鯉皰疹病毒Ⅱ型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用。該細(xì)胞系保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為：CCTCCNO：C2013179。該異育銀鯽腦組織細(xì)胞系生長(zhǎng)狀態(tài)良好，對(duì)目前難以用常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系培養(yǎng)的CyHV-2敏感；CyHV-2在GiCB細(xì)胞上連續(xù)傳代至第6代仍可檢測(cè)到病毒核酸且細(xì)胞病變穩(wěn)定；將出現(xiàn)病變效應(yīng)的細(xì)胞做超薄電鏡切片，可在GiCB細(xì)胞中觀察到大量CyHV-2成熟病毒粒子及其復(fù)制過(guò)程。本發(fā)明所構(gòu)建的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法重復(fù)性強(qiáng)，條件科學(xué)合理，適用于體外培養(yǎng)鯉皰疹病毒Ⅱ型，為鯉皰疹病毒Ⅱ型的分離、檢測(cè)、培養(yǎng)及其完整的生物學(xué)特性研究提供了技術(shù)平臺(tái)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水生生物細(xì)胞領(lǐng)域和水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系，還涉及該細(xì)胞系的建立方法，還涉及該細(xì)胞系的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鯉皰疫病毒II型(Cyprinid herpesvirus II, CyHV-2)又被稱(chēng)為皰疫病毒性造血器官壞死病病毒(Herpesviral haematopoietic necrosis virus,HVHNV)或金魚(yú)造血器官壞死病毒(Goldf ish haematopoietic necrosis virus, GFHNV),與鯉科魚(yú)類(lèi)的其他兩種皰疫病毒 CyHV-1 (Carp pox)和 CyHV-3 (Koi herpesvirus, KHV)同屬 Alloherpesviridae科，Cypriniviruse屬。CyHV-2于1995年首次被報(bào)道，1992~1993年間給日本西部養(yǎng)殖的金魚(yú)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，患病金魚(yú)死亡率高達(dá)100%。隨后其他國(guó)家和地區(qū)也相繼有了該病暴發(fā)的報(bào)道，1997年春季在美國(guó)西海岸一用循環(huán)水養(yǎng)殖的金魚(yú)幼魚(yú)出現(xiàn)大量死亡，死亡率高達(dá)80%以上，后經(jīng)證實(shí)是由CyHV-2感染。觀賞魚(yú)的國(guó)際貿(mào)易很大程度上促進(jìn)了該病的全球傳播，隨后我國(guó)臺(tái)灣、澳大利亞、英國(guó)養(yǎng)殖的金魚(yú)相繼暴發(fā)該病。2011年匈牙利報(bào)道了養(yǎng)殖的銀鯽也發(fā)現(xiàn)了 CyHV-2感染。2009年起，在我國(guó)鯽魚(yú)的主要養(yǎng)殖區(qū)江蘇省暴發(fā)了由CyHV-2引起的鯽魚(yú)造血器官壞死病，截至2012年6月中旬，江蘇省內(nèi)射陽(yáng)、大豐、鹽都、寶應(yīng)、高郵、興化、洪澤、楚州等地病害發(fā)生面積超過(guò)10萬(wàn)畝，發(fā)病塘口的死亡率高達(dá)90%，造成的經(jīng)濟(jì)損失已達(dá)數(shù)億元。與此同時(shí)，在湖北、湖南、江西、黑龍江等省份，也相繼在患病鯽魚(yú)體內(nèi)檢測(cè)出CyHV-2。該病毒傳染性強(qiáng)、致死率高，給鯽魚(yú)、金魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅鯽魚(yú)、金魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。
[0003]細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)是最準(zhǔn)確的病毒病診斷方法，通常是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的魚(yú)類(lèi)病毒檢測(cè)的首選方法。但已有研究發(fā)現(xiàn)CyHV-2很難在魚(yú)類(lèi)病毒分離常用的細(xì)胞系中進(jìn)行增殖。