一種海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145晶體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型海洋低溫堿性脂肪酶Bohai?Sea-9145晶體及其制備方法。該晶體為短棱柱狀形貌,其空間結(jié)構(gòu)為精細(xì)三維結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)中含有371個(gè)氨基酸，含有8個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)和9個(gè)β折疊結(jié)構(gòu);結(jié)構(gòu)中具有，，α=β=γ=90°晶包元，晶體的蛋白空間群為I4，其蓋子域的位置為絲氨酸（S112）-苯丙氨酸（F122）。絲氨酸（S195），天冬氨酸（A258）和組氨酸（H318）構(gòu)成其“催化三聯(lián)體”，酪氨酸（T110）與亮氨酸（L193）組成其氧負(fù)離子空洞區(qū)。該晶體是一類重要的生物催化劑，具有低溫催化活力高、在堿性條件下性質(zhì)穩(wěn)定、與金屬離子及表面活性劑配伍性好等一系列優(yōu)點(diǎn)，可以被廣泛應(yīng)用于日化、食品加工及醫(yī)藥等低溫催化領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】一種海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145晶體及其制備
方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海洋微生物領(lǐng)域，特別是涉及一種新型海洋低溫堿性脂肪酶BohaiSea-9145晶體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶作為一個(gè)具有上百年歷史的古老酶種，近年來(lái)隨著細(xì)胞工程、基因工程、蛋白質(zhì)工程等技術(shù)的興起，其在生物能源、食品加工及醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大、重新煥發(fā)出新的活力。目前在美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)中報(bào)道的脂肪酶基因已達(dá)4000余個(gè)(包括假單胞菌、酵母菌、葡萄球菌、鏈霉菌和枯草桿菌等眾多微生物來(lái)源的脂肪酶基因)，晶體結(jié)構(gòu)約200個(gè)，而且仍在迅猛增加。 [0003]脂肪酶的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用依賴于酶本身的底物特異性，而脂肪酶的底物特異性取決于酶的分子結(jié)構(gòu)，特別是酶活性中心的三維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)對(duì)于了解其生物功能、設(shè)計(jì)藥物以及蛋白質(zhì)藥物的基因工程等方面具有非常重要的作用。目前，X-射線單晶衍射方法是通過(guò)蛋白質(zhì)單晶獲得其三維結(jié)構(gòu)的最重要的研究方法之一。對(duì)于X-射線單晶衍射方法，蛋白質(zhì)單晶必須達(dá)到足夠大的尺寸和完善程度。然而，由于溶液中蛋白質(zhì)分子之間的相互作用位點(diǎn)較少，相互作用力比較弱，蛋白質(zhì)晶體中往往含有很大比重的水，因此，內(nèi)部結(jié)構(gòu)比較規(guī)整的蛋白質(zhì)晶體仍舊很難獲得。獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體仍舊是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的瓶頸問(wèn)題。
[0004]海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145是一類重要的生物催化劑，具有低溫催化活力高、在堿性條件下性質(zhì)穩(wěn)定、與金屬離子及表面活性劑配伍性好等一系列優(yōu)點(diǎn)，可以被廣泛應(yīng)用于日化、食品加工及醫(yī)藥等低溫催化領(lǐng)域，具有極大的市場(chǎng)前景與應(yīng)用潛力。然而該酶對(duì)中、短鏈(C< 12)的底物有較好的水解能力，對(duì)大分子底物的催化效果并不理想。因此，對(duì)海洋酵母脂肪酶Bohai Sea-9145開(kāi)展晶體培養(yǎng)及結(jié)構(gòu)解析，對(duì)確定其活性中心、底物結(jié)合模式、深入研究其催化機(jī)制以及小分子抑制劑的設(shè)計(jì)具有重要的理論指導(dǎo)意義和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的海洋脂肪酶Bohai Sea-9145晶體結(jié)構(gòu)相同的公開(kāi)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，發(fā)明人在長(zhǎng)期從事海洋微生物的開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)及應(yīng)用實(shí)踐過(guò)程中，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，在已篩選得到的適冷性海洋酵母Bohai Sea-9145的低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145及其基因序列的前期專利基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)提供一種新型海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145晶體及其制備方法。
