一種電轉(zhuǎn)染裝置及使用該裝置的雞胚視頂蓋電轉(zhuǎn)染方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種電轉(zhuǎn)染裝置及使用該裝置的雞胚視頂蓋電轉(zhuǎn)染方法，該電轉(zhuǎn)染裝置包括用于與電源供應(yīng)器測(cè)試端連接的第一電極和第二電極，所述第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，所述針形電極呈弧形。本發(fā)明采用2個(gè)分別獨(dú)立的電極，放置位置和角度可以靈活調(diào)整；本發(fā)明的第二電極為針形電極，直徑較細(xì)，在放入雞胚視頂蓋底部時(shí)，不會(huì)對(duì)組織或卵黃膜造成損傷，避免由此引起的胚胎死亡，且能夠起到良好的導(dǎo)電作用，同時(shí)該針形電極呈弧形，弧形設(shè)計(jì)能夠在不損傷雞胚的情況下起到固定雞胚視頂蓋的作用。
【專利說(shuō)明】一種電轉(zhuǎn)染裝置及使用該裝置的雞胚視頂蓋電轉(zhuǎn)染方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種電轉(zhuǎn)染裝置，同時(shí)還涉及使用該電轉(zhuǎn)染裝置的雞胚視頂蓋電轉(zhuǎn)染方法。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)元的遷移對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的形成以及發(fā)揮正常功能起著重要的作用，許多疾病就與神經(jīng)元的遷移障礙有關(guān)。由于禽類視頂蓋的分層結(jié)構(gòu)比哺乳類動(dòng)物大腦皮質(zhì)層的結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，因此研究其細(xì)胞的遷移機(jī)制相對(duì)更為困難。目前，神經(jīng)元的遷移機(jī)制以及大腦皮層發(fā)生機(jī)制尚不明確，與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的分子功能以及信號(hào)調(diào)節(jié)通路還有待進(jìn)一步研究。
[0003]對(duì)神經(jīng)元遷移發(fā)生紊亂相關(guān)分子機(jī)制的研究，必須借助活體動(dòng)物模型，而神經(jīng)系統(tǒng)是形成較早的一個(gè)龐大系統(tǒng)，研究早期影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)分子需要在胚胎發(fā)育過(guò)程中進(jìn)行干預(yù)，由此進(jìn)一步分析其作用?；虼虬屑夹g(shù)是目前活體內(nèi)基因沉默和超表達(dá)成熟的技術(shù)，而在發(fā)育生物學(xué)研究領(lǐng)域廣泛使用的模式動(dòng)物雞胚中無(wú)法進(jìn)行基因打靶，近年來(lái)建立的活體電轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了雞胚發(fā)育過(guò)程基因的抑制表達(dá)和超表達(dá)。
[0004]從最早1998年Ochiai H等首次在雞胚中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成功的報(bào)道以來(lái)，建立在雞胚活體電轉(zhuǎn)模型上開(kāi)展了一系列研究。從目前研究進(jìn)展來(lái)看，實(shí)現(xiàn)早期脊髓內(nèi)轉(zhuǎn)染成功率和胚胎的成活都是比較高的，而且開(kāi)展的研究也是較多，是因?yàn)殡u胚脊髓中的轉(zhuǎn)染最佳時(shí)間在E2.5-E3，此時(shí)胚胎較小，采用開(kāi)窗培養(yǎng)的方法能夠方便的進(jìn)行轉(zhuǎn)染，由于脊髓轉(zhuǎn)染電極大多采用針狀電極，體積較小，只需要蛋殼側(cè)面打開(kāi)較小的窗口就可以進(jìn)行電擊。但是目前，針對(duì)雞胚神經(jīng)元遷移研究最佳部位視頂蓋的研究并不多，主要原因在于在胚胎發(fā)育6天(E6)以后，胚胎將會(huì)下沉到蛋清中，此時(shí)無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，從發(fā)育的時(shí)間上看最佳視頂蓋轉(zhuǎn)染的時(shí)間是在E5。但是由于在E5時(shí)胚胎較大，視頂蓋轉(zhuǎn)染無(wú)法采用針狀電極，多采用板狀電極，而板狀電極較大，蛋殼 開(kāi)窗由于窗口的限制，很難準(zhǔn)確放置，轉(zhuǎn)染成功率低，而且直接利用現(xiàn)有電極不能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)染到視頂蓋正確的部位。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種電轉(zhuǎn)染裝置。
[0006]本發(fā)明的目的還在于提供一種使用電轉(zhuǎn)染裝置的雞胚視頂蓋電轉(zhuǎn)染方法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種電轉(zhuǎn)染裝置，包括用于與電源供應(yīng)器測(cè)試端連接的第一電極和第二電極，所述第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，所述針形電極呈弧形。
