一種提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，包括獲取菌種以及將獲取的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵獲得纖維素酶，在纖維素酶發(fā)酵過程中，根據(jù)菌體快速生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時間進(jìn)行分段調(diào)整。本發(fā)明工藝打破了傳統(tǒng)發(fā)酵方法的比較粗放的方法，提出了分段控制發(fā)酵過程參數(shù)，建立了細(xì)致的補(bǔ)料工藝。有效的為產(chǎn)酶提供良好的條件，很大提高了纖維素酶的生產(chǎn)水平，節(jié)省成本，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及到一種提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶是一種多用途酶，它在食品、紡織、造紙、能源、飼料等領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用，特別是生物質(zhì)能源方面。因此針對纖維素酶的研究成為了戰(zhàn)略性的課題。
[0003]纖維素酶是一種復(fù)合酶系，由內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶組成。纖維素酶的生產(chǎn)菌株有細(xì)菌、真菌、放線菌，目前纖維素酶的生產(chǎn)方式主要采用發(fā)酵的方法獲得，其中以里氏木霉菌株液態(tài)發(fā)酵最為廣泛。針對纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)工藝，研究人員已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，最初的纖維素酶發(fā)酵過程中發(fā)酵體系的溫度基本不變，且溶氧和PH值條件都是最初設(shè)置好后就不再進(jìn)行人工干預(yù)，事實(shí)上，因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中菌體的生長的生理活動導(dǎo)致發(fā)酵體系的溫度、溶氧和pH值后期都會發(fā)生一些變化，這些變化對發(fā)酵過程不一定是有利的，基于此，專利號為201110388282.3的“一種提高利用木霉菌生產(chǎn)酸性纖維素酶的產(chǎn)量的生產(chǎn)方法”已經(jīng)對纖維素酶發(fā)酵過程中的pH值進(jìn)行了初步的人工調(diào)整，也得到了有益的效果。
[0004]鑒于此，本發(fā)明通過對里氏木霉發(fā)酵過程的深入研究，提出了分段控制發(fā)酵過程參數(shù)，建立了細(xì)致的補(bǔ)料工藝。有效的為產(chǎn)酶提供良好的條件，提高了纖維素酶的生產(chǎn)水平。該工藝同時也 適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，用于高效產(chǎn)生纖維素酶。本發(fā)明對微生物的代謝規(guī)律進(jìn)行研究，根據(jù)發(fā)酵纖維素酶的菌種的菌體快速生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件比如溫度、溶氧和發(fā)酵體系中纖維素含量等按照發(fā)酵時間進(jìn)行分段調(diào)整，達(dá)到提高纖維素酶產(chǎn)量的目的。
[0006]本發(fā)明用于解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案為:
[0007]—種提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，包括獲取菌種以及將獲取的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵獲得纖維素酶，在纖維素酶發(fā)酵過程中，在發(fā)酵開始后的前36~48h為菌種的菌體快速生長期，在開始發(fā)酵后的36~48h直至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期，根據(jù)菌體快速生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時間進(jìn)行分段調(diào)整:
[0008]在發(fā)酵開始后的前36~48h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)高為27~29°C，之后發(fā)酵體系溫度調(diào)低為25~27°C，直至發(fā)酵結(jié)束；
[0009]在發(fā)酵開始后的前24~36h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為40~70%，之后發(fā)酵體系中溶氧調(diào)低為20%~50%，直至發(fā)酵結(jié)束；
[0010]在發(fā)酵開始后的第18~48h和在發(fā)酵開始后的第72~132h兩個時間段內(nèi)向所述發(fā)酵體系內(nèi)緩慢添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液添加流速為8~16mL/min，所述葡萄糖溶液的濃度為200~400g/L。
[0011]優(yōu)選的是，所述纖維素酶發(fā)酵工藝包括:
[0012](3)獲取菌種:將所述菌種接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得種子培養(yǎng)液；
[0013](4)將菌種的所述種子培養(yǎng)液按照體積比為1: 25~3: 50的比例接種到發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中制成發(fā)酵體系，以纖維素為底物開始纖維素酶發(fā)酵。
[0014]優(yōu)選的是，在發(fā)酵開始后的前36~48h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)高為28°C，之后發(fā)酵體系溫度調(diào)低為26°C，直至發(fā)酵結(jié)束。
[0015]優(yōu)選的是，在發(fā)酵開始后的前24~36h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為50%，之后發(fā)酵體系中溶氧調(diào)低為30%，直至發(fā)酵結(jié)束。
[0016]優(yōu)選的是，在纖維素酶發(fā)酵過程中的35~45h內(nèi)發(fā)酵體系pH值調(diào)高為4.8~5.2，之后發(fā)酵體系pH在35~45h到55~65h調(diào)低為4.3~4.7,之后,在纖維素酶發(fā)酵過程的第55~65h直至發(fā)酵結(jié)束再將發(fā)酵體系的pH調(diào)高為4.8~5.2。
[0017]優(yōu)選的是，在纖維素酶發(fā)酵過程中的35~45h內(nèi)發(fā)酵體系pH值調(diào)高為5.0，之后發(fā)酵體系pH在35~45h到55~65h調(diào)低為4.5,之后,在纖維素酶發(fā)酵過程的第55~65h直至發(fā)酵結(jié)束再將發(fā)酵體系的PH調(diào)高為5.0。
[0018]優(yōu)選的是，在纖維素酶發(fā)酵開始后24~132h內(nèi)每隔6_12h填加纖維素一次，纖維素添加方法為:
[0019](I)將纖維素與水混合成濃度為150~300g/L的纖維素和水的混合液；
[0020](2)按所述混合液與發(fā)酵體系的體積比為1: 15~1: 50向所述發(fā)酵體系中添加所述混合液。
[0021]優(yōu)選的是，所述纖維素為微晶纖維素。
[0022]優(yōu)選的是，所述纖維素酶發(fā)酵開始后的90~IOOh之后，每隔10~14h抽樣檢測所述發(fā)酵體系的濾紙酶活一次，直至兩次抽樣檢測所述發(fā)酵體系的濾紙酶活不再增加時結(jié)束所述纖維素酶發(fā)酵過程。
[0023]優(yōu)選的是，所述菌種為里氏木霉CCIC13052。
[0024]本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明通過對里氏木霉發(fā)酵過程的深入研究，提出了提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，包括菌種培養(yǎng)和纖維素酶發(fā)酵，其中，所述纖維素酶發(fā)酵過程為:將培養(yǎng)后的菌種培養(yǎng)液按照體積比為1: 25~3: 50的比例接種到發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中制成發(fā)酵體系開始纖維素酶發(fā)酵；在纖維素酶發(fā)酵過程中按時間分段調(diào)控發(fā)酵體系的溫度、溶氧、PH以及添加纖維素和添加葡萄糖。本發(fā)明工藝打破了傳統(tǒng)發(fā)酵方法的比較粗放的方法，提出了分段控制發(fā)酵過程參數(shù)，建立了細(xì)致的補(bǔ)料工藝。有效的為產(chǎn)酶提供良好的條件，很大提高了纖維素酶的生產(chǎn)水平，節(jié)省成本，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0026]本發(fā)明中所用的菌種里氏木霉(Trichoderma reesei CCIC13052)ATCC56765由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)購得。[0027]本發(fā)明所述提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，包括獲取菌種以及將獲取的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵獲得纖維素酶，在纖維素酶發(fā)酵過程中，在發(fā)酵開始后的前36~48h為菌種的菌體快速生長期，在開始發(fā)酵后的36~48h直至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期，根據(jù)菌體快速生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時間進(jìn)行分段調(diào)整:
[0028]在發(fā)酵開始后的前36~48h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)高為27~29°C，之后發(fā)酵體系溫度調(diào)低為25~27°C，直至發(fā)酵結(jié)束；
[0029]在發(fā)酵開始后的前24~36h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為40~70%，之后發(fā)酵體系中溶氧調(diào)低為20%~50%，直至發(fā)酵結(jié)束；