[0006]本發(fā)明的新型海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145晶體的制備方法，包括下列步驟:
[0007]I)結(jié)晶(生長(zhǎng))緩沖液的配制[0008]結(jié)晶緩沖液由沉淀劑硫酸銨和pH值緩沖液組成，所述沉淀劑硫酸銨使所述蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出來(lái)的中性鹽，質(zhì)量百分含量為20-30%;所述pH值緩沖液為乙酸鈉溶液，緩沖液的摩爾濃度為0.1-0.3M, pH值4.0-5.2;優(yōu)選為:摩爾濃度為0.1M、pH為4.6的乙酸鈉緩沖液，其中含沉淀劑硫酸銨質(zhì)量百分含量為20%;
[0009]2)海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145水溶液的配制
[0010]將酶活力為4000U/mL的海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145配制成濃度為10-20毫克/毫升的水溶液；優(yōu)選為:將酶活力為4000U/mL海洋低溫堿性脂肪酶BohaiSea-9145 配制為 10mg/ml 水溶液。
[0011]3)結(jié)晶液的配制: [0012]將步驟2)的海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145水溶液按體積比1:1進(jìn)行接種到步驟I)的晶體緩沖溶液中；采用懸滴法將所述結(jié)晶液置于培養(yǎng)箱中，15_25°C培養(yǎng)3-5天得到海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145晶體。優(yōu)選為:由上述步驟配制的I μ L結(jié)晶緩沖液、lyL20mg/ml的海洋低溫堿性脂肪酶水溶液；利用懸滴法，將上述結(jié)晶液置于塑料蓋玻片上，然后將該結(jié)晶液滴倒扣于24孔結(jié)晶板上，中間縫隙用凡士林密封，至于20°C的生物培養(yǎng)箱進(jìn)行晶體培養(yǎng)，三天后置于偏光顯微鏡下采集晶體照片，如圖1所示，所得晶體為短棱柱狀形貌。
[0013]本發(fā)明提供的海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145晶體進(jìn)行X射線衍射，X射線衍射數(shù)據(jù)收集步驟如下:首先使用的尼龍晶體環(huán)(如Hampton Research公司的),從晶體浸泡液中獲取適宜X射線衍射的晶體，并迅速使用冷卻系統(tǒng)(如Oxford Cryosystem公司的)產(chǎn)生的低溫氮?dú)饬髦欣鋬鲋亮阆?50-180°C ;使X射線通過(guò)晶體，利用旋進(jìn)法收集X射線衍射數(shù)據(jù)。收集到晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)后，按照下述步驟進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理:首先使用HKL2000等軟件對(duì)上一步驟中收集得到的衍射數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得完整的數(shù)據(jù)文件；其次，使用CCP4程序包中的Phaser、MoIrep等軟件，利用分子置換(MR,Molecular Replacement)方法，以解脂耶氏酵母脂肪酶(PDBid:300D)、嗜熱(腐質(zhì)霉)腐植脂肪酶(PDBid:1DT3)和真菌脂肪酶(PDBid:1TIA)為搜索模型，得到海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)。
[0014]海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145晶體為短棱柱狀形貌，其空間結(jié)構(gòu)為精細(xì)三維結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中具有a=b=128.87 Α,0171.77Α, α=β = y=90°晶包元；所述晶體的蛋白空間群為14，其蓋子域的位置為絲氨酸(S112)-苯丙氨酸(F122)。絲氨酸(S195)，天冬氨酸(Α258)和組氨酸(Η318)構(gòu)成其“催化三聯(lián)體”，酪氨酸(TllO)與亮氨酸(L193)組成其氧負(fù)離子空洞區(qū)(圖2、3)。
[0015]本發(fā)明提供的海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145晶體及其制備方法中，所述海洋微生物(酵母)Bohai Sea-9145低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145是從渤海海域海泥中分離獲得的高產(chǎn)低溫堿性脂肪酶的海洋微生物Bohai Sea-9145 (低溫堿性脂肪酶的編號(hào)以區(qū)別其它低溫堿性脂肪酶，或下文簡(jiǎn)稱脂肪酶)的適冷性海洋酵母菌株，根據(jù)第四版《The Yeasts, A Taxonmic study》，(Kurtzman&Fell, 1998)確定為適冷性海洋解脂耶羅氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica Bohai Sea-9145) 一個(gè)新的亞種(本文稱適冷性海洋酵母菌株BohaiSea-9145),該適冷性海洋酵母菌株于2003年11月26日保藏于中國(guó)武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCCN0:M203095。[0016]產(chǎn)酶菌株的發(fā)酵培養(yǎng)
