一種耐超高溫液化淀粉酶的制備方法
【專利摘要】一種基因重組菌發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10的方法,將NAD激酶基因轉(zhuǎn)入高效表達還原性輔酶Q10的菌株；所述的重組菌優(yōu)化的培養(yǎng)條件為：（1）斜面活化；（2）種子培養(yǎng)；（3）發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明通過基因工程手段構(gòu)建的重組菌，穩(wěn)定性強，其輔酶Q10產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了21.6%，達到1.63g/L，能夠達到工業(yè)生產(chǎn)的要求。
【專利說明】一種耐超高溫液化淀粉酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種淀粉酶的制備方法，尤其是涉及一種在高溫下仍然有較高活力的用于淀粉液化的淀粉酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]淀粉廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、造紙、石油等領(lǐng)域，發(fā)展前景非常廣闊。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，淀粉、淀粉糖和淀粉衍生物等新產(chǎn)品的不斷增多及淀粉深加工產(chǎn)品的開發(fā)，加快并推動了淀粉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0003]我國淀粉及淀粉制品行業(yè)發(fā)展迅速，淀粉總產(chǎn)量以年均10-15%左右的速度遞增，已成為世界最大的淀粉生產(chǎn)國之一，為淀粉深加工產(chǎn)品的開發(fā)與生產(chǎn)奠定了相當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)基礎(chǔ)。
[0004]目前，全世界淀粉的主要來源是玉米、木薯、小麥等。
[0005]現(xiàn)有生產(chǎn)耐高溫液化淀粉酶的方法主要存在以下不足:一是生產(chǎn)成本相對較高；二是制備得到的淀粉酶耐受的溫度很難超過100°c，用于淀粉液化效果不理想；三是多數(shù)企業(yè)是將發(fā)酵液用硫酸銨鹽析或酒精沉淀，經(jīng)過濾干燥而成固體淀粉酶，這種產(chǎn)品含有殘渣、硫酸銨等雜質(zhì)，應(yīng)用范圍受到限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種生產(chǎn)成本低，可耐超高溫，產(chǎn)品質(zhì)量 好的液化淀粉酶的制備方法。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種耐超高溫的液化淀粉酶的制備方法，包括以下步驟:
步聚1，瓊脂培養(yǎng)基接種培養(yǎng):(I)瓊脂培養(yǎng)基準備:培養(yǎng)基配方為，胰蛋白胨 1.0-1.5 %，酵母膏 0.5-0.7 %, NaCl 0.9-1.1 %，瓊脂 1.8-2.1 %，可溶性淀粉0.25-0.30%，pH6.5-7.0，其余為水；將所述配料混勻后，放于培養(yǎng)皿中，0.09-0.1lMPaMPa (優(yōu)選0.1MPa)滅菌30-35min，冷卻到室溫，制成瓊脂復(fù)壯培養(yǎng)基，備用；(2)接種與培養(yǎng):將保存的地衣芽孢桿菌環(huán)移取1-2環(huán)放于每個培養(yǎng)皿的瓊脂培養(yǎng)基上，置于36°C ±1°C恒溫培養(yǎng)60-70h，取出保存，制成瓊脂培養(yǎng)基菌種；
步聚2，擴大培養(yǎng):(I)擴大培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.7%,NaCl
0.9-1.1%，可溶性淀粉 0.25-0.30%，ρΗ6.5-7.0，其余為水；0.09-0.1lMPa (優(yōu)選 0.1MPa)滅菌30-35min，冷卻至39-41 °C (優(yōu)選40°C )，制成擴大培養(yǎng)基，備用；(2)擴大培養(yǎng)方法:取步聚I制成的瓊脂培養(yǎng)基菌種，按擴大培養(yǎng)基重0.8%的接種量，接種到冷卻至39-41°C (優(yōu)選40°C )的擴大培養(yǎng)基，360C ± 1°C恒溫培養(yǎng)60-70小時，恒溫培養(yǎng)時，不斷攪拌通風(fēng)，攪拌速度為300-320轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量為1.3-1.5立方氣體/升擴大培養(yǎng)基/分鐘，制成擴大培養(yǎng)液；
