導(dǎo)入特異shRNA得到的CypA基因被沉默的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種導(dǎo)入特異shRNA得到的CypA基因被沉默的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明提供了一種重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，是將特異shRNA導(dǎo)入離體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞得到的重組細(xì)胞；所述特異shRNA如序列表的序列2所示。所述特異shRNA具體可以以表達(dá)所述特異shRNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的形式導(dǎo)入所述離體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞、MDCK細(xì)胞或293T細(xì)胞。本發(fā)明提供了shRNA可以特異性抑制CypA蛋白的編碼基因的表達(dá)。本發(fā)明提供的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以作為WSN毒株的生物反應(yīng)器，大量制備WSN毒株。
【專利說(shuō)明】導(dǎo)入特異shRNA得到的CypA基因被沉默的重組晡乳動(dòng)物細(xì)

胞【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種導(dǎo)入特異shRNA得到的CypA基因被沉默的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]CypA是一種高度保守,廣泛存在的蛋白，屬于Cyclophilin家族(Cyp家族)。Cyp家族的蛋白都具有順?lè)串悩?gòu)酶活性，能夠幫助蛋白的折疊和聚集，參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)。在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10余種Cyp家族成員，包括CypA、CypB> CypC、CypD> CypE> Cyp40、RanBP2等。CypA是一種分布最廣泛的蛋白，參與細(xì)胞運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)控等。
[0003]慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細(xì)胞中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種導(dǎo)入特異shRNA得到的CypA基因被沉默的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0005]本發(fā)明提供了一種重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，是將特異shRNA導(dǎo)入離體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞得到的重組細(xì)胞；所述特異shRNA如序列表的序列2所示。
[0006]所述特異shRNA具體可以以表達(dá)所述特異shRNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的形式導(dǎo)入所述離體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0007]所述“表達(dá)所述特異shRNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒”的制備方法具體如下:將重組質(zhì)粒、質(zhì)粒pCL-Eco和質(zhì)粒pCL-VSVG共同導(dǎo)入293T細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后得到細(xì)胞培養(yǎng)上清，其中含有所述“表達(dá)所述特異shRNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒”；所述重組質(zhì)粒為在載體pSUPER.neo+GFP的多克隆位點(diǎn)(如BglII和HindIII酶切位點(diǎn)之間)插入序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。
[0008]所述培養(yǎng)的條件為:37°C培養(yǎng)24-48小時(shí)(優(yōu)選為36小時(shí))。
[0009]所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞、MDCK細(xì)胞或293T細(xì)胞。
[0010]本發(fā)明還保護(hù)人胚腎細(xì)胞293T/CypA (_)。人胚腎細(xì)胞293T/CypA (-)已于2013年10月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC N0.8306。
[0011]本發(fā)明還保護(hù)一種重組質(zhì)粒，為在載體pSUPER.neo+GFP的多克隆位點(diǎn)(如BglII和HindIII酶切位點(diǎn)之間)插入序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。
[0012]本發(fā)明還保護(hù)一個(gè)質(zhì)粒組，由所述重組質(zhì)粒、質(zhì)粒pCL-Eco和質(zhì)粒pCL-VSVG組成。
[0013]本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列2所示的shRNA。
[0014]本發(fā)明還保護(hù)編碼所述shRNA的DNA分子，具體可如序列表的序列I所示。[0015]本發(fā)明提供了 shRNA可以特異性抑制CypA蛋白的編碼基因的表達(dá)。本發(fā)明提供的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以作為WSN毒株的生物反應(yīng)器，大量制備WSN毒株。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為實(shí)施例2的步驟一的western blot結(jié)果。