[0017]將適冷性海洋酵母菌株BohaiSea-9145在生化培養(yǎng)箱中平板上于25°C培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)基(wt%)為蛋白胨3%，牛肉浸膏2%，KH2PO40.2%、MgS040.05%,橄欖油0.5%，以Na2HPO4調(diào)節(jié)PH為6.5-7.0得到菌落奶酪狀、奶白色，不反光，邊緣波浪狀，有樹根狀突起。并在工業(yè)搖床上于pH5.0,接種量6%，種齡21h，250ml三角搖瓶裝量10ml，培養(yǎng)基的碳氮組成為4wt% 豆餅粉，4wt% 花生柏，4wt% 米糠和 0.5wt% 粗制花生油，MgSO40.05wt%、KH2PO40.2wt%,pH5.0于26± I°C接種培養(yǎng)23小時(shí)，得發(fā)酵液，將發(fā)酵上清液，加入三氯甲烷(VCH3CL: V上清液=5:100)進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，?°C靜置30分，以4000rpm離心40分鐘，去除雜蛋白并收集上清液，此脂肪酶比活最高為15828u/g，純度提高1.2倍。取萃取上清液經(jīng)IOOKDa中空纖維柱進(jìn)行超濾，再以IOKDa中空纖維柱濃縮，脂肪酶比活為41288u/g，提高3.3倍。并以CMSepharose FF陽(yáng)離子交換層析柱進(jìn)行層析，分步收集洗脫液，測(cè)定其低溫堿性脂肪酶比活為206224u/g，純度提高5.0倍(脂肪酶活性的測(cè)定:采用中華人民共和國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(中華人民共和國(guó)輕工業(yè)部1993)。脂肪酶的水解活力單位定義為:以脂肪酶水解油脂，每分鐘產(chǎn)生I μ mol脂肪酸的酶量，定義為一個(gè)脂肪酶活力單位)。
[0018]由上述產(chǎn)酶菌株的發(fā)酵培養(yǎng)得到海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶，其經(jīng)CMSepharose純化得到電泳純的低溫堿性脂肪酶以SDS-PAGE按Laemmli法進(jìn)行分析為單一蛋白條帶，分子量為38Kda ;最適反應(yīng)溫度35°C,最適pH為8.5 ;穩(wěn)定溫度低于35°C,穩(wěn)定pH范圍為4.0-9.0 ;與常規(guī)金屬離子配伍性:
[0019]
【權(quán)利要求】
1.一種海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145晶體，其特征在于該脂肪酶晶體為短棱柱狀形貌，其空間結(jié)構(gòu)為精細(xì)三維結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中含有371個(gè)氨基酸，含有8個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)和9個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)；晶體結(jié)構(gòu)中具有a=b=128.87 A，C=]71.77A, α=β =Y=90°晶包元，晶體的蛋白空間群為14，其蓋子域的位置為絲氨酸(S112)-苯丙氨酸(F122)，絲氨酸(S195)，天冬氨酸(Α258)和組氨酸(Η318)構(gòu)成其“催化三聯(lián)體”，酪氨酸(TllO)與亮氨酸(L193)組成其氧負(fù)離子空洞區(qū)。
2.—種權(quán)利要求1的海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145晶體的制備方法，包括下列步驟: O結(jié)晶緩沖液配制 結(jié)晶緩沖液由沉淀劑硫酸銨和pH值緩沖液組成，所述沉淀劑硫酸銨使所述蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出來(lái)的中性鹽，質(zhì)量百分含量為20-30%;所述pH值緩沖液為乙酸鈉溶液，緩沖液的摩爾濃度為0.1-0.3M, pH值4.0-5.2; 2)海洋低溫堿性脂肪酶BohaiSea-9145水溶液的配制 將酶活力為4000U/mL的海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145配制成濃度為10-20毫克/毫升的水溶液； 3)結(jié)晶培養(yǎng) 將步驟2的海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145水溶液按體積比1:1接種到步驟1所述的晶體緩沖溶液中；采用懸滴法將所述結(jié)晶液置于培養(yǎng)箱中，15_25°C培養(yǎng)3-5天得到海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145晶體。
3.根椐權(quán)利要求2的海洋低溫堿性脂肪酶BohaiSea-9145晶體的制備方法，其特征在于所述PH值緩沖液的摩爾濃度為0.1Μ、PΗ為4.6的乙酸鈉緩沖液，其中含沉淀劑硫酸銨質(zhì)量百分含量為20%;所述將酶活力為4000U/mL海洋低溫堿性脂肪酶Bohai Sea-9145配制為10mg/ml水溶液。
【文檔編號(hào)】C12N9/20GK103642772SQ201310662327
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】盛軍, 孫謐, 郝建華, 徐甲坤, 王躍軍 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所