[0030]在發(fā)酵開始后的第18~48h和在發(fā)酵開始后的第72~132h兩個時間段內(nèi)向所述發(fā)酵體系內(nèi)緩慢添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液添加流速為8~16mL/min，所述葡萄糖溶液的濃度為200~400g/L。
[0031]所述纖維素酶發(fā)酵工藝包括:[0032](I)獲取菌種:將所述菌種接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得種子培養(yǎng)液；
[0033](2)將菌種的所述種子培養(yǎng)液按照體積比為1: 25~3: 50的比例接種到發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中制成發(fā)酵體系，以纖維素為底物開始纖維素酶發(fā)酵。
[0034]在發(fā)酵開始后的前36~48h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)高為28°C，之后發(fā)酵體系溫度調(diào)低為26°C，直至發(fā)酵結(jié)束。
[0035]在發(fā)酵開始后的前24~36h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為50%，之后發(fā)酵體系中溶氧調(diào)低為30%，直至發(fā)酵結(jié)束。
[0036]在纖維素酶發(fā)酵過程中的35~45h內(nèi)發(fā)酵體系pH值調(diào)高為4.8~5.2，之后發(fā)酵體系pH在35~45h到55~65h調(diào)低為4.3~4.7,之后,在纖維素酶發(fā)酵過程的第55~65h直至發(fā)酵結(jié)束再將發(fā)酵體系的pH調(diào)高為4.8~5.2。
[0037]在纖維素酶發(fā)酵過程中的35~45h內(nèi)發(fā)酵體系pH值調(diào)高為5.0，之后發(fā)酵體系pH在35~45h到55~65h調(diào)低為4.5,之后,在纖維素酶發(fā)酵過程的第55~65h直至發(fā)酵結(jié)束再將發(fā)酵體系的pH調(diào)高為5.0。
[0038]在纖維素酶發(fā)酵開始后24~132h內(nèi)每隔6_12h填加纖維素一次，纖維素添加方法為:
[0039](I)將纖維素與水混合成濃度為150~300g/L的纖維素和水的混合液；
[0040](2)按所述混合液與發(fā)酵體系的體積比為1: 15~1: 50向所述發(fā)酵體系中添加所述混合液。
[0041]所述纖維素為微晶纖維素。
[0042]所述纖維素酶發(fā)酵開始后的90~IOOh之后，每隔10~14h抽樣檢測所述發(fā)酵體系的濾紙酶活一次，直至兩次抽樣檢測所述發(fā)酵體系的濾紙酶活不再增加時結(jié)束所述纖維素酶發(fā)酵過程。
[0043]所述菌種為里氏木霉CCIC13052。
[0044]根據(jù)上述方法進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵:
[0045]實(shí)施例1
[0046]纖維素酶活力測定[0047]本發(fā)明涉及的酶活力測定為濾紙酶活。
[0048]本發(fā)明涉及的各種酶活力同意定義為:lmin水解底物產(chǎn)生相當(dāng)于Ιμπιο?葡萄糖的還原糖量所需要的酶的量為一個酶活力單位，用IU表示。
[0049]所述的酶活檢測方法均根據(jù)國際方法IUPAC進(jìn)行。
[0050]濾紙酶活力的測定方法:1ml粗酶液，在50±0.1°C，ρΗ4.8的條件下，水解50± Img濾紙Ih所產(chǎn)生的還原糖的量，用DNS法測定還原糖的生成量。
[0051]實(shí)施例2
[0052](1)菌種獲取:將里氏木霉(Trichoderma reesei CICC13052)菌株接種于PDA斜面,于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d。然后將PDA斜面培養(yǎng)基上活化后的菌株制備成濃度為2 X IO7個/mL的抱子懸液，按照3%的接種量接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中，于28°C，轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分的搖床上震蕩培養(yǎng)。
[0053](2)將培養(yǎng)24h后的種子液按照5%接種量接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中(5L發(fā)酵罐裝液量為2.5L)進(jìn)行培養(yǎng)，在纖維素酶發(fā)酵過程中，在發(fā)酵開始后的前36~48h為菌種的菌體快速生長期，在開始發(fā)酵后的36h直至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期，根據(jù)菌體快速生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時間進(jìn)行分段調(diào)整:
[0054]在發(fā)酵開始后的前36h內(nèi)發(fā)酵體系溫度為27°C，之后發(fā)酵體系溫度調(diào)低為25V,直至發(fā)酵結(jié)束；
[0055]在發(fā)酵開始后的前24h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧為40%，之后發(fā)酵體系中溶氧調(diào)低為20%，直至發(fā)酵結(jié)束；