胖頭鯉細(xì)胞(`fathead minnow cells, FHM)、鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(epithelioma popuasum cuprini, EPC)、獲鱺腎細(xì)胞(eel kidney, EK-1)、鮭魚(yú)胚胎細(xì)胞(chinook salmon embryo, CHSE-214)、虹蹲魚(yú)性腺細(xì)胞(rainbow trout gonad, RTG-2)和羅非魚(yú)卵巢細(xì)胞(tilapia ovary，T0-2)均對(duì)CyHV-2不敏感，僅錦鯉鰭細(xì)胞(koi finl，KF-1)能產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，但病毒在KF-1細(xì)胞上傳至第3代后，CPE消失且檢測(cè)不到病毒核酸。由于缺乏CyHV-2敏感的細(xì)胞系，限制了對(duì)CyHV-2的研究，因此建立對(duì)CyHV-2敏感的細(xì)胞系并研究該細(xì)胞系的生物學(xué)特性，對(duì)CyHV-2進(jìn)行連續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)從而深入研究病毒的特性，具有重要的意義。本發(fā)明建立了用于分離培養(yǎng)鯉皰疹病毒II型的敏感細(xì)胞系GiCB，該細(xì)胞系的應(yīng)用還包括但不局限于:分子細(xì)胞水平上開(kāi)展鯉皰疹病毒II型及其他魚(yú)類(lèi)病毒理化特性、形態(tài)發(fā)生、病毒感染途徑、感染機(jī)理；制備、篩選或評(píng)價(jià)魚(yú)類(lèi)抗病毒藥物。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供了一種鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系。該細(xì)胞系可用于分離，檢測(cè)，分離培養(yǎng)鯉皰疹病毒II型病毒。該細(xì)胞系已于2013年11月29日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，分類(lèi)命名:異育銀鯽腦組織細(xì)胞系(Gibelcarp, Carassius auratus gibelio) GiCB,保藏編號(hào):CCTCC NO:C2013179,地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系的建立方法，方法簡(jiǎn)單，易行。
[0006]本發(fā)明最后一個(gè)目的在于提供了一種鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系的應(yīng)用。該細(xì)胞系可以用于分離、檢測(cè)和培養(yǎng)鯉皰疹病毒II型；用于對(duì)CyHV-2進(jìn)行體外連續(xù)傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)從而深入研究該病毒的特性。
[0007]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:
[0008]一種鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系的建立方法，步驟如下:
[0009](I)腦組織的處理:無(wú)菌條件下取出異育銀鯽腦組織，無(wú)菌處理為50~IOOmm3的組織塊；(2)原代培養(yǎng):將步驟(1)中的組織塊放入組織分離專(zhuān)用胰蛋白酶消化液中消化10~15min，期間震蕩3~4次，加入等體積的異育銀鯽腦組織細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為培養(yǎng)液)，吹打均勻，離心收集經(jīng)消化處理的細(xì)胞，吸棄上清，添加培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞沉淀，將制成的細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每2天半量更換培養(yǎng)液一次；
[0010](3)傳代培養(yǎng):原代培養(yǎng)異育銀鯽腦組織細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，加入0.25%ff/V的胰蛋白酶消化液靜置消化2分鐘， 用培養(yǎng)液懸起細(xì)胞，按I瓶傳2瓶的方式進(jìn)行傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞再次形成單層后，按照上述的細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法進(jìn)行下一次傳代培養(yǎng)，得到來(lái)源于異育銀鯽腦組織的鯉皰疹病毒II型敏感細(xì)胞系GiCB，該細(xì)胞系已于2013年11月29日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，分類(lèi)命名:異育銀鯽腦組織細(xì)胞系(Gibelcarp, Carassius auratus gibelio) GiCB,保藏編號(hào):CCTCC NO:C2013179,地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0011]異育銀鯽腦組織細(xì)胞系GiCB，為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，最佳培養(yǎng)基為M199，最適血清體積分?jǐn)?shù)為20% (V/V)，最適培養(yǎng)溫度為25°C。GiCB細(xì)胞經(jīng)液氮冷凍后復(fù)蘇，通過(guò)染色，約80%的細(xì)胞具有細(xì)胞活性，并保持原有生長(zhǎng)狀態(tài)，該細(xì)胞已經(jīng)穩(wěn)定傳代65次。
