一種含綠色熒光蛋白報告基因的植物表達載體及其構(gòu)建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含有綠色熒光蛋白報告基因植物表達載體的構(gòu)建。該方法以pRI-AN-101載體為骨架載體，首先利用PCR技術從pCXGFP-P載體上擴增GFP基因全長序列，然后將GFP基因全長正向序列插入pRI-AN-101載體，得到重組載體pRI-AN-101-GFP。然后對GFP基因全長序列中的NdeⅠ識別位點進行定點突變，使得NdeⅠ在構(gòu)建植物表達載體時可用于雙酶切，最終獲得了含GFP基因的植物表達載體，命名為pRI101-GFP。該載體含有的綠色熒光蛋白報告基因可以快速方便的鑒定轉(zhuǎn)基因植株。
【專利說明】一種含綠色熒光蛋白報告基因的植物表達載體及其構(gòu)建方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術領域】，特別涉及一種適合雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的植物表達載體。
【背景技術】
[0002]植物表達載體是植物基因工程研究的重要組成部分。它是攜帶目的基因進入宿主細胞并進行擴增和表達的重要媒介。通過植物表達載體,外源目的基因可進入宿主細胞并高效表達，為闡明新基因的功能和利用基因資源改良植物性狀奠定了基礎。因此，獲得穩(wěn)定、高效的植物表達載體是進行遺傳轉(zhuǎn)化的重要前提。
[0003]將外源基因?qū)胫参矬w后，對轉(zhuǎn)基因植株的鑒定是關鍵的一步。常用的鑒定轉(zhuǎn)基因植株的方法是對轉(zhuǎn)基因材料進行PCR, PCR即聚合酶鏈式反應(polymer as chainReaction)，是在體外對特定的DNA順序進行擴增。將少量的擴增產(chǎn)物和分子標記(Markers)進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴酚藍染色，在紫外光下觀察，不同轉(zhuǎn)化受體是否出現(xiàn)目的基因片段。具有目的基因片段的植株為轉(zhuǎn)基因植株，未擴增出目的基因的為非轉(zhuǎn)基因植株。PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株的方法雖然簡單，但是這個過程耗時較長，且步驟繁瑣，可能會做很多無用功。因此，探索一種在遺傳轉(zhuǎn)化早期就可以鑒定出轉(zhuǎn)基因植株的方法顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是:構(gòu)建一種簡便快速鑒定轉(zhuǎn)基因植株的植物表達載體，解決轉(zhuǎn)基因植株鑒定困 難的問題。
[0005]本發(fā)明所提供的含綠色熒光蛋白報告基因的植物表達載體，是以pR1-AN-101載體為骨架載體，將GFP基因插入pR1-AN-101載體，得到重組載體pR1-AN-101-GFP，然后對GFP基因的Nde I識別位點進行定點突變，得到含GFP基因的植物表達載體，命名為pRI101-GFP。
[0006]本發(fā)明所提供的含綠色熒光蛋白報告基因的植物表達載體的構(gòu)建方法，包含以下步驟:
[0007]1.GFP基因的獲得:以pCXGFP-P載體質(zhì)粒為模板，以SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物進行PCR擴增，得到GFP基因全長序列；
[0008]2.將GFP基因插入質(zhì)粒pGM-T中，得重組質(zhì)粒pGM-GFP ；
[0009]3.用EcoR I和SacI分別對pGM_GFP和pR1-AN-101載體進行雙酶切，將二者連接，得到重組載體pR1-AN-101-GFP ；
[0010]4.以重組載體pR1-AN-101-GFP為模板，以SEQ ID NO:4所示的Nde I識別位定點突變第一條引物和SEQ ID NO:5所示的Nde I識別位定點突變第二條引物作為引物，進行PCR擴增，得到突變載體pRI 101-GFP。[0011 ] 綠色突光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)是一種可以發(fā)出綠色突光的物質(zhì)。GFP作為報告基因的優(yōu)點:熒光產(chǎn)生不需要添加任何底物或輔助因子；相對分子質(zhì)量小，對細胞無毒害；檢測方便，可直接用于活體檢測；無種屬特異性及細胞種類和位置的限制；靈敏度高，不受假陽性干擾；可制成永久標本。但GFP也有在酸性環(huán)境下容易發(fā)生熒光淬滅，光漂白以及GFP生色團的形成對溫度敏感等缺點。因為GFP基因自身含有Nde I酶切位點，故將GFP基因作為報告基因?qū)胫参锉磉_載體pR1-AN-101中后，用雙酶切法構(gòu)建植物表達載體時，Nde I酶切位點不能使用。然而Nde I酶切位點在多數(shù)植物表達載體中不存在，并且該酶常見，經(jīng)濟實惠，在植物表達載體pR1-AN-101中用該酶切位點可以保留AtADH5’UTR (如圖1所示)，對目的基因的表達有一定的好處。因此為了使用Nde I酶切位點，本發(fā)明對GFP基因自身的Nde I酶切位點進行了基因的定點突變。
