稻瘟病抗性基因Pi63的功能特異性分子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了稻瘟病抗性基因Pi63的2對(duì)功能性分子標(biāo)記YRT3和YRT4及其方法與應(yīng)用，通過(guò)比對(duì)和分析多個(gè)水稻品種中Pi63等位基因及其編碼區(qū)上游序列，得到有別于感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pi63功能特異性位點(diǎn)2處；通過(guò)設(shè)計(jì)引物，分別得到SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；利用該引物擴(kuò)增水稻總DNA，分別得到Pi63功能特異性分子標(biāo)記YRT3和YRT4。本發(fā)明可在大量的水稻種質(zhì)資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中的得到應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】稻瘟病抗性基因Pi63的功能特異性分子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及水稻稻瘟病抗性基因朽似(原編號(hào)Piym2)的2對(duì)功能性分子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用 。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米為主要糧食。稻瘟病是水稻最主要的病害之一，全球每年因稻瘟病造成的稻谷減產(chǎn)達(dá)10%~30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)30%~50%，甚至顆粒無(wú)收。在我國(guó)稻瘟病常年發(fā)生面積在380萬(wàn)畝左右，造成數(shù)億公斤的稻谷損失，直接威脅著國(guó)家的糧食安全。
[0003]培育和利用抗病品種一直被公認(rèn)為最經(jīng)濟(jì)有效和環(huán)境友好的稻瘟病防治措施。但是，由于稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，加之其致病性易于發(fā)生變異，一些潛在的或新產(chǎn)生的致病小種的迅速繁殖，一個(gè)抗病品種往往推廣3飛年就發(fā)生感病化。因此，培育持久、廣譜抗稻瘟病的新品種是水稻抗病育種研究的重要方向，而廣泛挖掘、鑒定新的稻瘟病抗性基因，開(kāi)展多基因聚合育種被認(rèn)為獲得持久、廣譜抗病品種的有效途徑。
[0004]傳統(tǒng)的水稻抗病育種依賴(lài)于抗性表型的鑒定，這不僅要求育種者具有豐富的經(jīng)驗(yàn)和敏銳的洞察力，而且鑒定結(jié)果極易受環(huán)境條件和人為因素的影響，從而降低了目標(biāo)基因的選擇效率。另外，由于受可鑒別不同基因的鑒別菌系的限制，單純地依賴(lài)表型鑒定很難實(shí)現(xiàn)多個(gè)抗性基因的聚合。隨著分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，其便捷、直接、不受環(huán)境影響的優(yōu)點(diǎn)使其應(yīng)用價(jià)值及前景越來(lái)越受到關(guān)注。開(kāi)發(fā)并應(yīng)用與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，特別是抗性基因本身序列分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，不僅可以大大提高抗源篩選、抗性基因鑒定及育種選擇效率，而且使得通過(guò)基因聚合手段培育持久、廣譜抗病良種成為可倉(cāng)泛。
[0005]迄今，國(guó)內(nèi)外利用分子標(biāo)記技術(shù)已鑒定和定位70多個(gè)水稻稻瘟病抗性基因，克隆了 Pia、Pib、Pi ta、Pil、Pi9、Pi2、Piz_t、Pi_d2、Pi_d3、Pi36、Pi37、Pik、Pik_m、Pik-p、Pi5、Pia、Pit、Pish、pi21、Pbl 和/--似等 21 今基通,共節(jié)U欽對(duì)Pita、Pib、Pik、Pikm、Pikp、/^7 Jii 和/--激等基因的功能特異性標(biāo)記(Lei et al.2013 ；Ma et al.2013;國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心:http://www.ricedata.cn/gene/)。這為通過(guò)分子育種手段快速、高效培育持久、廣譜抗稻瘟病品種奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0006]水稻稻瘟病抗性基因Pi63是本實(shí)驗(yàn)室最近從云南地方粳稻品種羊毛谷(YMG)中克隆的一個(gè)高抗葉瘟和穗頸瘟的基因(曾用名參見(jiàn)專(zhuān)利號(hào)ZL 201210073815.3，發(fā)明名稱(chēng):稻瘟病抗性基因及其應(yīng)用)。該基因位于水稻第I染色體長(zhǎng)臂的
