一種內(nèi)切葡聚糖酶生產(chǎn)菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明構(gòu)建了一種黑曲霉工程菌，能高效表達(dá)來源于草酸青霉的內(nèi)切葡聚糖酶基因，搖瓶發(fā)酵酶活可達(dá)900U/mL；本發(fā)明獲得的重組內(nèi)切葡聚糖酶的最適作用pH為4.0，最適溫度為45℃，在pH5.0-7.0范圍內(nèi)酶活損失不高于5%，可廣泛應(yīng)用于紡織加工【技術(shù)領(lǐng)域】。
【專利說明】一種內(nèi)切葡聚糖酶生產(chǎn)菌株
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于微生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種內(nèi)切葡聚糖酶生產(chǎn)菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶是一類能夠降解纖維素，使之生成纖維二糖、葡萄糖等一系列酶的總稱，按各酶功能的不同可以分為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。纖維素被它降解后可轉(zhuǎn)化為人類急需的能源、食物、化工原料，對(duì)于人類社會(huì)解決食物短缺和能源危機(jī)具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]纖維素廣泛存在于自然界的生物體中，細(xì)菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。一般用于生產(chǎn)的纖維素酶來自于真菌，比較典型的是木霉屬、曲霉屬和青霉屬。
[0004]纖維素酶成本高以及酶活力低已經(jīng)成為制約纖維素酶廣泛應(yīng)用的兩大瓶頸，因此構(gòu)建高效表達(dá)的基因工程菌是降低纖維素酶成本、提高產(chǎn)量的有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種內(nèi)切葡聚糖酶生產(chǎn)菌株。本發(fā)明通過將草酸青霉{Penicillium oxalicum)的內(nèi)切葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化入黑曲霉中，獲得高效生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的黑曲霉工程菌株，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006]本發(fā)明一方面涉及一種黑曲霉工程菌，其攜帶有能表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的重組質(zhì)粒。
[0007]所述重組質(zhì)粒含有草酸青霉的內(nèi)切葡聚糖酶基因。
[0008]所述內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
[0009]所述內(nèi)切葡聚糖酶的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。
[0010]本發(fā)明的另一方面涉及上述黑曲霉工程菌在生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明構(gòu)建的黑曲霉工程菌能高效表達(dá)來源于草酸青霉的內(nèi)切葡聚糖酶基因，搖瓶發(fā)酵酶活可達(dá)900U/mL ;本發(fā)明獲得的重組內(nèi)切葡聚糖酶的最適作用pH為4.0，最適溫度為45°C，在pH5.0-7.0范圍內(nèi)酶活損失不高于5%，可廣泛應(yīng)用于紡織加工【技術(shù)領(lǐng)域】，具有除毛干凈，對(duì)織物強(qiáng)力損失小的特點(diǎn)，有利于推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為黑曲霉EG-1發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析圖，其中泳道I為對(duì)照組，泳道2為黑曲霉EG-1發(fā)酵上清液，箭頭所指處即為重組表達(dá)的內(nèi)切葡聚糖酶。
【具體實(shí)施方式】
[0013]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，因?yàn)樗鼈兛梢愿淖儭?br> [0014]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通計(jì)數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale etal.，2003)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語的一般性解釋。
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0016]實(shí)施例1內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆 1.1草酸青霉總DNA的提取
將草酸青霉(ora/icw?)過夜培養(yǎng),取適量菌體置于離心管中，13000 rpm離心 5 min，棄上清；加入 400 μ I 抽提緩沖液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mMNaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；65°C水浴20min后，加入200 μ I 10Μ NH4AC,冰浴IOmin ;13000rpm離心lOmin，取上清；加入2倍體積的無水乙醇，_20°C放置30min ； 13000 rpm離心lOmin，棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存。利用OMEGA公司的E.Z.N.A.Fungal RNA Kit制備草酸青霉的mRNA，其制備過程參照試劑盒的操作手冊(cè)。
[0017]基因克隆
以1.1中提取的草酸青霉基因組總DNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為 95。。4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C lmin 30 個(gè)循環(huán)；72°C，7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0018]將回收的擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接到pMD18-T載體，獲得克隆載體pMD_EG2，送至北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序分析，獲得的核苷酸序列為SEQ ID N0:2，用blast分析表明擴(kuò)增片段為草酸青霉的內(nèi)切葡聚糖酶基因，其編碼氨基酸序列為為SEQ ID N0:1，為一新的等位基因。