步聚3，液態(tài)發(fā)酵制備:(I)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方=(NH4)SO40.22-0.27 %, KH2PO40.30-0.37%,CaCl20.015-0.02%，可溶性淀粉 0.25-0.30%，胰蛋白胨 0.35-0.45%，玉米粉 2.9-3.5%, pH6.5-7.0，其余為水；0.09-0.1lMPa MPa (優(yōu)選 0.1MPa)滅菌 30_35min，冷卻至39-41°C(優(yōu)選40°C )，制成液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，備用；⑵液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng):取步聚2制成的擴大培養(yǎng)液，按液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基重2.5-3.5%的接種量，接種到冷卻至39-41°C (優(yōu)選40°C ) V的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，360C ± 1°C恒溫培養(yǎng)60-70小時，恒溫培養(yǎng)時，不斷攪拌通風(fēng)，攪拌速度為300-350轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量為1.3-1.5立方氣體/升培養(yǎng)基/分鐘，制成液態(tài)發(fā)酵液；步聚4，粗濾:往步聚3制成的液態(tài)發(fā)酵液中添加相當(dāng)于液態(tài)發(fā)酵液重4-6%的硅藻土，混合均勻，板框壓濾，得粗濾液；
步聚5，膜濃縮:以微濾膜將步聚4所得粗濾液過濾濃縮至原粗濾液的1/4-1/5 (即IOOkg粗濾液，經(jīng)膜濃縮后，制得濃縮液25-20kg)，在5-25°C下保存即可。
[0008]所述地衣芽孢桿菌為公知常見微生物(參見《酶制劑工業(yè)》下冊，張樹政主編，科學(xué)出版社1998年第三次印刷，476頁)。
[0009]淀粉酶活力檢測方法采用BAU法(參見《酶制劑工業(yè)》下冊，張樹政主編，科學(xué)出版社1998年第三次印刷，485頁)。
[0010]按本發(fā)明方法生產(chǎn)的耐超高溫淀粉酶產(chǎn)品質(zhì)量符合QB/B23061997標(biāo)準。在不增加生產(chǎn)成本前提下，酶活力達22000-27000u/mL ;最高能耐受117°C高溫?！揪唧w實施方式】
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但這些實施例不應(yīng)理解為對本發(fā)明保護范圍的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，加入的各原料除特別說明外，均為市售產(chǎn)品。
[0011]步聚I，瓊脂培養(yǎng)基接種培養(yǎng):(I)瓊脂培養(yǎng)基準備，培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨1.2g，酵母膏0.6g，NaCl 1.(^，瓊脂2.(^，可溶性淀粉0.288，pH6.8，其余為水，合計總重100g ;將所述100g配料混勻后，分放于培養(yǎng)皿中，0.1MPa滅菌33min，冷卻至室溫，制成瓊脂復(fù)壯培養(yǎng)基，備用；(2)接種與培養(yǎng):將實驗室保存的地衣芽孢桿菌環(huán)移取I環(huán)放于每個培養(yǎng)皿的瓊脂培養(yǎng)基上，置于36°C ±1°C恒溫培養(yǎng)65h,取出保存,制成瓊脂培養(yǎng)基菌種；
步聚2，擴大培養(yǎng):(I)擴大培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨60g (1.2%)，酵母膏30g (0.6%),NaCl 50g (1.0%)，可溶性淀粉 14g (0.28%),水 4846g (96.92%)，合計總重 5000g (5kg)，pH6.8 ；0.1MPa滅菌33min，冷卻至40°C，制成擴大培養(yǎng)基，備用；(2)擴大培養(yǎng)方法:取步聚I制成的瓊脂培養(yǎng)基菌種，按擴大培養(yǎng)基重0.8%的接種量，接種到冷卻至40°C的擴大培養(yǎng)基，36°C ±1°C恒溫培養(yǎng)65小時，恒溫培養(yǎng)時，不斷攪拌通風(fēng)，攪拌速度為310轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量為1.位方氣體/升擴大培養(yǎng)基/分鐘，制成擴大培養(yǎng)液；
步聚3，液態(tài)發(fā)酵制備:(1)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方:(NH4) SO40.25 kg, KH2PO4 0.34kg，CaC120.018kg，可溶性淀粉0.28kg，胰蛋白胨0.40 kg,玉米粉3.20kg，水95.512kg,ρΗ6.8，合計總重100kg，0.1MPa滅菌33min，冷卻至40°C，制成液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，備用；(2)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng):取步聚2制成的擴大培養(yǎng)液，按相當(dāng)于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基重3.0%的接種量，接種到冷卻至40°C的所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，360C ± 1°C恒溫培養(yǎng)65小時，恒溫培養(yǎng)時，不斷攪拌通風(fēng)，攪拌速度為330轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量為1.位方氣體/升培養(yǎng)基/分鐘，制成液態(tài)發(fā)酵液；步聚4，粗濾:往步聚3制成的液態(tài)發(fā)酵液中添加相當(dāng)于液態(tài)發(fā)酵液重4-6%的硅藻土，混合均勻，板框壓濾， 得粗濾液；步聚5，膜濃縮:以微濾膜將步聚4所得粗濾液過濾濃縮至原粗濾液的1/5，經(jīng)膜濃縮后，將濃縮液以塑料桶裝，在室溫(5-25°C)溫度下保存即可。