基因簇，編碼一個(gè)典型的CC-NBS-LRR類(lèi)抗性蛋白。它在進(jìn)化上屬于一個(gè)相對(duì)古老的基因，尚未應(yīng)用于水稻育種實(shí)踐。為了加快基因在育種中的應(yīng)用進(jìn)程，降低育種成本，開(kāi)發(fā)出可以準(zhǔn)確有效的鑒定該基因的功能性分子標(biāo)記顯得尤為重要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的首要目的是提供鑒定稻瘟病抗性基因的功能特異性分子標(biāo)記YRT3或YRT4。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用所述稻瘟病抗性基因朽似的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因Ρ?63的水稻品種的方法。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供稻瘟病抗性基因似的功能性分子標(biāo)記YRT3和YRT4的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
功能性分子標(biāo)記YRT3是用引物對(duì)SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2從水稻基因組DNA中擴(kuò)增出來(lái)的核苷酸序列，經(jīng)特異限制性?xún)?nèi)切酶消化后電泳檢測(cè)，與從特定水稻品種中擴(kuò)增出來(lái)的稻瘟病抗性基因呈現(xiàn)一致的帶型；
功能性分子標(biāo)記YRT4是用引物對(duì)SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4直接從水稻基因組DNA中擴(kuò)增出核苷酸序列，經(jīng)電泳檢測(cè)，與從特定水稻品種擴(kuò)增出來(lái)的稻瘟病抗性基因Ρ?63呈現(xiàn)一致的帶型；
其中，所述的特定水稻為水稻品種為羊毛谷(YMG)。
[0011]所用引物對(duì)的核苷酸序列如下所示:
SEQ ID N0.1:CCTGCATGGTCTGGCAGAGTCA
SEQ ID N0.2:AGTGAAGTAAGCCCACCAAGGCAA
SEQ ID N0.3:CGCGTGCCCTGCAATACAAACG
SEQ ID N0.4:CTCCATGGTCCCAAGGGCGGTA ；
所述的特異限制性?xún)?nèi)切酶為Ase I。
[0012]所述的稻瘟病抗性基因的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4的篩選方法是:通過(guò)多個(gè)水稻稻瘟病抗性基因朽似的等位基因序列與SEQ ID N0.5序列做比對(duì)的方法，分析得到能區(qū)分其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pi63功能特異性位點(diǎn)(氨基酸位點(diǎn)N698 (SEQ ID N0.7)和轉(zhuǎn)座子插入序列SEQ ID N0.6)，在通過(guò)設(shè)計(jì)分別得到SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4引物，對(duì)水稻總DNA擴(kuò)增，分別得到Pi63的功能性分子標(biāo)記YRT3和YRT4。
[0013]所述的篩選方法包括以下具體步驟:
(1)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得多個(gè)水稻品種的A?似等位基因的編碼區(qū)DNA序列；
(2)利用多序列比對(duì)軟件工具，將步驟(1)所獲得的序列翻譯成蛋白序列后進(jìn)行比對(duì)，得到/--似型抗性基因所特異的2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，即氨基酸位點(diǎn)N698和如SEQ ID N0.6所示的編碼區(qū)上游轉(zhuǎn)座子插入序列；
(3)根據(jù)步驟(2)得到的2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)出引物對(duì)SEQID N0.1和SEQ IDN0.2及SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4 ;并用這2對(duì)引物分別對(duì)不同水稻品種的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物A和擴(kuò)增產(chǎn)物B ;然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物A進(jìn)行酶切、電泳，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物B進(jìn)行直接電泳，通過(guò)比較驗(yàn)證分別得到與稻瘟病抗性基因呈特異性帶型的核苷酸片段YRT3和YRT4 ； (4)對(duì)步驟(3)所獲得的分子標(biāo)記在不同水稻品種中進(jìn)行驗(yàn)證，確定的功能特異性分子標(biāo)記YRT3和YRT4。[0014]上述的篩選方法，步驟(1)中所述的水稻品種為羊毛谷(YMG)、齊頭白谷、93-11(揚(yáng)稻6號(hào))、黃皮糯、老造谷、細(xì)麻線、Fujisaka 5、Tsuyuake> K59、墨米、Nipponbare東農(nóng)363和麗江新團(tuán)黑谷(LTH)；