[0008]該裝置還包括電源供應(yīng)器，所述電源供應(yīng)器的測(cè)試端經(jīng)兩個(gè)獨(dú)立的導(dǎo)線分別與第一電極和第二電極連接。
[0009]各導(dǎo)線與對(duì)應(yīng)電極的連接部位設(shè)有手柄。
[0010]所述的第一電極為橢圓形的板形結(jié)構(gòu)。
[0011]所述的第二電極由鉬金或黃金材料制成。[0012]所述第二電極截面為直徑0.3-0.5mm的圓形。
[0013]本發(fā)明采用2個(gè)分別獨(dú)立的電極，放置位置和角度可以靈活調(diào)整；本發(fā)明的第二電極為針形電極，直徑較細(xì)，在放入雞胚視頂蓋底部時(shí)，不會(huì)對(duì)組織或卵黃膜造成損傷，避免由此引起的胚胎死亡，且能夠起到良好的導(dǎo)電作用，同時(shí)該針形電極呈弧形，弧形設(shè)計(jì)能夠在不損傷雞胚的情況下起到固定雞胚視頂蓋的作用；本發(fā)明的第一電極為板形電極，由于板形結(jié)構(gòu)的面積較大，放置在視頂蓋上方(注入質(zhì)粒一側(cè))時(shí)，能夠增加質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染面積，提高轉(zhuǎn)染效率和成活率。
[0014]本發(fā)明各導(dǎo)線與對(duì)應(yīng)電極的連接部位設(shè)有手柄，便于操作時(shí)手握。
[0015]本發(fā)明的第二電極由鉬金或黃金材料制成，具有良好的導(dǎo)電性能。
[0016]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種使用電轉(zhuǎn)染裝置的雞胚視頂蓋電轉(zhuǎn)染方法，包括以下步驟:
[0017]1)雞胚培養(yǎng)
[0018]a)將新鮮受精雞蛋清洗、擦干，孵育，孵育第3天取出雞蛋，在雞蛋鈍端側(cè)面間隔Icm處分別打孔，從鈍端側(cè)面開(kāi)孔處吸取蛋清；
[0019]b)然后密封開(kāi)孔，繼續(xù)孵育至第5天，從雞蛋正上方開(kāi)孔處開(kāi)口，暴露胚胎，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
[0020]2)雞胚轉(zhuǎn)染
[0021]在孵育第5天時(shí)，將質(zhì)粒液注射到視頂蓋內(nèi)，將第二電極插入視頂蓋底部，將第一電極放置在被轉(zhuǎn)染視頂蓋上方，在電壓18V，電脈沖長(zhǎng)度60ms，間隔100ms，電脈沖6次條件下轉(zhuǎn)染即可；其中第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，針形電極呈弧形。
[0022]所述孵育溫度為37.5-37.8°C，濕度為60%_65%。
[0023]所述取出蛋清的量為3_4ml。
[0024]所述注射質(zhì)粒液的量為1-2 μ l ;所述質(zhì)粒液中質(zhì)粒的濃度為2-4 μ g/ μ l。
[0025]步驟2)轉(zhuǎn)染過(guò)程中，第一電極放置于被轉(zhuǎn)染視頂蓋的正上方，即注射質(zhì)粒位置的上方，無(wú)需插入卵黃膜內(nèi)，只是接近視頂蓋浸入蛋清即可，而且不需要接觸視頂蓋。
[0026]本發(fā)明無(wú)需將雞胚轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中去殼培養(yǎng)后電轉(zhuǎn)染，而是可以直接在蛋殼內(nèi)進(jìn)行操作。由于本發(fā)明所采用的電轉(zhuǎn)染裝置設(shè)計(jì)了 2個(gè)單獨(dú)的電極，能夠分開(kāi)來(lái)進(jìn)行放置，只需要將雞胚側(cè)面打開(kāi)窗口即可。本發(fā)明在雞胚孵育第3天(Ε3)時(shí)從雞胚的鈍端用注射器取出部分蛋清，主要目的是在Ε5時(shí)開(kāi)口的時(shí)候防止損傷胚胎，但與以往操作不同的是，本發(fā)明取出蛋清后無(wú)需開(kāi)口，而是將雞胚鈍端側(cè)面的2個(gè)孔密封，待培養(yǎng)至Ε5時(shí)再開(kāi)口轉(zhuǎn)染，這樣能大大降低雞胚污染的機(jī)會(huì)，提高雞胚的存活率。本發(fā)明在雞胚孵育第5天(Ε5)時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，此時(shí)雞胚是懸浮在整個(gè)蛋清的最上面，只需要將視頂部位的一層薄膜用尖頭鑷子撕破暴露視頂就可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染，整個(gè)轉(zhuǎn)染過(guò)程是在體視顯微鏡下進(jìn)行，能夠準(zhǔn)確看到質(zhì)粒注射的部位和電擊的部位，操作簡(jiǎn)單，在電壓18V，電脈沖長(zhǎng)度60ms，間隔100ms，電脈沖6次條件下轉(zhuǎn)染，雞胚成活率高，轉(zhuǎn)染后雞胚發(fā)育時(shí)間更長(zhǎng)，可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)雞胚在蛋殼內(nèi)發(fā)育過(guò)程基因功能的研究。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1為本發(fā)明用于雞胚視頂蓋轉(zhuǎn)基因的電轉(zhuǎn)染裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1