[0012]所述的組織分離專(zhuān)用胰蛋白酶消化液為0.5%~0.7%W/V胰蛋白酶消化液，細(xì)胞培養(yǎng)、傳代的溫度為25~28°C，pH值7.0~7.4。
[0013]所述的異育銀鯽腦組織細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液為含有10~20%V/V胎牛血清、10~20ng/ml人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10~20ng/ml人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、100U/ml青霉素、100 u g/ml鏈霉素、0.25 u g/ml兩性霉素B，pH值7.0~7.4的M199培養(yǎng)液。
[0014]一種鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系的應(yīng)用，包括該細(xì)胞系在鯉皰疹病毒II型培養(yǎng)上的應(yīng)用；該細(xì)胞系在鯉皰疹病毒II型檢測(cè)上的應(yīng)用；該細(xì)胞系在鯉皰疹病毒II型分離上的應(yīng)用；該細(xì)胞系在制備鯉皰疹病毒II型病疫苗上的應(yīng)用；該細(xì)胞系在其他魚(yú)類(lèi)病毒分離檢測(cè)上的應(yīng)用；該細(xì)胞系在作為抗鯉皰疹病毒II型藥物篩選生物模型上的應(yīng)用；該細(xì)胞系在魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染和研究基因功能上的應(yīng)用。
[0015]所述的鯉皰疹病毒II型為鯉皰疹病毒II型野生毒株或已報(bào)道的鯉皰疹病毒II型分離株。
[0016]利用巢式PCR檢測(cè)方法，對(duì)在GiCB細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代的鯉皰疹病毒II型DNA檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)在GiCB細(xì)胞連續(xù)傳代第6代仍可檢測(cè)到病毒核酸；細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)穩(wěn)定且明顯；將出現(xiàn)病變效應(yīng)的細(xì)胞做超薄電鏡切片觀察，透射電鏡結(jié)果顯示，在GiCB細(xì)胞中存在CyHV-2成熟病毒粒子及其復(fù)制過(guò)程，證明CyHV-2在GiCB細(xì)胞中具有良好的生物學(xué)活性。
[0017]對(duì)送檢的CyHV-2疑似臨床病料，在巢式PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的基礎(chǔ)上，利用本發(fā)明所建立的GiCB細(xì)胞系接種疑似病料后，12d即可觀察到細(xì)胞空泡化、細(xì)胞相互融合、細(xì)胞單層脫落等細(xì)胞病變；對(duì)送檢的CyHV-2疑似臨床病料進(jìn)行連續(xù)傳代超過(guò)5次，巢式PCR仍可檢測(cè)到該病毒的存在。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0019](1)已有研究發(fā)現(xiàn)CyHV-2很難在魚(yú)類(lèi)病毒分離常用的細(xì)胞系中進(jìn)行增殖。胖頭鯉細(xì)胞(fathead minnow cells, FHM)、鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(epithelioma popuasumcuprini, EPC) > 獲鱺腎細(xì)胞(eel kidney, EK-1) > 鮭魚(yú)胚胎細(xì)胞(chinook salmonembryo, CHSE-214)、虹蹲魚(yú)性腺細(xì)胞(rainbow trout gonad, RTG-2)和羅非魚(yú)卵巢細(xì)胞(tilapia ovary, T0-2)均對(duì)CyHV-2不敏感，僅錦鯉鰭細(xì)胞(koi finl, KF-1)能產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，但病毒在KF-1細(xì)胞上傳至第3代后，CPE消失且檢測(cè)不到病毒核酸。而本發(fā)明采用分離培養(yǎng)對(duì)CyHV-2易感的異育銀鯽的腦組織細(xì)胞，建立了對(duì)CyHV-2敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系；