[0056]在發(fā)酵開始后的第18~36h和在發(fā)酵開始后的第72~84h兩個時間段內(nèi)向所述發(fā)酵體系內(nèi)緩慢添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液添加流速為8mL/min，所述葡萄糖溶液的濃度為200g/L ；
[0057]在纖維素酶發(fā)酵過程中的35h內(nèi)發(fā)酵體系pH值為4.8，之后發(fā)酵體系pH在35h到55h調(diào)低為4.3，之后，在纖維素酶發(fā)酵過程的第55~65h直至發(fā)酵結(jié)束再將發(fā)酵體系的pH調(diào)聞為4.8 ;
[0058]在纖維素酶發(fā)酵開始后24~132h內(nèi)每隔6h填加纖維素一次，纖維素添加方法為:將纖維素與水混合成濃度為150g/L的纖維素和水的混合液；之后向2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基中加入50mL纖維素混合液；
[0059]發(fā)酵160h結(jié)束，采用國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)推薦的國際標(biāo)準(zhǔn)方法測定發(fā)酵液酶活，得到濾紙酶活為20.68IU/mL。
[0060]其中，
[0061]發(fā)酵過程中采用氨水和硫酸調(diào)節(jié)pH ;
[0062]種子培養(yǎng)基組成為:微晶纖維素2 玉米漿I %，葡萄糖I %，調(diào)節(jié)pH為4.5。
[0063]發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:微晶纖維素3.3%，玉米漿1.7%，(NH4) 2S040.4 %，KH2PO40.6%，甘油 0.25%，葡萄糖 I %, MgSO40.1%，調(diào)節(jié)初始 5.0。
[0064]另外，以生產(chǎn)階段中對發(fā)酵過程不進(jìn)行控制的情況作為空白實(shí)驗(yàn)，經(jīng)比較，采用本發(fā)明方法進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵之后獲得濾紙酶活相對于空白試驗(yàn)的濾紙酶活為14.2IU/mL提聞了 45.6 。
[0065]實(shí)施例3[0066](I)菌種獲取:將里氏木霉(Trichoderma reesei CICC13052)菌株接種于PDA斜面,于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d。然后將PDA斜面培養(yǎng)基上活化后的菌株制備成濃度為2 X IO7個/mL的抱子懸液，按照3%的接種量接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中，于28°C，轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分的搖床上震蕩培養(yǎng)。其中，種子培養(yǎng)基組成為:微晶纖維素2%，玉米漿1%，葡萄糖1%，調(diào)節(jié)pH為4.5。
[0067](2)將培養(yǎng)24h后的種子液按照5%接種量接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中(5L發(fā)酵罐裝液量為2.5L)進(jìn)行培養(yǎng)，在纖維素酶發(fā)酵過程中，在發(fā)酵開始后的前36~48h為菌種的菌體快速生長期，在開始發(fā)酵后的36~48h直至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期，根據(jù)菌體快速生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時間進(jìn)行分段調(diào)整:
[0068]在發(fā)酵開始后的前36~48h內(nèi)發(fā)酵體系溫度為28°C，之后發(fā)酵體系溫度調(diào)低為26°C，直至發(fā)酵結(jié)束；
[0069]在發(fā)酵開始后的前24~36h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧為50%，之后發(fā)酵體系中溶氧調(diào)低為30%，直至發(fā)酵結(jié)束；
[0070]在發(fā)酵開始后的第18~48h和在發(fā)酵開始后的第72~132h兩個時間段內(nèi)向所述發(fā)酵體系內(nèi)緩慢添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液添加流速分別為12mL/min和10mL/min，所述葡萄糖溶液的濃度為300g/L ；
[0071]在纖維素酶發(fā)酵過程中的35~45h內(nèi)發(fā)酵體系pH值為5.0，之后發(fā)酵體系pH在35~45h到55~65h調(diào)低為4.5,之后,在纖維素酶發(fā)酵過程的第55~65h直至發(fā)酵結(jié)束再將發(fā)酵體系的pH調(diào)高為5.0 ; [0072]在纖維素酶發(fā)酵開始后24~132h內(nèi)每隔6_12h填加纖維素一次，纖維素添加方法為:將纖維素與水混合成濃度為250g/L的纖維素和水的混合液；之后向2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基中加入IOOmL纖維素混合液；
[0073]發(fā)酵168h結(jié)束，采用國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)推薦的國際標(biāo)準(zhǔn)方法測定發(fā)酵液酶活，得到濾紙酶活為23.42IU/mL。