[0012]本發(fā)明所構(gòu)建的植物表達載體pRI101-GFP具有下列優(yōu)點: [0013]1.能夠簡便快速的鑒定轉(zhuǎn)基因植株；
[0014]2.可以活體鑒定轉(zhuǎn)基因植株；
[0015]3.解決了 Nde I酶切位點在用雙酶切的方法構(gòu)建含綠色熒光蛋白基因植物表達載體時出現(xiàn)的問題，擴展了該植物表達載體的應用范圍。
[0016]4.本發(fā)明的植物表達載體可以應用于雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是植物表達載體pR1-AN-101的部分序列。
[0018]圖2是GFP基因的電泳圖。
[0019]圖3是pGM-GFP和pR1-AN-101載體雙酶切結(jié)果電泳圖。
[0020]圖4是pR1-AN-101-GFP重組載體的雙酶切驗證。
[0021]圖5是NdeI酶切位點定點突變引物設計。
[0022]圖6是大引物擴增結(jié)果。
[0023]圖7是突變質(zhì)粒質(zhì)粒電泳檢測結(jié)果。
[0024]圖8是pR1-AN-101-GFP載體的Nde I識別位點的定點突變。
[0025]圖9是山植NAC domain基因全長序列的犾得。
[0026]圖10是pGM-NAC domain和pRI101-GFP載體雙酶切結(jié)果電泳圖。
[0027]圖11是pRIl01-GFP-NAC domain重組載體的雙酶切驗證。
【具體實施方式】
[0028]實驗中所用的各種試劑主要是實驗室保存的和從商業(yè)渠道購買，載體pRNA1-BKIK pRI201-AN_GUS、pCXSN 和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105為本實驗室保存。大腸桿菌(Escherichia coli )感受態(tài)T0P10和DH5 a分別購自北京天根(TiANGEN)生物技術有限公司和大連寶生物工程有限公司。克隆載體pGM-T試劑盒購自北京天根生物技術有限公司。IOObp DNA Marker、質(zhì)粒小提中量試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒購自 AXYGEN 公司。dNTPs，ExTaq DNA 聚合酶、PrimcSTAR? GXL DNA Polymerase、Dpn 1、限制性內(nèi)切酶Kpn I ,Nde I ,EcoR I和Sac I購自大連寶生物工程有限公司。T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Xcm I購自NEB公司。核酸測序均由華大基因公司完成。所用的引物均由大連寶生物工程有限公司合成。實驗中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0029]實施例1 一種含綠色突光蛋白報告基因的植物表達載體的構(gòu)建
[0030]一、GFP基因全長序列的獲得
[0031]1.設計GFP基因全長序列擴增引物
[0032]在NCBI上獲取pCXGFP-P載體全長序列，根據(jù)pCXGFP-P載體序列設計擴增TA克隆位點的引物，5’端引入EcoR I酶切位點，3’端引入SacI酶切位點，預期的擴增片段長度約為700bp。經(jīng)設計，GFP基因序列全長擴增的上游引物如SEQ ID NOl所示，GFP基因序列全長擴增的下游引物如SEQ ID N02所示。
[0033]GFP 基因序列全長擴增的上游引物:5，-CGAATTCATGGGTAAAGGAGAAGAA-3，
[0034]GFP 基因序列全長擴增的下游引物:5’ -CGAGCTCTCATTTGTATAGTTCATC-3，
[0035]2.擴增GFP基因序列全長
[0036]用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2從pCXGFP-P質(zhì)粒載體中擴增出I條長度約為700bp的片段(擴增結(jié)果如圖2)。從凝膠中回收特異性條帶并與pGM-T載體重組，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞T0P10并進行藍白斑篩選。隨機挑取6個白色單菌落進行PCR鑒定，均擴增出約700bp的特異性譜帶。
[0037]3.驗證擴增GFP基因序列全長的正確性
[0038]3個單菌落的測序結(jié)果顯示擴增片段長度為702bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，與預期的完全一致。將插入了 GFP基因的重組質(zhì)粒命名為pGM-GFP。
[0039]二、構(gòu)建含GFP基因序列全長的重組載體pR1-AN-101-GFP
[0040]將pGM-GFP和pR1-AN-101載體分別用EcoR I和SacI進行雙酶切，凝膠電泳后分別回收pR1-AN-101的大片段(電泳結(jié)果如圖3，1，2，3泳道)和pGM-GFP的小片段(電泳結(jié)果如圖3，4，5，6泳道)。
[0041]用T4連接酶將pGM-GFP的小片段與pR1-AN-101的大片段相連，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 a。