[0017]圖2為實(shí)施例2的步驟二的western blot結(jié)果。
[0018]圖3為實(shí)施例2的步驟三的western blot結(jié)果。
[0019]圖4為實(shí)施例3的步驟一的4的結(jié)果。
[0020]圖5為實(shí)施例3的步驟一的5的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0022]載體pSUPER.neo+GFP (別名:pSuper.gfp/neo):貨號(hào)為 VEC-PBS-OOO6。質(zhì)粒pCL-Eco:購(gòu)自丁香通質(zhì)粒庫(kù)，作用為“構(gòu)成核心蛋白骨架”。質(zhì)粒pCL-VSVG:購(gòu)自丁香通質(zhì)粒庫(kù)，作用為“皰疹性口炎 病毒中G蛋白能夠識(shí)別外層細(xì)胞受體”。
[0023]BHK-21細(xì)胞(乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞):中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。MDCK細(xì)胞(犬腎細(xì)胞):中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。293T細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞):武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)為CX0008。lysis buffer:北京普利智誠(chéng)生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)為Cell Lysis Bu ffer (10X)9803S。Ant1-CypA:上海武昊經(jīng)貿(mào)有限公司，貨號(hào)為A90979Hu71。Ant1-^-actin:艾美捷科技有限公司，貨號(hào)為A01010。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗:上海中科英沐生物科技有限公司，貨號(hào)為 PB001。Ant1-CypE:Santa Cruz Biotechno logy 公司，Cyclophilin E 抗體(9E18)，貨號(hào) sc-100700。WSN 毒株:Sh Cao, X-L L iu, M-R Yu, J Li, X-J Jia, Y-H Bi, LSun, George F.Gao, ff-J Liu*.2012.A Nuclear Export Signal in the Matrix Protein ofInfluenza A Virus Is Requi red for the Efficient Virus Replication.Journal ofVirology, 86(9):4883-91。
[0024]實(shí)施例1、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備
[0025]一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0026]1、分別合成單鏈DNA分子甲和單鏈DNA分子乙。
[0027]單鏈DNA分子甲:
[0028]5， -GATCCCCGGGTTCCTGCTTTCACAGATTCAAGAGATCTGTGAAAGCAGGAACCCTTTTTGGAAA-3，。
[0029]單鏈DNA分子乙:
[0030]5， -AGCTTTTCCAAAAAGGGTTCCTGCTTTCACAGATCTCTTGAATCTGTGAAAGCAGGAACCCGG殳-3，。
[0031 ] 2、將單鏈DNA分子甲和單鏈DNA分子乙復(fù)性，得到DNA分子丙(單鏈DNA分子甲和單鏈DNA分子乙的下劃線標(biāo)注區(qū)形成雙鏈)。[0032]3、用限制性內(nèi)切酶BglII和HindIII雙酶切載體pSUPER.neo+GFP,回收約5429bp的載體骨架。
[0033]4、將雙鏈DNA分子丙與步驟3得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在載體pSUPER.neo+GFP的BglII和HindIII酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子。序列I中，自5’末端第4至23位核苷酸與第31-50位核苷酸反向互補(bǔ)。序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子編碼序列表的序列2所示的單鏈RNA分子卿目的shRNA)。
[0034]序列1、CCCGGGTTCCTGCTTTCACAGATTCAAGAGATCTGTGAAAGCAGGAACCCTTTTTGGAAA。
[0035]序列2、GGGUUCCUGCUUUCACAGAUUCAAGAGAUCUGUGAAAGCAGGAACCC。
[0036]二、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的獲得
[0037]借助Lipofectamine TM2000 (購(gòu)自 Invitrogen 公司，貨號(hào)為 11668-027)將步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒、質(zhì)粒pCL-Eco和質(zhì)粒pCL-VSVG共同導(dǎo)入293T細(xì)胞，37°C培養(yǎng)36小時(shí)(實(shí)際應(yīng)用中，24-48小時(shí)均可)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清(細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有表達(dá)目的shRNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，將其命名為shRNA病毒液)。
[0038]實(shí)施例2、重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞的獲得
[0039]一、BHK-21/ CypA (_)細(xì)胞的獲得
[0040]1、用DMEM培養(yǎng)基懸浮BHK-21細(xì)胞，得到IO5個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。