[0019]實(shí)施例2黑曲霉工程菌的構(gòu)建
2.1表達(dá)載體構(gòu)建
將1.2中得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Xba I單酶切。同樣，對(duì)黑曲霉表達(dá)質(zhì)粒pGAMD也進(jìn)行Xba I單酶切。利用PCR純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。用T4連接酶把酶切產(chǎn)物即克隆基因和表達(dá)載體22°C連接過夜。最后，把連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a ;然后通過PCR驗(yàn)證連接正確與否，最后將相應(yīng)的陽性克隆表達(dá)質(zhì)粒命名為pGAMD-EGl。
[0020]原生質(zhì)體制備
接種黑曲霉菌絲于PDA平板上生長(zhǎng)4天；切取直徑約3cm的菌落置于約IOOmL CMAC 2%麥芽提取物、2%葡萄糖，0.1%細(xì)菌蛋白胨)的液體培養(yǎng)基中，30°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜；多層紗布過濾收集菌絲；將菌絲置于盛有20 mL裂解酶液(Sigma L1412)酶解2_3小時(shí)；取出酶解液，加入0.8M MgSO4溶液，輕輕搖晃，倒于三層滅菌擦鏡紙過濾，收集濾液，3000rpm,離心10 min ;棄上清，加10 mL 1.2M山梨醇懸浮，然后3000 rpm,離心10 min ;加適量山梨醇懸浮分裝(200 μ?7管·，IO8個(gè)/mL)。
[0021]轉(zhuǎn)化與驗(yàn)證
取IOPg pGAMD-EGl DNA加入到200μ?原生質(zhì)體中，接著加入50μ? 25%PEG輕輕混勻，室溫靜置20 min ;然后加2mL 25%PEG，輕輕混勻，室溫靜置5min，把原生質(zhì)體加到50 mL左右熔化后冷卻至45-55°C的上層半固體培養(yǎng)基(0.059%乙酰胺，0.152%KH2P04,0.34%CsCl，
0.052%KC1，1%葡萄糖，21.85%山梨醇，0.35%瓊脂糖)，輕輕混勻后倒入下層基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板(0.059% 乙酰胺，0.152%KH2P04，0.34%CsC1,0.052%KC1,1% 葡萄糖，1% 瓊脂粉)，30°C黑暗培養(yǎng)數(shù)天至轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子。將獲得的一株工程菌命名為黑曲霉EG-1{Aspergillus niger EG-1)。
[0022]實(shí)施例3發(fā)酵與酶活測(cè)定
3.1搖瓶表達(dá)
將黑曲霉工程菌EG-1接種于50mL黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基(1.2 % NaN03，0.05 % KC1，
0.15% KH2PO4,0.205% MgSO4.7Η20，0.35% NaH2PO4.Η20，7% 檸檬酸鈉，4.5% 胰蛋白大豆肉湯，微量元素lmL，4.1%葡萄糖)，30°C培養(yǎng)4-5天，離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)分析。結(jié)果如圖1所示，在50kDa處有一蛋白條帶，即為重組表達(dá)的內(nèi)切葡聚糖酶，重組蛋白大小與預(yù)測(cè)的一致。
[0023]實(shí)施例4酶學(xué)性質(zhì)分析
4.1最適作用pH值
用 pH 值分別為 2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的緩沖液
進(jìn)行稀釋測(cè)定，在溫度45° C條件下測(cè)定酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做pH-相對(duì)酶活曲線。結(jié)果顯示:本發(fā)明的重組表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的最適作用PH4.0。
[0024]最適作用溫度
分別在 30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、7(TC，ρΗ5.0 的條件下測(cè)定酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做溫度-相對(duì)酶活曲線。結(jié)果顯示:本發(fā)明的重組表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的最適作用溫度為45°C。
[0025]實(shí)施例4內(nèi)切葡聚糖酶在針織面料、梭織面料的除毛染色方面的應(yīng)用 處理原料:針織面料、梭織面料；
酶的用量:0.1-3.0g/L ；
處理?xiàng)l件:35-55°C，處理時(shí)間為30-150分鐘，pH范圍為4.0-9.5 ；
適用的浴比范圍:1:5-1:30 ;
設(shè)備類型:溢流染色機(jī)，卷染機(jī)，水洗機(jī)等；
本發(fā)明獲得的重組內(nèi)切葡聚糖酶具有除毛干凈，對(duì)織物強(qiáng)力損失小的特點(diǎn)，有利于推廣應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1.一種宿主細(xì)胞，其攜帶有能表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的重組質(zhì)粒。
2.如權(quán)利要求1所述宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為黑曲霉niger)。
3.如權(quán)利要求1所述宿主細(xì)胞，其特征在于，所述內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸序列為SEQID NO:1。
4.如權(quán)利要求1所述宿主細(xì)胞，其特征在于，所述內(nèi)切葡聚糖酶的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。
5.權(quán)利要求1所述宿主細(xì)胞在生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/15GK103667085SQ201310653617
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】李佩佩, 許麗紅, 王華明, 黃亦鈞 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司