步驟(3)中所述的PCR擴(kuò)增，其中擴(kuò)增產(chǎn)物A的PCR反應(yīng)體系如下:2 X PCR Bufferfor KOD FX 10 μ I,dNTPs (2mM each) 4 μ?，引物(lOpmol, F+R) I μ I, KOD FX酶(IU/μ I, TOYOBO) 0.4 μ I, DNA 模板(IOOng/μ I) 2 μ?，加 ddH20 至 20 μ 1，擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 2 min ；98°C 10 s — 59°C 1.5 min — 68°C 5 min，35 個(gè)循環(huán)；68°C 5 min, 10°C保存；擴(kuò)增產(chǎn)物B的PCR反應(yīng)體系如下:2 X PCR Buffer for KOD FX 10 μ I, dNTPs (2mMeach) 4 μ?，引物(lOpmol, F+R) I μ I, KOD FX 酶(IU/μ 1，TOYOBO) 0.4 μ I, DNA 模板(100ng/yl)2 “1，加(1(1!120至20 μ 1，擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 2 min ；98°C 10 s — 59°C40s — 68°C 5 min，35 個(gè)循環(huán)；68°C 5 min，10°C保存；
步驟(3)中所述的擴(kuò)增產(chǎn)物A的大小為1449 bp (SEQ ID N0.5中第1554位至3002位核苷酸)，經(jīng)Ase I酶切后成為2個(gè)片段(大小為541 bp, SEQ ID N0.5中第1554位至2094位核苷酸和908 bp, SEQ ID N0.5中第2095位至3002位核苷酸)；擴(kuò)增產(chǎn)物B的大小為421 bp (SEQ ID N0.6中第215位至635位核苷酸)。本發(fā)明還提供利用所述的稻瘟病抗性基因/的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因朽似的水稻品種的方法: 以待測(cè)水稻植株或品種的總DNA為模板，采用如SEQ ID N0.1和2所示序列的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1449 bp,并經(jīng)特異性酶AseI酶切后成為2個(gè)片段，大小為908 bp和541bp，則待測(cè)水稻植株或品種含有稻瘟病抗性基因Ρ?63 ；
以待測(cè)水稻植株或品種的總DNA為模板，采用如SEQ ID N0.3和4所示序列的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為421 bp，則待測(cè)水稻植株或品種含有稻瘟病抗性基因A?似；
本發(fā)明還提供所述的稻瘟病抗性基因/的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4的應(yīng)用，包括利用YRT3或YRT4在大量的水稻種質(zhì)資源中篩選、鑒定該功能抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明具有如下明顯的有益效果:
Ρ?63來(lái)源于對(duì)稻瘟病菌表現(xiàn)廣譜抗性的云南地方水稻品種羊毛谷YMG，是我國(guó)自主克隆的一個(gè)同時(shí)抗葉瘟和穗頸瘟的新基因(專(zhuān)利號(hào)ZL 201210073815.3)。該基因?qū)儆谕耆剐曰?，具有廣譜高抗的優(yōu)點(diǎn)，而且屬于進(jìn)化上相對(duì)古老的基因，目前在栽培品種中尚未發(fā)現(xiàn)該基因。因此，基因在水稻育種中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0016]本發(fā)明通過(guò)比較不同水稻品種的A?似等位基因編碼區(qū)及其上游的轉(zhuǎn)座子序列，基于朽似基因特有的DNA和氨基酸序列位點(diǎn)開(kāi)發(fā)出兩套功能特異性分子標(biāo)記(YRT3和YRT4)。應(yīng)用這兩套分子標(biāo)記，以常規(guī)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)輔以限制性?xún)?nèi)切酶酶切，不僅能準(zhǔn)確區(qū)分不同水稻品種資源的朽似基因型，而且能快捷有效從育種群體中篩選到攜帶目標(biāo)基因的個(gè)體。對(duì)多個(gè)群體(如YMG/LTH的重組自交系、YMG/LTH的BC5F2、YMG/C039的F2群體)進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇的實(shí)踐證實(shí)這兩套分子標(biāo)記遺傳穩(wěn)定，不受環(huán)境因素的影響，可以百分之百地鑒定朽似基因。