[0020](2)本發(fā)明對(duì)在GiCB細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代的鯉皰疹病毒II型DNA檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)在GiCB細(xì)胞連續(xù)傳代第6代仍可檢測(cè)到病毒核酸；細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)穩(wěn)定且明顯；將出現(xiàn)病變效應(yīng)的細(xì)胞做超薄電鏡切片觀察，透射電鏡結(jié)果顯示，在GiCB細(xì)胞中存在CyHV-2成熟病毒粒子及其復(fù)制過(guò)程，證明CyHV-2在GiCB細(xì)胞中具有良好的生物學(xué)活性。
[0021]本發(fā)明立足于鯉皰疹病毒II型的分離、檢測(cè)及培養(yǎng)，建立CyHV-2敏感細(xì)胞系GiCB，為CyHV-2的分離鑒定及其完整的生物學(xué)特性的研究提供了必要的技術(shù)平臺(tái)，為鯽魚(yú)、金魚(yú)造血器官壞死癥的防控奠定了重要的基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為不同代次異育銀鯽腦組織細(xì)胞GiCB示意圖。
[0023]圖1中A為原代異育銀鯽腦組織細(xì)胞；圖1中B為第32代異育銀鯽腦組織細(xì)胞
系O
[0024]圖2為第6代異育銀鯽腦組織細(xì)胞系的染色體及其數(shù)目分布示意圖。
[0025]圖3為異育銀鯽腦組織細(xì)胞系感染CyHV-2后示意圖。
[0026]圖3中A為GiCB正常對(duì)照細(xì)胞；圖3中B為GiCB細(xì)胞感染CyHV_2第I代12d ；圖3中C為GiCB細(xì)胞感染CyHV-2第3代12d ;圖3中D為GiCB細(xì)胞感染CyHV-2第6代12d。
[0027]圖4為不同培養(yǎng)代次CyHV-2的巢式PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖。
[0028]M:DL2000Marker ；Linel:CyHV-2 組織毒對(duì)照；Line2:第 I 代 GiCB 細(xì)胞培養(yǎng)CyHV-2細(xì)胞毒；Line3:第2代GiCB細(xì)胞培養(yǎng)CyHV-2細(xì)胞毒；Line4 --第3代GiCB細(xì)胞培養(yǎng)CyHV-2細(xì)胞毒；Line5:第4代GiCB細(xì)胞培養(yǎng)CyHV_2細(xì)胞毒；Line6:第5代GiCB細(xì)胞培養(yǎng)CyHV-2細(xì)胞毒；Line7:第6代GiCB細(xì)胞培養(yǎng)CyHV-2細(xì)胞毒；Line8:陰性對(duì)照
[0029]圖5為第5代CyHV-2細(xì)胞毒感染GiCB的細(xì)胞電鏡超薄切片示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下為結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明實(shí)施例所用試劑，如未特別說(shuō)明，均購(gòu)自生化商店；所用實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如未特別說(shuō)明，均為常規(guī)技術(shù)。
[0031]本發(fā)明具體實(shí)施例中涉及的材料及試劑:
[0032]I)實(shí)驗(yàn)魚(yú)與毒株
[0033]異育銀鯽，體重約50g，體長(zhǎng)約12cm，來(lái)源于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所窯灣實(shí)驗(yàn)基地。實(shí)驗(yàn)前于室內(nèi)暫養(yǎng)I周。鯉皰疹病毒II型由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。
[0034]2)主要試劑與耗材
[0035]M199細(xì)胞培養(yǎng)基、兩性霉素B、青霉素/鏈霉素、磷酸緩沖液(PBS)、胰蛋白酶-EDTA、二甲基亞砜(DMS0)、秋水仙素均購(gòu)自Sigma公司；人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子為P印rotech公司產(chǎn)品；胎牛血清購(gòu)自GIBICO公司；DNAzol核酸提取試劑為Invitrogen產(chǎn)品；PCR用rTaq酶、dNTPs為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、移液管、細(xì)胞凍存管均購(gòu)自Corning公司；制備透射電鏡超薄切片所需試劑及耗材均購(gòu)自北京中興百瑞公司。
[0036]3)主要儀器設(shè)備`
[0037]II 級(jí)生物安全柜(ESCO);倒置顯微鏡(Nikon) ;CCD 相機(jī)(Nikon NIS ElementsF530);低速冷凍離心機(jī)(3K15，Sigma);恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo, MIR-153);液氮罐(MVE);超薄切片機(jī)(UC7，Leica);透射電子顯微鏡(H-7650，Hitachi)