[0074]其中，
[0075]發(fā)酵過程中采用氨水和硫酸調(diào)節(jié)pH ；
[0076]發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:微晶纖維素3.3%，玉米漿1.7%，(NH4) 2S040.4 %，KH2PO40.6%，甘油 0.25%，葡萄糖 I %, MgSO40.1%，調(diào)節(jié)初始 5.0。
[0077]另外，以生產(chǎn)階段中對發(fā)酵過程不進(jìn)行控制的情況作為空白實(shí)驗(yàn)，經(jīng)比較，采用本發(fā)明方法進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵之后獲得濾紙酶活相對于空白試驗(yàn)的濾紙酶活為14.2IU/mL提聞了 64.9 。
[0078]實(shí)施例4
[0079](I)菌種獲取:將里氏木霉(Trichoderma reesei CICC13052)菌株接種于PDA斜面,于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d。然后將PDA斜面培養(yǎng)基上活化后的菌株制備成濃度為2 X IO7個/mL的抱子懸液，按照3%的接種量接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中，于28°C，轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分的搖床上震蕩培養(yǎng)。其中，種子培養(yǎng)基組成為:微晶纖維素2%，玉米漿1%，葡萄糖1%，調(diào)節(jié)pH為4.5。
[0080](2)將培養(yǎng)24h后的種子液按照5%接種量接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中(5L發(fā)酵罐裝液量為2.5L)進(jìn)行培養(yǎng)，在纖維素酶發(fā)酵過程中，在發(fā)酵開始后的前36~48h為菌種的菌體快速生長期，在開始發(fā)酵后的36~48h直至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期，根據(jù)菌體快速生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時間進(jìn)行分段調(diào)整:
[0081]在發(fā)酵開始后的前36~48h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)高為29°C，之后發(fā)酵體系溫度調(diào)低為25~27°C，直至發(fā)酵結(jié)束；[0082]在發(fā)酵開始后的前24~36h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為70%，之后發(fā)酵體系中溶氧調(diào)低為50%，直至發(fā)酵結(jié)束；
[0083]在發(fā)酵開始后的第18~48h和在發(fā)酵開始后的第72~132h兩個時間段內(nèi)向所述發(fā)酵體系內(nèi)緩慢添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液添加流速為16mL/min，所述葡萄糖溶液的濃度為200~400g/L ；
[0084]在纖維素酶發(fā)酵過程中的35~45h內(nèi)發(fā)酵體系pH值為5.2，之后發(fā)酵體系pH在35~45h到55~65h調(diào)低為4.7,之后,在纖維素酶發(fā)酵過程的第55~65h直至發(fā)酵結(jié)束再將發(fā)酵體系的pH調(diào)高為5.2 ;
[0085]在纖維素酶發(fā)酵開始后24~132h內(nèi)每隔6_12h填加纖維素一次，纖維素添加方法為:將纖維素與水混合成濃度為300g/L的纖維素和水的混合液；之后向2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基中加入150mL纖維素混合液；
[0086]發(fā)酵150h結(jié)束，采用國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)推薦的國際標(biāo)準(zhǔn)方法測定發(fā)酵液酶活，得到濾紙酶活為22.34IU/mL。
[0087]其中，
[0088]發(fā)酵過程中采用氨水和硫酸調(diào)節(jié)pH ；
[0089]發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:微晶纖維素3.3%，玉米漿1.7%，(NH4) 2S040.4 %，KH2PO40.6%，甘油 0.25%，葡萄糖 I %, MgSO40.1%，調(diào)節(jié)初始 5.0。
[0090]另外，以生產(chǎn)階段中對發(fā)酵過程不進(jìn)行控制的情況作為空白實(shí)驗(yàn)，經(jīng)比較，采用本發(fā)明方法進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵之后獲得濾紙酶活相對于空白試驗(yàn)的濾紙酶活為14.2IU/mL提聞了 57.3 。
[0091]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的實(shí)施例。
【權(quán)利要求】