[0017]應(yīng)用基因功能特異性分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行回交或者常規(guī)雜交轉(zhuǎn)育，以及與其他抗性基因聚合，其育種選擇目標(biāo)明確，可以大大節(jié)約時(shí)間和成本，提高抗稻瘟病育種效率。本發(fā)明的分子標(biāo)記由于源自基因內(nèi)部功能特異性位點(diǎn)之多態(tài)性，不存在不良性狀的遺傳累贅問(wèn)題。另外，本發(fā)明的標(biāo)記由于朽似基因尚未在栽培品種中被應(yīng)用，在栽培稻中具有廣泛的適用性。因此，本發(fā)明提供的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，對(duì)于加速水稻稻瘟病抗性基因Pi63在水稻育種中的應(yīng)用具有重要意義。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為朽似及其不同品種中等位基因部分氨基酸序列比對(duì)結(jié)果。
[0019]圖2為分子標(biāo)記YRT3和YRT4在不同水稻品種中的檢測(cè)結(jié)果。
[0020]其中，a為YRT3檢測(cè)結(jié)果；b為YRT4檢測(cè)結(jié)果；M.Maker; 1-17分別為YMG，LTH，93-11, Fujisaka 5, Tsuyuake, K59,齊頭白谷，墨米，Kinmaze, Aichi Asahi, C039,南京11，Nipponbare，黃皮糯，老造谷，細(xì)麻線和東農(nóng)363。
[0021]圖3為分子標(biāo)記YRT3和YRT4在重組自交系群體中的檢測(cè)結(jié)果。
[0022]其中，a為 YRT3 檢測(cè)結(jié)果；b 為 YRT4 檢測(cè)結(jié)果；M: Maker ; 1:YMG ;2:LTH ;3_5 和13-17:不含有/--似基因的家系；6-12:含A?似基因的家系；R:抗??；S:感病。
[0023]圖4為分子標(biāo)記YRT3和YRT4在YMG和LTH的BC5F2單株中的檢測(cè)結(jié)果。
[0024]其中，a為 YRT3 檢測(cè)結(jié)果；b 為 YRT4 檢測(cè)結(jié)果；M:Maker; 1:YMG ;2:LTH ;3_5:含/--似基因的純合單株；6-14:含A?似基因的雜合單株；15-17:不含A?似基因的單株；+:含/--似基因；-:不含/--似基因；R:抗??；S:感病。
[0025]圖5為分子標(biāo)記YRT3和YRT4在YMG和C039的F2單株中的檢測(cè)結(jié)果。
[0026]其中，a為 YRT3 檢測(cè)結(jié)果；b 為 YRT4 檢測(cè)結(jié)果；M:Maker ; 1:YMG ;2:C039 ;3_6:含/--似基因的純合單株；7-14:含A?似基因的雜合單株；15-17:不含A?似基因的單株；+:含/--似基因；-:不含/--似基因。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法(例如:山崎義人、高坂淖爾編著.稻瘟病與抗病育種(凌忠專(zhuān)、孫昌其譯).農(nóng)業(yè)出版社，1990 ;凌忠專(zhuān)著.稻瘟病研究論文集.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.2005;路鐵鋼等編著.分子遺傳學(xué).高等教育出版社，2008)。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028]實(shí)施例1 及其等位基因氨基酸序列比對(duì)及特異氨基酸位點(diǎn)的鑒定
通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序方法，從羊毛谷(YMG)、齊頭白谷、93-11 (揚(yáng)稻6號(hào))、黃皮糯、老造谷、細(xì)麻線、Fujisaka 5、Tsuyuake、K59、墨米、東農(nóng)363和麗江新團(tuán)黑谷(LTH)基因組DNA中獲得等位基因編碼區(qū)DNA序列，從水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得參考品種Nipponbare的3個(gè)基因0s01g57280、L0C_ 0s01g57310和Pish編碼區(qū)DNA序列。利用軟件工具Pr imerPremier 5將DNA序列翻譯成氨基酸序列，然后利用軟件工具將所獲得氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，鑒定到/--似基因所特有的4個(gè)氨基酸位點(diǎn)N698、Y1003、A1031和Vl 177(圖1)。
[0029]實(shí)施例2 'Pi63基因編碼區(qū)上游序列分析
利用常規(guī)PCR手段擴(kuò)增 A?似基因編碼區(qū)上游序列，經(jīng)測(cè)序得到1597bp序列。通過(guò)NCBI BLAST 比對(duì)(http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBI ast&PAGE_TYPE = BI astSearch&SHOW_DEFAULTS = on&LINK_L0C=blasthome),在編碼區(qū)上游發(fā)現(xiàn)一個(gè)715bp大小的TIR類(lèi)型的轉(zhuǎn)座子,但未發(fā)現(xiàn)在水稻中存在該轉(zhuǎn)座子的同源序列。
[0030] 實(shí)施例3 'Pi63基因特異性分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及檢測(cè)
