[0045]消毒后的小麥種子置10mg/L的噻二唑苯基脲(TDZ)溶液中于25°C室溫條件下預(yù)處理15h ；
[0046]2)接種與愈傷組織的誘導(dǎo):
[0047]預(yù)處理后的小麥種子用濃度為0.1%的升汞溶液再次消毒lOmin，無菌水洗4次，于無菌條件下剝?nèi)〕墒炫?，接種于成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；
[0048]所述的小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以通用MS培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì):2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D):2.0mg/L，鹽酸硫胺素(VBl):8.0mg/L，水解酪蛋白:500mg/L,L-天門冬酰胺:250mg/L, L-谷氨酰胺:200mg/L,鹿糖:15000mg/L,麥芽糖:15000mg/L,瓊脂:5000mg/L ；
[0049]通用培養(yǎng)基MS的配方為:硝酸鉀(KNO3): 1900mg/L,硝酸氨(NH4NO3): 1650mg/L，氯化鈣(CaCl2.2H20):440mg/L，硫酸鎂(MgSO4.7H20):370mg/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4):170mg/L，硫酸亞鐵(FeSO4.7H20):27.8mg/L，乙二酸四乙鈉(Na2EDTA):37.3mg/L，硫酸錳(MnSO4.4H20):22.3mg/L，硫酸鋅(ZnSO4.7H20):8.6mg/L，硼酸(H3BO3):6.2mg/L，碘化鉀(KI):0.83mg/L，鑰酸鈉(Na2MoO4.2H20):0.25mg/L，硫酸銅(CuSO4.5H20):0.025mg/L，氯化鈷(CoCl2.6H20):0.025mg/L，肌醇 100mg/L，鹽酸硫胺素:0.5mg/L，鹽酸吡哆鋅:0.5mg/L,煙酸:0.5mg/L，甘氨酸:2mg/L ；
[0050]調(diào)整成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力:1.0kg /cm2)滅菌20分鐘；
[0051]3)高滲培養(yǎng):
[0052]小麥成熟胚組織誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后陸續(xù)產(chǎn)生成熟胚愈傷組織，挑選誘導(dǎo)12天、質(zhì)地致密的成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)移到高滲培養(yǎng)基中，于20°C黑暗條件高滲培養(yǎng)6h ；
[0053]所述的高滲培養(yǎng)基為上述小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中再附加0.2mol/L的甘露醇和0.2mol/L的山梨醇；`
[0054]4)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化:經(jīng)高滲處理后的成熟胚愈傷組織用常規(guī)的基因槍轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轟擊轉(zhuǎn)化，基因槍轟擊參數(shù)為:金粉直徑1.0 μ m，阻擋網(wǎng)與轟擊材料之間的距離為9.0cm,可裂膜壓力為llOOPa，每槍金粉/DNA用量為I μ g/60 μ g，每皿材料轟擊2次；
[0055]5)恢復(fù)培養(yǎng):基因槍轟擊后的成熟胚愈傷組織在上述高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)暗培養(yǎng)18h后，將愈傷組織從高滲培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基中，于26°C暗培養(yǎng)13天；
[0056]所述的小麥成熟胚愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基以通用MS培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì):2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D):1.5mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤(KT):0.5mg/L，水解酪蛋白:500mg/L, L-天門冬酰胺:250mg/L，L-谷氨酰胺:200mg/L，鹽酸硫胺素(VBl):8.0mg/L，蔗糖:15000mg/L，麥芽糖:15000mg/L，瓊脂:5000mg/L ；
[0057]調(diào)整小麥成熟胚愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力:
1.0kg / cm2)滅菌 20 分鐘；
[0058]6)抗性篩選:恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到抗性篩選培養(yǎng)基上，于26°C、30001x光照下進(jìn)行抗性細(xì)胞篩選，所述抗性篩選培養(yǎng)基以通用MS培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì):2,4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D):1.0mg/L,6-呋喃基氨基嘌呤(KT):0.5mg/L，α -萘乙酸(NAA):
0.01mg/L，水解酪蛋白:500mg/L，L-天門冬酰胺:250mg/L，L-谷氨酰胺200mg/L，鹽酸硫胺素(VB1)8.0mg/L,卡拉霉素:100mg/L,鹿糖:15000mg/L,麥芽糖:15000mg/L,瓊脂:5000mg/L ；[0059]調(diào)整抗性篩選培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力:1.0kg / cm2)滅菌20分鐘；