[0041]2、取12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入0.5ml步驟I得到的細(xì)胞懸液和0.5ml實(shí)施例1得到的shRNA病毒液，加入聚凝胺(加入聚凝胺的目的是增強(qiáng)轉(zhuǎn)染)并使其濃度為8μ g/ml，先32°C、2500rpm離心2小時(shí)，然后37°C培養(yǎng)36小時(shí)(實(shí)際應(yīng)用中，24-48小時(shí)均可)，收集細(xì)胞。
[0042]3、取步驟2得到的細(xì)胞,加入lysis buffer并4°C裂解30min,然后4°C、500g(實(shí)際應(yīng)用中400-500g均可)離心5min,收集上清液。
[0043]4、取BHK-21 細(xì)胞，加入 lysis buffer 并 4°C裂解30min,然后 4°C、500g離心 5min,
收集上清液。
[0044]5、分別將步驟3得到的上清液和步驟4得到的上清液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%分離膠/120V, 5%濃縮膠/80V)并進(jìn)行western blot。western blot采用的一抗為Ant1-CypA或Ant1-CypE,采用的二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗。
[0045]western blot的結(jié)果見(jiàn)圖1,泳道I為步驟4得到的上清液,泳道2為步驟3得到的上清液。步驟3得到的上清液中，檢測(cè)不到CypA蛋白，但可以檢測(cè)到CypE蛋白。步驟4得到的上清液中，可以檢測(cè)到CypA蛋白和CypE蛋白。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了 shRNA病毒液的BHK-21細(xì)胞中，CypA蛋白的編碼基因的表達(dá)被抑制，細(xì)胞中的其它基因(例如與CypA蛋白屬于同家族的CypE蛋白的編碼基因的表達(dá)未受影響)。
[0046]將轉(zhuǎn)染了 shRNA病毒的BHK-21細(xì)胞命名為BHK-21/CypA (-)細(xì)胞。
[0047]二、MDCK/CypA (_)細(xì)胞的獲得
[0048]1、用DMEM培養(yǎng)基懸浮MDCK細(xì)胞，得到IO5個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。
[0049]2、取12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入0.5ml步驟I得到的細(xì)胞懸液和0.5ml實(shí)施例1得到的shRNA病毒液，加入聚凝胺(加入聚凝胺的目的是增強(qiáng)轉(zhuǎn)染)并使其濃度為8μ g/ml，先32°C、2500rpm離心2小時(shí)，然后37°C培養(yǎng)36小時(shí)(實(shí)際應(yīng)用中，24-48小時(shí)均可)，收集細(xì)胞。
[0050]3、取步驟2得到的細(xì)胞，加入lysis buffer并4°C裂解30min，然后4°C、500g(實(shí)際應(yīng)用中400-500g均可)離心5min,收集上清液。
[0051]4、取 MDCK 細(xì)胞,加入 lysis buffer 并 4°C裂解 30min,然后 4°C、500g 離心 5min,
收集上清液。
[0052]5、分別將步驟3得到的上清液和步驟4得到的上清液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%分離膠/120V, 5%濃縮膠/80V)并進(jìn)行western blot。western blot采用的一抗為Ant1-CypA或Ant1-CypE,采用的二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗。
[0053]western blot的結(jié)果見(jiàn)圖2,泳道I為步驟4得到的上清液,泳道2為步驟3得到的上清液。步驟3得到的上清液中，檢測(cè)不到CypA蛋白，但可以檢測(cè)到CypE蛋白。步驟4得到的上清液中，可以檢測(cè)到CypA蛋白和CypE蛋白。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了 shRNA病毒液的MDCK細(xì)胞中，CypA蛋白的編碼基因的表達(dá)被抑制，細(xì)胞中的其它基因(例如與CypA蛋白屬于同家族的CypE蛋白的編碼基因的表達(dá)未受影響)。
[0054]將轉(zhuǎn)染了 shRNA病毒的MDCK細(xì)胞命名為MDCK/CypA (_)細(xì)胞。
[0055]三、293T/CypA(_)細(xì)胞的獲得
[0056]1、用DMEM培養(yǎng)基懸浮293T細(xì)胞，得到IO5個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。
[0057]2、取12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入0.5ml步驟I得到的細(xì)胞懸液和0.5ml實(shí)施例1得到的shRNA病毒液，加入聚凝胺(加入聚凝胺的目的是增強(qiáng)轉(zhuǎn)染)并使其濃度為8μ g/ml，先32°C、2500rpm離心2小時(shí)，·然后37°C培養(yǎng)36小時(shí)(實(shí)際應(yīng)用中，24-48小時(shí)均可)，收集細(xì)胞。
[0058]3、取步驟2得到的細(xì)胞,加入lysis buffer并4°C裂解30min,然后4°C、500g(實(shí)際應(yīng)用中400-500g均可)離心5min,收集上清液。
[0059]4、取 293T 細(xì)胞,加入 lysis buffer 并 4°C裂解 30min,然后 4°C、500g 離心 5min,
收集上清液。
[0060]5、分別將步驟3得到的上清液和步驟4得到的上清液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%分離膠/120V, 5%濃縮膠/80V)并進(jìn)行western blot。western blot采用的一抗為Ant1-CypA> Ant1-CypE或Ant1-β -actin,采用的二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗。