1.一種提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，包括獲取菌種以及將獲取的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵獲得纖維素酶，在纖維素酶發(fā)酵過程中，在發(fā)酵開始后的前36~48h為菌種的菌體快速生長期，在開始發(fā)酵后的36~48h直至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期，根據(jù)菌體快速生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時間進(jìn)行分段調(diào)整: 在發(fā)酵開始后的前36~48h內(nèi)發(fā)酵體系溫度為27~29°C，之后發(fā)酵體系溫度調(diào)低為25~27°C，直至發(fā)酵結(jié)束； 在發(fā)酵開始后的前24~36h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧為40~70%，之后發(fā)酵體系中溶氧調(diào)低為20%~50%，直至發(fā)酵結(jié)束； 在發(fā)酵開始后的第18~48h和在發(fā)酵開始后的第72~132h兩個時間段內(nèi)向所述發(fā)酵體系內(nèi)緩慢添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液添加流速為8~16mL/min，所述葡萄糖溶液的濃度為200~400g/L。
2.如權(quán)利要求1所述的提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，包括: (1)獲取菌種:將所述菌種接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得種子培養(yǎng)液； (2)將菌種的所述種子培養(yǎng)液按照體積比為1: 25~3: 50的比例接種到發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中制成發(fā)酵體系，以纖維素為底物開始纖維素酶發(fā)酵。
3.如權(quán)利要求2所述的提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，在發(fā)酵開始后的前36~48h內(nèi)發(fā)酵體系溫度為28°C，之后發(fā)酵體系溫度調(diào)低為26°C，直至發(fā)酵結(jié)束。
4.如權(quán)利要求3所述的提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，在發(fā)酵開始后的前24~36h內(nèi)發(fā)酵體系中溶`氧為50 %，之后發(fā)酵體系中溶氧調(diào)低為30 %，直至發(fā)酵結(jié)束。
5.如權(quán)利要求4所述提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，在纖維素酶發(fā)酵過程中的35~45h內(nèi)發(fā)酵體系pH值調(diào)高為4.8~5.2，之后發(fā)酵體系pH在35~45h到55~65h調(diào)低為4.3~4.7，之后，在纖維素酶發(fā)酵過程的第55~65h直至發(fā)酵結(jié)束再將發(fā)酵體系的PH調(diào)高為4.8~5.2。
6.如權(quán)利要求5所述提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，在纖維素酶發(fā)酵過程中的35~45h內(nèi)發(fā)酵體系pH值為5.0,之后發(fā)酵體系pH在35~45h到55~65h調(diào)低為4.5，之后，在纖維素酶發(fā)酵過程的第55~65h直至發(fā)酵結(jié)束再將發(fā)酵體系的pH調(diào)筒為5.0 ο
7.如權(quán)利要求6所述的提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，在纖維素酶發(fā)酵開始后24~132h內(nèi)每隔6-12h添加纖維素一次，纖維素添加方法為: (1)將纖維素與水混合成濃度為150~300g/L的纖維素和水的混合液； (2)按所述混合液與發(fā)酵體系的體積比為1: 15~1: 50向所述發(fā)酵體系中添加所述混合液。
8.如權(quán)利要求7所述的提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述纖維素為微晶纖維素。
9.如權(quán)利要求1~8中任一項所述的提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述纖維素酶發(fā)酵開始后的90~IOOh之后，每隔10~14h抽樣檢測所述發(fā)酵體系的濾紙酶活一次，直至兩次抽樣檢測所述發(fā)酵體系的濾紙酶活不再增加時結(jié)束所述纖維素酶發(fā)酵過程。
10.如權(quán)利要求9所述的提高纖維素酶生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述菌種為里氏木霉CCIC13 052。
【文檔編號】C12N9/42GK103602648SQ201310653126
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】李晨, 張東遠(yuǎn), 馬立娟, 赫榮琳, 賈文娣, 張粲, 陳樹林 申請人:中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所