[0060]7)分化培養(yǎng):恢復(fù)及篩選培養(yǎng)后的成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25~28°C，光照度30001x，每天光照12，所述的分化培養(yǎng)基選用通用培養(yǎng)基MS，以通用培養(yǎng)基MS為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì):6 —呋喃基氨基嘌呤(KT):2.0mg/L, α -萘乙酸(NAA):0.01mg/L,酪蛋白:500mg/L,生物素:0.5mg/L,鹽酸硫胺素(VBl) 8.0mg/L,鹿糖:15000mg/L，麥芽糖:15000mg/L，瓊脂粉:5000mg/L。
[0061]調(diào)整分化培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力:1.0kg / cm2)滅菌20分鐘；經(jīng)基因槍轟擊、恢復(fù)生長、篩選、再生的成熟胚愈傷組織在分化培養(yǎng)基上分化出芽苗。
[0062]8)壯苗、生根培養(yǎng):待成熟胚愈傷組織分化的芽苗長至2~3片葉時轉(zhuǎn)移到生根、壯苗培養(yǎng)基上，于25°C、3000LX光照條件下進(jìn)行壯苗、生根培養(yǎng)；壯苗、生根培養(yǎng)基選用通用培養(yǎng)基MS，以通用培養(yǎng)基MS為基準(zhǔn)，MS通用培養(yǎng)的無機(jī)鹽濃度降低一半，添加α —奈乙酸(NAA) 0.5mg/L，蔗糖:30000mg/L，瓊脂粉:5000mg/L ;調(diào)整壯苗、生根培養(yǎng)基的pH值為
5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力:1.0kg / cm2)滅菌20分鐘；
[0063]9)移植:在壯苗、生根培養(yǎng)基上根、苗生長健壯的成熟胚愈傷組織再生植株及時移栽到營養(yǎng)缽中，于15°C、3000LX光照條件下緩苗，待完全緩苗且進(jìn)一步生長10天后，經(jīng)低溫(3-4 °C)春化處理20天。
[0064]10)分子檢測并篩選:用常規(guī)的分子檢測技術(shù)對抗性個體進(jìn)行分子檢測，篩選轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因株。
[0065]以下是發(fā)明人給出·的實施例:
[0066]如圖1、2所示，發(fā)明人2012年以普通小麥西農(nóng)1013和西農(nóng)1376品種(系)當(dāng)年收獲的小麥種子為材料，經(jīng)10mg/L TDZ常溫處理15h后，分離成熟胚組織離體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，選取質(zhì)地致密的500塊成熟胚愈傷組織用本發(fā)明技術(shù)進(jìn)行基因槍轟擊轉(zhuǎn)化，經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)、抗性篩選與再生，獲得了 52個再生苗，經(jīng)RT-PCR檢測，獲16個轉(zhuǎn)基因陽性植株，轉(zhuǎn)化效率達(dá)3.2%。
【權(quán)利要求】
1.一種小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)成熟胚的選擇與預(yù)處理: 選取當(dāng)年收獲或儲藏I年左右、籽粒飽滿的小麥種子，用無菌水沖洗2次，在無菌條件下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒5min,然后在濃度為0.1%的升萊溶液中浸泡種子15min,無菌水沖洗4次； 消毒后的小麥種子置10mg/L的噻二唑苯基脲(TDZ)溶液中于25°C室溫條件下預(yù)處理 15h ； 2)接種與愈傷組織的誘導(dǎo): 預(yù)處理后的小麥種子用濃度為0.1%的升汞溶液再次消毒lOmin，無菌水洗4次，于無菌條件下剝?nèi)〕墒炫?，接種于成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織； 所述的小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以通用MS培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì):2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D):2.0mg/L，鹽酸硫胺素(VBl):8.0mg/L，水解酪蛋白:500mg/L,L-天門冬酰胺:250mg/L, L-谷氨酰胺:200mg/L ;鹿糖:15000mg/L,麥芽糖:15000mg/L,瓊脂:5000mg/L ； 通用培養(yǎng)基MS的配方為:硝酸鉀(KNO3): 1900mg/L,硝酸氨(NH4NO3): 1650mg/L,氯化鈣(CaCl2.2H20):440mg/L，硫酸鎂(MgSO4.7H20):370mg/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4):170mg/L，硫酸亞鐵(FeSO4.7Η20):27.8mg/L，乙二酸四乙鈉(Na2EDTA):37.3mg/L，硫酸錳(MnSO4.4H20):.22.3mg/L，硫酸鋅(ZnSO4.7Η20):8.6mg/L，硼酸(H3BO3):6.2mg/L，碘化鉀(ΚΙ):0.83mg/L，鑰酸鈉(Na2MoO4.2H20):0.25mg/L，硫酸銅(CuSO4.5H20):0.025mg/L，氯化鈷(CoCl2.6H20):.0.025mg/L,肌醇lOOmg/L,鹽酸硫胺素:0.5mg/L,鹽酸批卩多鋅:0.5mg/L,煙酸:0.5mg/L,甘氨酸:2mg/L ； 調(diào)整成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的PH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘； 3)高滲培養(yǎng): 小麥成熟胚組織誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后陸續(xù)產(chǎn)生成熟胚愈傷組織，挑選誘導(dǎo)12天、質(zhì)地致密的成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)移到高滲培養(yǎng)基中，于20°C黑暗條件高滲培養(yǎng)6h ； 所述的高滲培養(yǎng)基為上述小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中再附加0.2mol/L的甘露醇和0.2mol/L的山梨醇； 4)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化: 經(jīng)高滲處理后的成熟胚愈傷組織用常規(guī)的基因槍轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轟擊轉(zhuǎn)化，基因槍轟擊參數(shù)為:金粉直徑1.0 μ m，阻擋網(wǎng)與轟擊材料之間的距離為9.0cm，可裂膜壓力為llOOPa，每槍金粉/DNA用量為I μ g/60 μ g，每皿材料轟擊2次； 5)恢復(fù)培養(yǎng): 基因槍轟擊后的成熟胚愈傷組織在上述高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)暗培養(yǎng)18h后，將愈傷組織從高滲培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基中，于26°C暗培養(yǎng)13天； 所述的小麥成熟胚愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基以通用MS培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì):2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0):1.511^/1，6-呋喃基氨基嘌呤(1(1'):0.5mg/L，水解酪蛋白:500mg/L, L-天門冬酰胺:250mg/L, L-谷氨酰胺:200mg/L,鹽酸硫胺素(VBl):8.0mg/L,蔗糖:15000mg/L，麥芽糖:15000mg/L，瓊脂:5000mg/L ； 調(diào)整小麥成熟胚愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基的PH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；6)抗性篩選: 恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到抗性篩選培養(yǎng)基上，于26°C、30001x光照下進(jìn)行抗性細(xì)胞篩選，所述抗性篩選培養(yǎng)基以通用MS培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì):2，4_ 二氯苯氧乙酸(2,4-D):1.0mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤(KT):0.5mg/L, α-萘乙酸(NAA):0.01mg/L，水解酪蛋白:500mg/L，L-天門冬酰胺:250mg/L，L-谷氨酰胺:200mg/L，鹽酸硫胺素(VBl):8.0mg/L,卡拉霉素:100mg/L,鹿糖:15000mg/L,麥芽糖:15000mg/L,瓊脂:5000mg/L ； 調(diào)整抗性篩選培養(yǎng)基的PH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；. 7)分化培養(yǎng): 恢復(fù)及篩選培養(yǎng)后的成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為.25~28°C，光照度30001χ，每天光照12h ;篩選再生的成熟胚愈傷組織，并在分化培養(yǎng)基上分化出芽苗； 所述的分化培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基MS為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì):6 —呋喃基氨基嘌呤(KT):.2.0mg/L, α -萘乙酸(NAA):0.01mg/L,酪蛋白:500mg/L,生物素:0.5mg/L,鹽酸硫胺素(VBl):8.0mg/L，蔗糖:15000mg/L，麥芽糖:15000mg/L，瓊脂:5000mg/L ； 調(diào)整分化培養(yǎng)基的PH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力:1.0kg / cm2)滅菌20分鐘； . 8)壯苗、生根培養(yǎng): 待成熟胚愈傷組織分化的芽苗長至2~3片葉時轉(zhuǎn)移到生根、壯苗培養(yǎng)基上，于25°C、.3000Lx光照條件下進(jìn)行壯苗、生根培養(yǎng)； 所述的生根、壯苗培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基MS為基準(zhǔn)，且將MS通用培養(yǎng)的無機(jī)鹽濃度降低一半，其中添加 α —奈乙酸(NAA) 0.5mg/L,鹿糖:30000mg/L,瓊脂:5000mg/L ; 調(diào)整壯苗、生根培養(yǎng)基的PH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；. 9)移植: 在生根、培壯苗養(yǎng)基上，生長健壯的成熟胚愈傷組織再生植株及時移栽到營養(yǎng)缽中，于.15°C,3000Lx光照條件下緩苗，待完全緩苗且進(jìn)一步生長10天后，在3_4°C低溫春化條件下處理20天，即得到轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因株；. 10)分子檢測并篩選: 用常規(guī)的分子檢測技術(shù)對轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因的抗性個體進(jìn)行分子檢測。
【文檔編號】C12N15/82GK103710378SQ201310648037
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】陳耀鋒, 王麗, 李春蓮 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)