[0038]實(shí)施例1:
[0039]異育銀鯽腦組織細(xì)胞系的建立，其步驟如下:
[0040]( I)腦組織的處理:無(wú)菌條件下取出異育銀鯽腦組織置于培養(yǎng)皿中，PBS漂洗3次，用滅菌的眼科剪子剪成50~IOOmm3的組織塊；
[0041](2)原代培養(yǎng):將剪碎的組織塊放入0.5ff/V%胰蛋白酶消化液中28°C消化15min，期間震蕩3次，消化結(jié)束后加入等體積的異育銀鯽腦組織細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為培養(yǎng)液，培養(yǎng)液配方為含有20V/V%胎牛血清、10ng/ml人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10ng/ml人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、100U/ml青霉素、IOOii g/ml鏈霉素、0.25 u g/ml兩性霉素B的M199培養(yǎng)基)，吹打均勻后用100目尼龍紗網(wǎng)過(guò)濾一次，收集過(guò)濾液至離心管中，1500rpm離心5min收集經(jīng)消化過(guò)濾處理的細(xì)胞，吸棄上清，再加入培養(yǎng)液吹打均勻后用300目尼龍紗網(wǎng)過(guò)濾一次，收集過(guò)濾液，1000rpm離心5min得到細(xì)胞沉淀；添加培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞沉淀，將制成的細(xì)胞懸液加入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)，每2天半量更換培養(yǎng)液一次；
[0042](3)傳代培養(yǎng):原代培養(yǎng)異育銀鯽腦組織細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸棄原培養(yǎng)液，加入2ml0.25ff/V%的胰蛋白酶消化液室溫靜置消化2分鐘，吸棄胰蛋白酶消化液，加入IOml異育銀鯽腦組織細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液，吹打瓶底細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按I瓶傳2瓶的方式進(jìn)行傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞再次形成單層后，按照上述的細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法進(jìn)行下一次傳代培養(yǎng)，至細(xì)胞系建立。當(dāng)傳代培養(yǎng)至第6代后，異育銀鯽腦組織細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液中不再添加人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B。傳代GiCB細(xì)胞約2天或3天即可鋪滿(mǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部80%左右形成匯合細(xì)胞單層，5天可形成致密細(xì)胞單層，即可進(jìn)行下次傳代培養(yǎng)。如圖1所示，A為原代異育銀鯽腦組織細(xì)胞；B為第32代異育銀鯽腦組織細(xì)胞系。
[0043]該細(xì)胞系已于2013年11月29日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，保藏編號(hào):CCTCC N0.C2013179，分類(lèi)命名:異育銀鯽腦組織細(xì)胞系GiCB，地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0044]實(shí)施例2:
[0045]異育銀鯽腦組織細(xì)胞系GiCB的生物學(xué)特性:
[0046](I)形態(tài)學(xué):細(xì)胞類(lèi)型為成纖維樣細(xì)胞。
[0047](2)生長(zhǎng)特性:傳代的GiCB細(xì)胞30min后開(kāi)始貼壁，8h后貼壁完全；群體倍增時(shí)間為 50.5h。
[0048](3)穩(wěn)定性:異育銀鯽腦組織細(xì)胞系GiCB至申請(qǐng)日前已傳至65代，增殖穩(wěn)定。
[0049](4)凍存與復(fù)蘇: [0050]GiCB細(xì)胞復(fù)蘇后貼壁快速，生長(zhǎng)形態(tài)、狀況與沒(méi)有凍存的細(xì)胞基本相似，未出現(xiàn)明顯差別。復(fù)蘇細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色，經(jīng)細(xì)胞統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)，約(80.38±5.10)%的細(xì)胞不著色，具有細(xì)胞活性。