利用存在于A?似基因的特異氨基酸位點(diǎn)N698 (Ρ?63蛋白中對(duì)應(yīng)的密碼子為AAT，其余品種為GAT)，根據(jù)CAPS標(biāo)記設(shè)計(jì)原理，利用在線軟件dCAPS Finder 2.0 (http://helix, wustl.edu/dcaps/dcaps.html)和 Primer-BLAST (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index, cgi? LINK_LOC=BlastHome)設(shè)計(jì)引物 YRT3,該引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。YRT3的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:2 X PCRBuffer for KOD FX 10 μ I, dNTPs (2mM each) 4 μ?，引物(lOpmol, F+R) I μ I, KODFX 酶(lU/μΙ, TOYOBO) 0.4 μ 1，DNA 模板(IOOng/μ I) 2 μ?，加 ddH20 至 20 μ I。擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 2 min ；98°C 10 s — 59°C 1.5 min — 68°C 5 min，35 個(gè)循環(huán)；68°C 5min，10°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制系性?xún)?nèi)切酶消化，反應(yīng)體系為:10 XFastDigest? green buffer 2 μ I,限制性?xún)?nèi)切酶AseI I “1,加(1(1!120至25 “1,于37。〇消化4小時(shí)。酶切消化產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，PCR擴(kuò)增得到的片段大小為1449 bp(SEQ ID N0.5中第1554位至3002位核苷酸)，經(jīng)限制酶消化后出現(xiàn)541 bp (SEQ ID N0.5中第1554位至2094位核苷酸)和908 bp (SEQ ID N0.5中第2095位至3002位核苷酸)的兩條帶，即為朽似基因的特異性分子標(biāo)記YRT3的檢測(cè)結(jié)果。
[0031]根據(jù)InDel/Insert設(shè)計(jì)原理，基于/--似基因編碼區(qū)上游存在的轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計(jì)特異性引物YRT4，該引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。SEQ IDN0.3序列位于轉(zhuǎn)座子內(nèi)，SEQ ID N0.4位于轉(zhuǎn)座子下游。YRT4的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:2 XPCR Buffer for KOD FX 10 μ I, dNTPs (2mM each) 4μ1，引物(lOpmol, F+R) I μ I, KODFX 酶(lU/μΙ, TOYOBO) 0.4 μ I, DNA 模板(IOOng/μ I) 2 μ 1，加 ddH20 至 20 μ I。擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 2 min ；98°C 10 s — 59°C 40s — 68°C 5min，35 個(gè)循環(huán)；68°C 5 min,10°C保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，PCR擴(kuò)增得到大小為421bp(SEQ IDN0.6中第215位至635位核苷酸)的片段，即為基因的特異性分子標(biāo)記YRT4的檢測(cè)結(jié)果。
[0032]實(shí)施例4 ,Pi63基因特異功能性分子標(biāo)記在不同水稻品種中的檢測(cè)
提取17個(gè)不同水稻品種的基因組DNA，以此為模板，利用實(shí)施例3中描述的PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件，分別利用功能性分子標(biāo)記YRT3和YRT4進(jìn)行擴(kuò)增，YRT3的擴(kuò)增產(chǎn)物需經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化。經(jīng)瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示只有的供體YMG中含有朽似基因，其他品種中不含有該基因。分子標(biāo)記YRT3和YRT4可以特異地鑒定/--似基因。
[0033]實(shí)施例5 ,Pi63基因在YMG/LTH的重組自交系群體(RILs)中的檢測(cè)