[0012]制得的液化淀粉酶，按照BAU 法檢測，酶活力達到27000u/mL ;能耐受117°C高溫。
【權(quán)利要求】
1.一種耐超高溫的液化淀粉酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步聚1，瓊脂培養(yǎng)基接種培養(yǎng):(I)瓊脂培養(yǎng)基準備:培養(yǎng)基配方為，胰蛋白胨 1.0-1.5 %，酵母膏 0.5-0.7 %，NaCl 0.9-1.1 %，瓊脂 1.8-2.1 %，可溶性淀粉0.25-0.30%，pH6.5-7.0，其余為水；將所述配料混勻后，放于培養(yǎng)皿中，0.09-0.1lMPaMPa滅菌30-35min，冷卻到室溫，制成瓊脂復(fù)壯培養(yǎng)基，備用；(2)接種與培養(yǎng):將保存的地衣芽孢桿菌環(huán)移取1-2環(huán)放于每個培養(yǎng)皿的瓊脂培養(yǎng)基上，置于36°C 土TC恒溫培養(yǎng)60-70h，取出保存，制成瓊脂培養(yǎng)基菌種； 步聚2，擴大培養(yǎng):(I)擴大培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.7%,NaCl 0.9-1.1 %，可溶性淀粉 0.25-0.30 %，ρΗ6.5-7.0,其余為水；0.09-0.1lMPa,滅菌30-35min，冷卻至39-41°C，制成擴大培養(yǎng)基，備用；(2)擴大培養(yǎng)方法:取步聚I制成的瓊脂培養(yǎng)基菌種，按擴大培養(yǎng)基重0.8%的接種量，接種到冷卻至39-41°C的擴大培養(yǎng)基，36 0C 土 1°C恒溫培養(yǎng)60-70小時，恒溫培養(yǎng)時，不斷攪拌通風(fēng)，攪拌速度為300-320轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量為1.3-1.5立方氣體/升擴大培養(yǎng)基/分鐘，制成擴大培養(yǎng)液； 步聚3，液態(tài)發(fā)酵制備:(1)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方=(NH4)SO40.22-0.27 %, KH2PO40.30-0.37%,CaCl20.015-0.02%，可溶性淀粉 0.25-0.30%，胰蛋白胨 0.35-0.45%，玉米粉 2.9-3.5%, ρΗ6.5-7.0，其余為水；0.09-0.1lMPa MPa 滅菌 30_35min，冷卻至 39-41。。，制成液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，備用；(2)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng):取步聚2制成的擴大培養(yǎng)液，按液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基重2.5-3.5%的接 種量，接種到冷卻至39-41°C的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，36°C 土 1°C恒溫培養(yǎng)60-70小時，恒溫培養(yǎng)時， 不斷攪拌通風(fēng)，攪拌速度為300-350轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量為1.3-1.5立方氣體/升培養(yǎng)基/分鐘，制成液態(tài)發(fā)酵液； 步聚4，粗濾:往步聚3制成的液態(tài)發(fā)酵液中添加相當(dāng)于液態(tài)發(fā)酵液重4-6%的硅藻土，混合均勻，板框壓濾，得粗濾液； 步聚5，膜濃縮:以微濾膜將步聚4所得粗濾液過濾濃縮至原粗濾液的1/4-1/5，在5-25 °C下保存。
2.如權(quán)利要求1所述耐超高溫的液化淀粉酶的制備方法，其特征在于，步聚I中，瓊脂復(fù)壯培養(yǎng)基的滅菌壓力為0.1MPa0
3.如權(quán)利要求1或2所述耐超高溫的液化淀粉酶的制備方法，其特征在于，步聚2中，擴大培養(yǎng)基滅菌的壓力0.1MPa，冷卻至40°C。
4.如權(quán)利要求1或2所述耐超高溫的液化淀粉酶的制備方法，其特征在于，步聚3中，液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌壓力為0.1MPa MPa，冷卻至40°C。
【文檔編號】C12N9/28GK103614353SQ201310666013
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】林親錄, 袁四岳, 孫術(shù)國, 吳躍, 梁盈, 付湘晉, 肖華西 申請人:湖南湖湘生物科技有限公司