[0061]western blot的結(jié)果見(jiàn)圖3,泳道I為步驟4得到的上清液,泳道2為步驟3得到的上清液。步驟3得到的上清液中,檢測(cè)不到CypA蛋白，但可以檢測(cè)到CypE蛋白和β -actin蛋白。步驟4得到的上清液中,可以檢測(cè)到CypA蛋白、CypE蛋白和β-actin。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了 shRNA病毒液的293T細(xì)胞中，CypA蛋白的編碼基因的表達(dá)被抑制，細(xì)胞中的其它基因(例如與CypA蛋白屬于同家族的CypE蛋白的編碼基因的表達(dá)未受影響)。
[0062]將轉(zhuǎn)染了 shRNA病毒的293T細(xì)胞命名為293T/CypA (-)細(xì)胞，又稱人胚腎細(xì)胞293T/CypA (_)。人胚腎細(xì)胞293T/CypA (-)已于2013年10月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱06110:，地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC N0.8306。
[0063]實(shí)施例3、重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)流感病毒中的應(yīng)用
[0064]本實(shí)施例中的PBS緩沖液，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為pH7.2-7.4的PBS緩沖液(溶劑為水，每升含 NaC18g、KC10.2g、Na2HPO4.12H203.58g、KH2PO40.24g)。本實(shí)施例中用于培養(yǎng)各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基均為DMEM培養(yǎng)液。
[0065]一、293T/CypA (_)細(xì)胞在培養(yǎng)流感病毒中的應(yīng)用
[0066]將293T細(xì)胞和293T/CypA (-)細(xì)胞作為待測(cè)細(xì)胞分別進(jìn)行如下操作:
[0067]1、將待測(cè)細(xì)胞接種至24孔板，每孔IO5個(gè)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，吸棄上清，用PBS緩沖液洗滌3次。
[0068]2、完成步驟I后，加入病毒感染液(含有WSN病毒、0.5 μ g/ml TPCK-胰酶、1000萬(wàn)U青霉素和1000萬(wàn)U鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液；M0I=1)，37°C孵育I小時(shí)，吸棄上清，用PBS緩沖液洗滌3次。
[0069]3、完成步驟2后，37°C培養(yǎng)4小時(shí)。
[0070]4、完成步驟3后，取細(xì)胞，使用4%多聚甲醒固定，然后進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)(采用的一抗為抗NP蛋白的抗體，采用的二抗為FITC熒光標(biāo)簽標(biāo)記的羊抗兔的抗體，采用激光共聚焦突光顯微鏡觀察；一抗全稱為Ant1-1nfluenza A Virus Nucleoproteinantibody [AA5H], abeam公司，貨號(hào)ab20343 ;二抗購(gòu)自百匯中源(北京)生物科技有限公司，貨號(hào)為 10001002)。
[0071]染色后的NP蛋白為綠色。感染細(xì)胞比率=存在NP蛋白的細(xì)胞數(shù)量/用于觀察統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞總數(shù)量。用于觀察統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞總數(shù)量為300個(gè)以上。
[0072]結(jié)果見(jiàn)圖4。在293T/CypA(_)細(xì)胞中，WSN病毒的感染細(xì)胞比率為100%。在293T細(xì)胞中，WSN病毒的感染細(xì)胞比率僅為58.3%。結(jié)果表明，293T/CypA (_)細(xì)胞中，由于CypA蛋白的編碼基因的表達(dá)被抑制，流感病毒的復(fù)制能力大大增加了。
[0073]5、完成步驟2后，37°C培養(yǎng)，間隔時(shí)間收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，進(jìn)行病毒噬斑檢測(cè)。
[0074]病毒噬斑檢測(cè)的方法如下:(I)將MDCK細(xì)胞接種至12孔板，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞長(zhǎng)成單層，密度以鋪滿底部為宜，然后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次；(2)每孔加入10 μ I感染液(含0.5 μ g/ml TPCK-胰酶、1000萬(wàn)U青霉素和1000萬(wàn)U鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液)，然后每孔加入Iml所述細(xì)胞培養(yǎng)上清，37°C孵育I小時(shí)，吸棄上清，用PBS緩沖液洗滌3次；
(3)在水浴鍋中加熱融化3%低熔點(diǎn)瓊脂糖，然后自然冷卻至37°C，與37°C預(yù)熱的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)液(含4 μ g/ml TPCK-胰酶、1000萬(wàn)U青霉素和1000萬(wàn)U鏈霉素)等體積混合；
(4)完成步驟(2)后，每孔加入Iml步驟(3)得到的混合物，4°C放置10分鐘，然后于37°C、C02培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，3天(實(shí)際應(yīng)用中，2-4天均可)后，觀察噬斑情況，計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。
[0075]結(jié)果見(jiàn)圖5。對(duì)于293T/CypA (_)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從完成病毒轉(zhuǎn)染開(kāi)始計(jì)時(shí)培養(yǎng)6小時(shí)后得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清中即可能檢測(cè)到病毒粒子的存在。對(duì)于293T細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從完成病毒轉(zhuǎn)染開(kāi)始計(jì)時(shí)培養(yǎng)8小時(shí)后得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清才能檢測(cè)到病毒粒子。流感病毒在293T/CypA (-)細(xì)胞上的第一個(gè)生長(zhǎng)周期比其在293T細(xì)胞上快約2小時(shí)。
