一種用離子液體和修飾劑處理后的秸稈制備纖維素酶固定化載體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用離子液體和修飾劑處理后的秸稈制備纖維素酶固定化載體的方法，包括如下步驟：秸稈的預(yù)處理、秸稈的修飾以及載體干燥成型。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為：1、采用離子液體和修飾劑修飾秸稈得到的纖維素材料來(lái)制備酶固定化載體，處理過(guò)程綠色環(huán)保、無(wú)污染、操作條件溫和、處理工藝簡(jiǎn)易可行，且處理后的離子液體和修飾劑可以完全回收，可大大降低載體的生產(chǎn)成本。2、通過(guò)本發(fā)明方法制備得到的固定化酶載體上的酶吸附率高、穩(wěn)定性高，提高了酶的催化活性。3、本發(fā)明方法制備的酶固定化載體可以重復(fù)使用多次，仍能保持較高的酶活性。
【專利說(shuō)明】一種用離子液體和修飾劑處理后的秸稈制備纖維素酶固定化載體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用離子液體和修飾劑處理后的秸桿制備纖維素酶固定化載體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酶是一種由氨基酸組成的具有特殊生物活性的物質(zhì)，它存在于所有活的動(dòng)植物體內(nèi)，是維持機(jī)體正常功能，消化食物，修復(fù)組織等生命活動(dòng)的一種必需物質(zhì)。酶是具有生物催化功能的生物大分子，即生物催化劑，它能夠加快生化反應(yīng)的速度，但是不改變反應(yīng)的方向和產(chǎn)物。酶只能用于加速各類生化反應(yīng)的速度，但并不是生化反應(yīng)本身。酶的固定化就是通過(guò)某些方法將酶與載體相結(jié)合后成為不溶于含有底物的相中，從而使酶被集中或限制在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行酶解反應(yīng)，因此稱之為固定化酶。固定化酶與游離酶相比，具有下列優(yōu)點(diǎn):①極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)；②可以再較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)；③在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性酶反應(yīng)過(guò)程能夠加以嚴(yán)格控制⑤產(chǎn)物溶液中沒(méi)有酶的殘留，簡(jiǎn)化了提純工藝；⑥較游離酶更適合于多酶反應(yīng)；⑦可以增加產(chǎn)物的收率；⑧酶的使用效率提高，成本降低。酶的固定化方法可大致分為兩大類:包埋法和連接法。包埋法可再分為兩個(gè)小類:凝膠包埋法和微囊包埋法。連接法又可分為:吸附法和共價(jià)連接法。纖維素是棉花、木材、亞麻、草類等高等植物細(xì)胞壁的主要成分，每年由光合作用可產(chǎn)生幾百億噸，是自然界取之不盡、用之不竭的可再生資源。
[0003]離子液體是指全部由陰陽(yáng)離子組成的鹽。由于離子液體具有非揮發(fā)性、良好的離子導(dǎo)電性與導(dǎo)熱性、高熱容及高熱穩(wěn)定性，選擇性溶解力等特點(diǎn)，使得離子液體成為目前化學(xué)化工領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。
[0004]現(xiàn)有載體上吸附的酶容易脫落，由此導(dǎo)致固定化酶穩(wěn)定性和活性不高，同時(shí)酶固定化載體很少能夠重復(fù)利用，因此存在載體材料的后處理及廢載體的閑置問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供一種用離子液體和修飾劑處理后的秸桿制備高酶負(fù)載量、高酶活性、可重復(fù)利用且廉價(jià)環(huán)保的纖維素酶固定化載體的制備方法。
[0006]技術(shù)方案:本發(fā)明所述用離子液體和修飾劑處理后的秸桿制備纖維素酶固定化載體的方法，包括如下步驟:
[0007](I)秸桿的預(yù)處理:除去秸桿上的雜質(zhì)、干燥并剪切成段；
[0008](2)秸桿的修飾:先用離子液體溶解秸桿，再加入修飾劑攪拌均勻，得到纖維素載體溶液，該修飾過(guò)程使用超聲波，使秸桿的表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；
[0009](3)載體干燥成型:向上述纖維素載體溶液中加入溶劑，攪拌均勻，洗滌除去雜質(zhì)，然后干燥、真空脫氣制成纖維素酶固定化載體。
[0010]步驟(1)中，秸桿選取莖節(jié)部位，并將秸桿莖節(jié)剪切成0.4-0.6cm的小段。[0011]步驟(2)中，所述秸桿與離子液體的重量比為1:1-5 ;所述修飾劑的終濃度為