[0051](5)染色體分析
[0052]第6代異育銀鯽腦組織細(xì)胞系GiCB處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入終濃度為20 μ g/ml的秋水仙素，25°C孵育4h后消化收集細(xì)胞，用0.075mol/L的KCl溶液低滲處理25min后加入預(yù)冷的卡諾固定液，1000rpm離心5min去上清后再用預(yù)冷的卡諾固定液固定3次,每次15min。冷滴片法滴片,干燥后用5%Giemsa染色25min,干燥后顯微鏡觀察。在觀察的100個(gè)分裂相細(xì)胞中，第6代異育銀鯽腦組織來(lái)源細(xì)胞的染色體眾數(shù)為212條(圖2)，與人工培育四倍體異育銀鯽(桂建芳等，異育銀鯽人工繁育群體中復(fù)合四倍體的發(fā)現(xiàn)及其育種潛力，科學(xué)通報(bào)，1992，07 =646-648 ;桂建芳等，人工復(fù)合四倍體異育銀鯽雌核發(fā)育生殖方式的初步證明，科學(xué)通報(bào)，1992，09:836-838)體染色體特征吻合，即銀鯽的全部染色體162條加鯉魚(yú)的一個(gè)染色體組(50條染色體)。
[0053]實(shí)施例3:
[0054]鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系的應(yīng)用，其過(guò)程如下:
[0055]( I)感染鯉皰疹病毒II型病料的采集及處理
[0056]采集剛死亡的感染鯉皰疹病毒II型的病魚(yú)腎臟和脾臟，剪碎并加等體積PBS勻漿，6000rpm4 °C離心30min后經(jīng)0.22 μ m濾膜過(guò)濾制備成無(wú)菌組織勻漿液，分裝后保存與-80°C備用；
[0057](2)鯉皰疹病毒II型在GiCB的增殖
[0058]GiCB培養(yǎng)至 細(xì)胞單層80%后，棄去培養(yǎng)基經(jīng)PBS清洗2遍后，將上述處理過(guò)的病料組織勻衆(zhòng)液上清Iml接種于GiCB細(xì)胞單層,加入終濃度為10 μ g/ μ I聚凝胺(Polybrene),25°C吸附2h，期間每隔15~20min輕微晃動(dòng)培養(yǎng)瓶一次以便均勻吸附。待吸附結(jié)束后，換血清濃度為2%的M199維持液繼續(xù)25°C培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)，至病變達(dá)80%后收
獲病毒。
[0059](3 )鯉皰疹病毒II型細(xì)胞毒核酸的提取及巢式PCR檢測(cè)
[0060]將出現(xiàn)明顯病變的GiCB細(xì)胞反復(fù)凍融2次后經(jīng)DNAzol提取病毒DNA。利用巢式PCR檢測(cè)CyHV-2的方法檢測(cè)該病毒。外引物Pl的PCR擴(kuò)增，引物
[0061]CyHV-2PlF 為:TGAAATGTCAAAAGTGGATGG ；
[0062]CyHV-2PlR 為:TATTCCCAGACAGCCTTCAAA
[0063]取擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸40秒，30個(gè)循環(huán)后72 °C 5分鐘；內(nèi)引物P2的PCR擴(kuò)增，引物
[0064]CyHV-2P2F 為:GAACACCGCTGCTCATCATC
[0065]CyHV-2P2R 為:ACTCTTCGCAAGTCCTCACC
[0066]取Iy L外引物Pl的擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，以?xún)?nèi)引物F 2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件與第一次擴(kuò)增相同。同時(shí)取陽(yáng)性對(duì)照DNA模板做陽(yáng)性對(duì)照，取純水做陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0067](4)鯉皰疹病毒II型感染GiCB的電鏡觀察
[0068]將感染第5代CyHV-2細(xì)胞毒的GiCB細(xì)胞經(jīng)2%戊二醛固定后，四氧化鋨再固定，再經(jīng)脫水包埋后進(jìn)行超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，透射電鏡觀察。
[0069](5)結(jié)果
[0070]鯉皰疹病毒II型病魚(yú)組織勻漿接種與GiCB細(xì)胞單層IOd后出現(xiàn)細(xì)胞變圓或空泡化、回縮、形成合胞體、細(xì)胞間隙變大；12d后GiCB細(xì)胞融合并形成多核巨細(xì)胞、細(xì)胞單層脫落產(chǎn)生拉網(wǎng)現(xiàn)象，出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，并且傳代至第6代CPE穩(wěn)定(圖3)，而正常的GiCB細(xì)胞未見(jiàn)任何變化。