對(duì)來(lái)自于YMG ( ^ )和LTH (早)的267個(gè)RILs家系(F12代)進(jìn)行實(shí)施例3中描述的檢測(cè)過(guò)程。在所檢測(cè)267個(gè)家系中，利用標(biāo)記YRT3檢測(cè)出有127個(gè)家系出現(xiàn)YMG的帶型；利用標(biāo)記YRT4同樣檢測(cè)出有127個(gè)家系出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，與親本YMG的帶型一致。檢測(cè)結(jié)果符合孟德?tīng)栠z傳比1:1 (127:140)，部分檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。[0034]實(shí)施例6 ,Pi63基因在YMG/LTH的BC5F2群體中的檢測(cè)
對(duì)來(lái)自于YMG ( ^ )和LTH (早)的47個(gè)BC5F2單株進(jìn)行實(shí)施例3中描述的檢測(cè)過(guò)程。在所檢測(cè)的47個(gè)單株中，利用標(biāo)記YRT3檢測(cè)出/--似/朽似基因型單株12個(gè)，Ρ?63/Ρ?63雜和基因型單株25 Λ',Pi63/pi63基因型單株10個(gè)；利用標(biāo)記YRT4檢測(cè)出含有/--似基因的單株25個(gè)。兩對(duì)分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果完全一致，且檢測(cè)結(jié)果符合孟德?tīng)栠z傳比1:2:1(12: 25:10)，部分檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。
[0035]實(shí)施例7 -.Ρ?63基因在YMG/C039的F2群體中的檢測(cè) 對(duì)來(lái)自于YMG ( ^ )和C039 (早)的87個(gè)F2單株進(jìn)行實(shí)施例3中描述的檢測(cè)過(guò)程。在所檢測(cè)的87個(gè)單株中，利用標(biāo)記YRT3檢測(cè)出基因型單株22個(gè)，Ρ?63/Ρ?63雜和基因型單株52 Λ',Pi63/pi63基因型單株13個(gè)；利用標(biāo)記YRT4檢測(cè)出含有/--似基因的單株74個(gè)。兩對(duì)分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果完全對(duì)應(yīng)，且檢測(cè)結(jié)果符合孟德?tīng)栠z傳比1:2:1(22:52:13)，部分檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。
[0036]實(shí)施例8:YMG/LTH的RILs和BC5F2群體的稻瘟病抗性鑒定
待水稻長(zhǎng)至3葉一心期時(shí)，利用稻瘟病鑒別菌株CH43對(duì)YMG/LTH的267個(gè)RILs家系和47個(gè)BC5F2單株進(jìn)行稻瘟病噴霧接種鑒定，以抗病親本YMG和感病親本LTH作對(duì)照。水稻稻瘟病抗性測(cè)定按0-5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0-3級(jí)為抗病R，4-5為感病S。結(jié)果發(fā)現(xiàn)267個(gè)RILs家系中，127個(gè)含有朽似基因的家系都表現(xiàn)為抗病反應(yīng)，其余140個(gè)不含有朽似基因的家系均表現(xiàn)感病，這與實(shí)施例5中分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果一致。47個(gè)BC5F2單株中，37個(gè)表現(xiàn)抗病，10個(gè)表現(xiàn)為感病，與實(shí)施例6中分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果完全對(duì)應(yīng)，即含有/^63基因的單株表現(xiàn)為抗病反應(yīng)，不含有/基因的單株表現(xiàn)感病，部分抗性表型結(jié)果如圖3和圖4所示。經(jīng)稻瘟病菌的抗性鑒定，分子標(biāo)記結(jié)果與抗性結(jié)果完全吻合，說(shuō)明本發(fā)明所提供的特異鑒定Ρ?63基因的功能性分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確鑒定Pi63基因。
[0037]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例中品種和群體的限制，其他的任何未違背本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)及原理下所做的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本和發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.稻瘟病抗性基因Pi63的功能特異性分子標(biāo)記YRT3或YRT4，其特征在于:分子標(biāo)記YRT3是通過(guò)正向引物如SEQ ID N0.1所示序列和反向引物如SEQ ID N0.2所示序列從水稻總DNA中擴(kuò)增出來(lái)的核苷酸序列，并經(jīng)特異性酶切后再電泳檢測(cè)到的與稻瘟病抗性基因Ρ?63呈特異性帶型的分子標(biāo)記；分子標(biāo)記YRT4是通過(guò)正向引物如SEQ ID N0.3所示序列和反向引物如SEQ ID N0.4所示序列從水稻總DNA中擴(kuò)增出來(lái)的核苷酸序列，經(jīng)直接電泳檢測(cè)到的與稻瘟病抗性基因呈特異性帶型的分子標(biāo)記； 其中，所述的水稻為水稻品種為羊毛谷(YMG)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟病抗性基因似的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4，其特征在于:所述的稻瘟病抗性基因A?