0.1-0.2M。所述離子液體為具有纖維素溶解功能的離子液體，且大多數(shù)為酸性離子液體。所述的修飾劑為聚乙二醇或者溴代丁乙酰亞胺。所述的超聲波處理的功率為30-60?，處理時(shí)間為 5-10min。
[0012]步驟(3)中所述的溶劑為水或短鏈醇，且加入的溶劑為纖維素載體溶液體積的1-5 倍。
[0013]發(fā)明原理:秸桿中含有大量的纖維素，加入的離子液體可以溶解、破壞秸桿中結(jié)晶度低的纖維素，剩下的都是結(jié)晶度高、強(qiáng)度大的類似納米纖維素的剛性纖維載體，而且剩余纖維素載體的表面和內(nèi)部形成多孔的結(jié)構(gòu)，為酶的固定化提供很多的位點(diǎn)，為后續(xù)反應(yīng)提供條件；加入的修飾劑與纖維載體結(jié)合，并連接在纖維載體的表面和內(nèi)部，可以與酶分子上氨基等基團(tuán)結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)酶的固定化。
[0014]有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比:其顯著優(yōu)點(diǎn)為:1、采用具有非揮發(fā)性、良好的離子導(dǎo)電性與導(dǎo)熱性、高熱容及高熱穩(wěn)定性，選擇性溶解力等優(yōu)點(diǎn)的離子液體等處理劑修飾秸桿得到的纖維素材料來(lái)制備酶固定化載體，處理過(guò)程綠色環(huán)保、無(wú)污染、操作條件溫和、處理工藝簡(jiǎn)易可行，且處理后的離子液體和修飾劑可以完全回收，可大大降低載體的生產(chǎn)成本。2、通過(guò)本發(fā)明方法制備得到的固定化酶載體上的酶吸附率高、穩(wěn)定性高，提高了酶的催化活性。3、本發(fā)明方法制備的酶固定化載體可以重復(fù)使用多次，仍能保持較高的酶活性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為用本發(fā)明方法制備的載體的掃描電鏡圖(放大1000倍)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳`細(xì)說(shuō)明。
[0017]實(shí)施例1:按如下步驟進(jìn)行:
[0018](I)取玉米秸桿的莖節(jié)，洗去秸桿上的污泥塵土等雜質(zhì)，干燥后剪切成0.5cm左右(0.4-0.6cm)的小段。
[0019](2)取Ig秸桿加入250ml的三口燒瓶中，在溫度25°C (室溫)時(shí)先加入5g離子液體[DMM] [DMP]，用超聲波清洗儀(設(shè)定功率60w)處理5min，再加入終濃度為0.2M的聚乙二醇400060ml，攪拌均勻，超聲波清洗儀(設(shè)定功率60w)處理lOmin，對(duì)秸桿的表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，使秸桿內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表面積增大，酶的吸附位點(diǎn)增加，得到纖維素載體溶液。
[0020](3)向上述纖維素載體溶液中加入3倍體積的水，均勻攪拌lOmin，將載體加入用去離子水中，并且施以劇烈的攪拌，洗滌3-5次除去雜質(zhì)，載體60°C干燥，真空脫氣制備成載體。
[0021]該載體的掃描電鏡圖如圖1所示，竹片中結(jié)晶度低的纖維(NMMO處理容易脫落和溶出)經(jīng)過(guò)處理除去，通過(guò)上述處理方法得到的載體為多孔結(jié)構(gòu)，為酶提供較多的吸附位點(diǎn)。
[0022]實(shí)施例2:制備步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處為:1、加入Ig離子液體[EMM]Cl處理秸桿；2、加入70ml終濃度為0.1M的聚乙二醇1000 ;3、兩次使用超聲波清洗儀(設(shè)定功率30w)，處理時(shí)間均為IOmin ;4、步驟(2)處理秸桿的整個(gè)過(guò)程保溫，溫度為90°C ;5、加入與纖維素載體溶液等體積的乙醇洗滌除去雜質(zhì)。
[0023]實(shí)施例3:制備步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處為:1、加入3g離子液體[EMM][oAc]處理秸桿；2、加入100ml終濃度為0.15M的溴代丁乙酰亞胺；3、兩次使用超聲波清洗儀(設(shè)定功率50w)，處理時(shí)間均為Smin ;4、步驟(2)處理秸桿的整個(gè)過(guò)程保溫，溫度為50°C;
5、加入的水為纖維素載體溶液體積的5倍。
[0024]實(shí)施例4:
[0025]取20ml的50mM pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，加入0.2mg纖維素酶，加入Ig實(shí)施例I制備的載體，在30°C水浴搖床中反應(yīng)24h。過(guò)濾獲得固定化酶，用醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌直至檢測(cè)不到蛋白為止。采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)纖維素酶的吸附率，測(cè)得其吸附率1500mg/g (是原吸附率的96%);同時(shí)采用DNS法、以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)纖維素酶的活性，測(cè)得該固定化酶的表觀活性為40IU，催化降解纖維二糖底物(0.5mg/ml)，每次催化時(shí)間2min，重復(fù)使用15次后,載體固定化酶活性達(dá)到90%左右。
[0026]實(shí)施例5:用實(shí)施例2制備的載體重復(fù)實(shí)施例4，測(cè)得纖維素酶的吸附率為1600mg/g (是原吸附率的98%);該固定化酶的表觀活性為43IU，催化降解纖維二糖底物(lmg/ml),每次催化時(shí)間5min,重復(fù)使用15次后,該載體固定化酶活性殘余85%左右。
[0027]實(shí)施例6:用實(shí)施例3制備的載體重復(fù)實(shí)施例4，測(cè)得纖維素酶的吸附率為1800mg/g (是原吸附率的99%);該固定化酶的表觀活性為45IU，催化降解纖維素底物(0.5mg/ml)，每次催化時(shí)間5·h，重復(fù)使用5次后，該載體固定化酶活性達(dá)到40%左右。
【權(quán)利要求】
1.一種用離子液體和修飾劑處理后的秸桿制備纖維素酶固定化載體的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)秸桿的預(yù)處理:除去秸桿上的雜質(zhì)、干燥并剪切成段； (2)秸桿的修飾:先用離子液體溶解秸桿，再加入修飾劑攪拌均勻得到纖維素載體溶液，該修飾過(guò)程使用超聲波，使秸桿的表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化； (3)載體干燥成型:向上述纖維素載體溶液中加入溶劑，攪拌均勻，再用去離子水洗滌除去雜質(zhì)，然 后干燥、真空脫氣制成纖維素酶固定化載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用離子液體和修飾劑處理后的秸桿制備纖維素酶固定化載體的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述秸桿與離子液體的重量比為1:1-5 ;所述修飾劑的終濃度為0.1-0.2M。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述用離子液體和修飾劑處理后的秸桿制備纖維素酶固定化載體的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述離子液體為具有纖維素溶解功能的離子液體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述用離子液體和修飾劑處理后的秸桿制備纖維素酶固定化載體的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述的修飾劑為聚乙二醇或者溴代丁乙酰亞胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述用離子液體和修飾劑處理后的秸桿制備纖維素酶固定化載體的方法，其特征在于:步驟(1)中，秸桿選取莖節(jié)部位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述用離子液體和修飾劑處理后的秸桿制備纖維素酶固定化載體的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述的超聲波處理的功率為30-60?，處理時(shí)間為5_10mino
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述用離子液體和修飾劑處理后的秸桿制備纖維素酶固定化載體的方法，其特征在于:步驟(1)中，將秸桿莖節(jié)剪切成0.4-0.6cm的小段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述用離子液體和修飾劑處理后的秸桿制備纖維素酶固定化載體的方法，其特征在于:步驟(3)中所述的溶劑為水或短鏈醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述用離子液體和修飾劑處理后的秸桿制備纖維素酶固定化載體的方法，其特征在于:加入的溶劑為纖維素載體溶液體積的1-5倍。
【文檔編號(hào)】C12N11/12GK103667243SQ201310674394
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】李強(qiáng), 季更生, 李斌, 屠潔, 孟春鳳 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)