[0076]二、BHK-21/CypA (_)細(xì)胞在培養(yǎng)流感病毒中的應(yīng)用
[0077]用BHK-21 細(xì)胞代替 293T 細(xì)胞，用 BHK-21/CypA (-)細(xì)胞代替 293T/CypA (-)細(xì)胞，其它同步驟一。
[0078]在BHK-21/CypA (-)細(xì)胞中，WSN病毒的感染細(xì)胞比率為100%。在BHK-21細(xì)胞中，WSN病毒的感染細(xì)胞比率僅為83%。結(jié)果表明，BHK-21/CypA (-)細(xì)胞中，由于CypA蛋白的編碼基因的表達(dá)被抑制，流感病毒的復(fù)制能力大大增加了。[0079]對(duì)于BHK-21/CypA (-)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從完成病毒轉(zhuǎn)染開(kāi)始計(jì)時(shí)培養(yǎng)6小時(shí)后得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清中即可能檢測(cè)到病毒粒子的存在。對(duì)于BHK-21細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從完成病毒轉(zhuǎn)染開(kāi)始計(jì)時(shí)培養(yǎng)8小時(shí)后得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清才能檢測(cè)到病毒粒子。
[0080]三、MDCK/CypA (_)細(xì)胞在培養(yǎng)流感病毒中的應(yīng)用
[0081]用MDCK細(xì)胞代替293T細(xì)胞，用MDCK/CypA (_)細(xì)胞代替293T/CypA (-)細(xì)胞，其它同步驟一。
[0082]在MDCK/CypA (_)細(xì)胞中，WSN病毒的感染細(xì)胞比率為100%。在MDCK細(xì)胞中，WSN病毒的感染細(xì)胞比率僅為76%。結(jié)果表明，MDCK/CypA (_)細(xì)胞中，由于CypA蛋白的編碼基因的表達(dá)被抑制，流感病毒的復(fù)制能力大大增加了。
[0083]對(duì)于MDCK/CypA (-)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從完成病毒轉(zhuǎn)染開(kāi)始計(jì)時(shí)培養(yǎng)6小時(shí)后得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清中即可能檢測(cè)到病毒粒子的存在。對(duì)于MDCK細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從完成病毒轉(zhuǎn)染開(kāi)始計(jì)時(shí)培養(yǎng)8小時(shí)后得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清才能檢測(cè)到病毒粒子。
【權(quán)利要求】
1.一種重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，是將特異ShRNA導(dǎo)入離體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞得到的重組細(xì)胞；所述特異shRNA如序列表的序列2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于:所述特異shRNA以表達(dá)所述特異shRNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的形式導(dǎo)入所述離體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2所述的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于:所述“表達(dá)所述特異shRNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒”的制備方法如下:將重組質(zhì)粒、質(zhì)粒pCL-Eco和質(zhì)粒pCL-VSVG共同導(dǎo)入293T細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后得到細(xì)胞培養(yǎng)上清，其中含有所述“表達(dá)所述特異shRNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒”;所述重組質(zhì)粒為在載體pSUPER.neo+GFP的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求3所述的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于:所述培養(yǎng)的條件為:37°C培養(yǎng)24-48小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于:所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞、MDCK細(xì)胞或293T細(xì)胞。
6.人胚腎細(xì)胞293T/CypA(_)，它的保藏編號(hào)為CGMCC N0.8306。
7.—種重組質(zhì)粒，為在載體pSUPER.neo+GFP的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。
8.質(zhì)粒組，由權(quán)利要求7所述重組質(zhì)粒、質(zhì)粒pCL-Eco和質(zhì)粒pCL-VSVG組成。
9.序列表的序列2所不的shRNA。
10.編碼權(quán)利要求9所·述shRNA的DNA分子。
【文檔編號(hào)】C12N5/073GK103710309SQ201310674488
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】劉文軍, 李晶, 陳吉龍, 楊利敏, 趙振東 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所