[0042]利用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2對隨機挑取的4個單菌落進行PCR驗證，結(jié)果4個均擴增出約700bp的目的條帶。從這4個菌落中提取質(zhì)粒，用EcoR I和SacI對提取的質(zhì)粒進行雙酶切，結(jié)果4個菌落提取的質(zhì)粒均酶切出約700bp的片段(電泳結(jié)果如圖4)，初步判斷構(gòu)建載體成功。將提取的質(zhì)粒進行測序，結(jié)果顯示GFP基因全長序列已經(jīng)成功被插入到pR1-AN-101載體中，將重組后的植物表達載體命名為pR1-AN-101-GFP。
[0043]三、獲得突變載體pRI101-GFP
[0044]1.NdeI酶切位點定點突變引物的設計
[0045]根據(jù)GFP基因序列全長，找到NdeI酶切位點，設計一對突變引物，將NdeI酶識別位點突變掉，但是不改變其所翻譯的氨基酸序列，進而使該位點不能再被NdeI酶識別(如圖5所示)。
[0046]根據(jù)快速PCR定點突變引物的設計原則:正反向引物要在目標突變區(qū)域重合，正反向引物是完全反向互補的，且長度應在25bp到45bp之間，35bp最好,設計一對突變引物。Nde I識別位定點突變第一條引物的序列如SEQ ID N04所示，Nde I識別位定點突變第二條引物的序列如SEQ ID N05所示。
[0047]Nde I 識別位定點突變第一條弓丨物:5’ -CAAGATACCCAGATCACATGAAACGGCATGACT-3’Nde I 識別位定點突變第二條引物:5’ -AGTCATGCCGTTTCATGTGATCTGGGTATCTTG-3
[0048]2.突變質(zhì)粒的獲得
[0049]以第二)步驟中獲得的pR1-AN-101-GFP重組質(zhì)粒DNA為模板，在高保真酶Prime STAR? GXL DNA Polymerase 的作用下，用引物 SEQ ID NO:4 (Nde I 識別位定點突變第一條引物)和SEQ ID NO:5 (Nde I識別位定點突變第二條引物)進行擴增，得到大片段的單一 PCR產(chǎn)物(電泳如圖6，其中I泳道為負對照，2和3泳道為所得單一的PCR產(chǎn)物)。
[0050]突變PCR體系為:
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種含綠色熒光蛋白報告基因的植物表達載體，其特征在于:所述的植物表達載體是以PR1-AN-1Ol載體為骨架載體，將GFP基因插入pR1-AN-101載體，得到重組載體pR1-AN-101-GFP，然后對GFP基因的Nde I識別位點進行定點突變，得到含GFP基因的植物表達載體，命名為pRI 101-GFP。
2.—種權(quán)利要求1所述的含綠色熒光蛋白報告基因的植物表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟: (1)GFP基因的獲得； (2)將GFP基因插入質(zhì)粒pGM-T中，得重組質(zhì)粒pGM-GFP； (3)用EcoRI和SacI分別對pGM_GFP和pR1-AN-101載體進行雙酶切，將二者連接得到重組載體pR1-AN-101-GFP ； (4)以重組載體pR1-AN-101-GFP為模板，以SEQID NO:4所示的Nde I識別位定點突變第一條引物和SEQ ID NO:5所示的Nde I識別位定點突變第二條引物作為引物，進行PCR擴增，得到突變載體pRI 101-GFP。
3.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(1)GFP基因的獲得方法如下:以pCXGFP-P載體質(zhì)粒為模板，以SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物進行PCR擴增，得到GFP基因全長序列。
4.權(quán)利要求1所述的含綠色熒光蛋白報告基因的植物表達載體在雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應用。
5.含山楂NACdomain基 因的pRI101-GFP植物表達載體的構(gòu)建，其特征在于包括以下步驟: (1)山楂NACdomain基因的獲得； (2)將山楂NACdomain基因插入質(zhì)粒pGM_T中，得重組質(zhì)粒pGM-NAC domain ； (3 )用Nde I和Kpn I分別對重組質(zhì)粒pGM_NAC domain和權(quán)利要求1所述的pRIIOl-GFP載體進行雙酶切，將二者連接，得到含山楂NAC domain基因序列全長的植物表達載體 pRI 101-GFP-NAC domain。
【文檔編號】C12N15/65GK103627724SQ201310669160
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月7日
【發(fā)明者】張志宏, 韓國粉, 田義, 代紅艷, 馬躍, 從佩華, 李賀, 劉月學, 李曉明 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學