[0071 ] 提取不同培養(yǎng)代數(shù)的CyHV-2細(xì)胞培養(yǎng)物DNA，進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)，經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增得到357bp的片段，與陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增條帶大小一致(圖4)，結(jié)果均判定為陽(yáng)性。
[0072] 通過(guò)透射電鏡觀察感染第5代CyHV-2細(xì)胞毒的GiCB細(xì)胞，可觀察到大量成熟的CyHV-2病毒粒子及其復(fù)制過(guò)程·，說(shuō)明CyHV-2在GiCB細(xì)胞中具有良好的生物學(xué)活性(圖5)，進(jìn)一步證明了本發(fā)明所建立的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系對(duì)病毒的敏感性，可用于病毒的分離，培養(yǎng)及檢測(cè)。同時(shí)，可作為研究鯉皰疹病毒II型生物學(xué)特性的細(xì)胞模型，制備鯉皰疹病毒II型的疫苗及抗病毒藥物篩選。
【權(quán)利要求】
1.一種鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系，其特征在于:異育銀鯽腦組織細(xì)胞系(Gibel carp, Carassius auratus gibelio) GiCB, CCTCC NO:C2013179。
2.權(quán)利要求1所述細(xì)胞系的建立方法，具體步驟如下: (1)腦組織的處理:無(wú)菌條件下取出異育銀鯽腦組織，無(wú)菌處理為5(T100mm3的組織塊； (2)原代培養(yǎng):將步驟(1)中的組織塊放入組織分離專(zhuān)用胰蛋白酶消化液中消化l(Tl5min，期間震蕩3~4次，加入等體積的異育銀鯽腦組織細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液，吹打均勻，離心收集經(jīng)消化處理的細(xì)胞，吸棄上清，添加培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞沉淀，將制成的細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每2天半量更換培養(yǎng)液一次； (3)傳代培養(yǎng):原代培養(yǎng)異育銀鯽腦組織細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，加入0.25%ff/V的胰蛋白酶消化液靜置消化2分鐘，用培養(yǎng)液懸起細(xì)胞，按I瓶傳2瓶的方式進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞再次形成單層后，按照上述的細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法進(jìn)行下一次傳代培養(yǎng)，得到一種異育銀鯽腦組織的鯉皰疹病毒II型敏感細(xì)胞系GiCB ； 所述的組織分離專(zhuān)用胰蛋白酶消化液為0.59T0.7% W/V胰蛋白酶消化液； 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代的溫度為25~28°C，pH值7.(T7.4 ； 所述的異育銀鯽腦組織細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液為含有1(T20% V/V胎牛血清、l(T20ng/ml人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、l(T20ng/ml人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、100U/ml青霉素、lOOl^g/ml鏈霉素、0.25lVml兩性霉素B，pH值7.0~7.4的M199培養(yǎng)液。
3.權(quán)利要求1所述細(xì)胞系在鯉皰疹病毒II型分離中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述細(xì)胞系在鯉皰疹病毒II型培養(yǎng)中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述細(xì)胞系在鯉皰疹病毒II型檢測(cè)中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述細(xì)胞系在制備鯉皰疹病毒II型病疫苗中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述細(xì)胞系在作為抗鯉皰疹病毒II型藥物篩選生物模型中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK103667176SQ201310658939
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】馬杰, 曾令兵, 江南, 陳倩, 趙輝 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所