似的DNA序列如SEQ ID N0.5所示，所述的稻瘟病抗性基因/--似的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟病抗性基因似的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4，其特征在于:通過(guò)引物對(duì)SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2從水稻總DNA中擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物大小為1449 bp，并經(jīng)特異性酶AseI酶切后成為2個(gè)片段，大小為908 bp和541bp ;通過(guò)引物對(duì)SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4從水稻總DNA中擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物大小為421 bp。
4.一種利用權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的稻瘟病抗性基因朽似的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因似的水稻品種的方法，其特征在于: 以待測(cè)水稻植株或品種的總DNA為模板，采用如SEQ ID N0.1和2所示序列的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1449 bp,并經(jīng)特異性酶AseI酶切后成為2個(gè)片段，大小為908 bp和541bp，則待測(cè)水稻植株或品種含有稻瘟病抗性基因Ρ?63 ;或 以待測(cè)水稻植株或品種的總DNA為模板，采用如SEQ ID N0.3和4所示序列的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為421 bp，則待測(cè)水稻植株或品種含有稻瘟病抗性基因/--似。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:采用如SEQID N0.1和2所示序列的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的PCR擴(kuò)增，其中擴(kuò)增產(chǎn)物A的PCR反應(yīng)體系如下:2X PCR Bufferfor KOD FX 10 μ I, dNTPs (2 mM each) 4 μ?，引物(I Opmol, F+R) I μ I, KOD FX酶(I U/μ I, TOYOBO) 0.4 μ?，DNA 模板(100 ng/μ I) 2 μ?，加 ddH20 至 20 μ?，擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 2 min ；98°C 10 s — 59°C 1.5 min — 68°C 5 min，35個(gè)循環(huán)；68°C 5 min,10°C保存；采用如SEQ ID N0.3和4所示序列的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下:2X PCR Buffer for KOD FX 10 μ l,2mM dNTPs 4 μ 1，IOpmol 引物 I μ I, IU/μ I KODFX 酶 0.4 μ l，100ng/y I DNA 模板 2 μ?，加 ddH20 至 20 μ 1，擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 2 min ；98°C 10 s — 59°C 40 s — 68°C 5 min，35 個(gè)循環(huán)；68°C 5 min，l(TC保存。
6.權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的稻瘟病抗性基因似的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4的應(yīng)用，其特征在于:利用所述的稻瘟病抗性基因的功能性分子標(biāo)記YRT3或YRT4在分子標(biāo)記輔助育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103642803SQ201310669214
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】萬(wàn)建民, 雷財(cái)林, 馬建, 馬小定, 程治軍, 王久林, 張欣, 郭秀平, 王潔, 趙志超, 吳赴清, 林啟冰 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所