[0029]實(shí)施例1是本發(fā)明提供的用于雞胚視頂蓋轉(zhuǎn)基因的電轉(zhuǎn)染裝置的具體實(shí)施例，如圖1所示，一種電轉(zhuǎn)染裝置，包括電源供應(yīng)器I和經(jīng)兩個(gè)獨(dú)立的導(dǎo)線2分別與電源供應(yīng)器I測(cè)試端連接的第一電極3和第二電極4，所述第一電極3為橢圓形的板形電極，第二電極4為針形電極，所述針形電極呈弧形，由鉬金材料制成；所述第二電極4截面為直徑0.3mm的圓形；各導(dǎo)線2的與對(duì)應(yīng)電極的連接部位設(shè)有手柄5。
[0030]實(shí)施例2
[0031]實(shí)施例2是本發(fā)明提供的雞胚視頂蓋的電轉(zhuǎn)染方法的具體實(shí)施例，包括以下步驟:
[0032]I)雞胚培養(yǎng)
[0033]a)將新鮮受精雞蛋用溫水洗凈、擦干，水平放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱孵育，孵育溫度為37.8°C，濕度為60%，孵育至第3天取出雞蛋，不轉(zhuǎn)動(dòng)方向水平放置，在雞蛋鈍端側(cè)面間隔Icm處用IOml注射器針頭分別打一個(gè)孔，用帶有針頭的注射器將針頭刺入鈍端側(cè)面開(kāi)孔處吸取4ml蛋清；
[0034]b)然后密封兩個(gè)開(kāi)孔，繼續(xù)孵育至第5天，從雞蛋正上方開(kāi)口，暴露胚胎，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
[0035]2)雞胚轉(zhuǎn)染
[0036]在孵育第5天時(shí)，將I μ 1、質(zhì)粒濃度為4 μ g/ μ I的質(zhì)粒液注射到一側(cè)視頂蓋內(nèi)，將第二電極插入視頂蓋底部，將第一電極放置在被轉(zhuǎn)染視頂蓋上方，在電壓18V，電脈沖長(zhǎng)度60ms,間隔100ms，電脈沖6次條件下轉(zhuǎn)染即可；其中第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，針形電極呈弧形。
[0037]實(shí)施例3
[0038]實(shí)施例3是本發(fā)明提供的雞胚視頂蓋的電轉(zhuǎn)染方法的具體實(shí)施例，包括以下步驟:
[0039]I)雞胚培養(yǎng)
[0040]a)將新鮮受精雞蛋用溫水洗凈、擦干，水平放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱孵育，孵育溫度為37.8°C，濕度為60%，孵育至第3天取出雞蛋，不轉(zhuǎn)動(dòng)方向水平放置，在雞蛋鈍端側(cè)面間隔Icm處用IOml注射器針頭分別打一個(gè)孔，用帶有針頭的注射器將針頭刺入鈍端側(cè)面開(kāi)孔處吸取3ml蛋清；
[0041 ] b)然后密封兩個(gè)開(kāi)孔，繼續(xù)孵育至第5天，從雞蛋正上方開(kāi)口，暴露胚胎，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
[0042]2)雞胚轉(zhuǎn)染
`[0043]在孵育第5天時(shí)，將2 μ 1、質(zhì)粒濃度為2 μ g/ μ I的質(zhì)粒液注射到一側(cè)視頂蓋內(nèi)，將第二電極插入視頂蓋底部，將第一電極放置在被轉(zhuǎn)染視頂蓋上方，在電壓18V，電脈沖長(zhǎng)度60ms,間隔100ms，電脈沖6次條件下轉(zhuǎn)染即可；其中第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，針形電極呈弧形。
[0044]本發(fā)明的各實(shí)施例中，第二電極的截面也可以為其他直徑的圓形，如0.5mm。[0045] 本發(fā)明的各實(shí)施例中 ，第二電極也可以由其他導(dǎo)線材料制成，如黃金。
【權(quán)利要求】
1.一種電轉(zhuǎn)染裝置，包括用于與電源供應(yīng)器測(cè)試端連接的第一電極和第二電極，其特征在于，所述第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，所述針形電極呈弧形。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電轉(zhuǎn)染裝置，其特征在于，該裝置還包括電源供應(yīng)器，所述電源供應(yīng)器的測(cè)試端經(jīng)兩個(gè)獨(dú)立的導(dǎo)線分別與第一電極和第二電極連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的電轉(zhuǎn)染裝置，其特征在于，各導(dǎo)線與對(duì)應(yīng)電極的連接部位設(shè)有手柄。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的電轉(zhuǎn)染裝置，其特征在于，所述的第一電極為橢圓形的板形結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的電轉(zhuǎn)染裝置，其特征在于，所述的第二電極由鉬金或黃金材料制成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的電轉(zhuǎn)染裝置，其特征在于，所述第二電極截面為直徑0.3-0.5mm的圓形,頭部為光滑的圓頭。
7.一種使用權(quán)利要求1所述電轉(zhuǎn)染裝置的雞胚視頂蓋電轉(zhuǎn)染方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)雞胚培養(yǎng) a)將新鮮受精雞蛋清洗、擦干，孵育，孵育第3天取出雞蛋，在雞蛋鈍端側(cè)面間隔Icm處分別打孔，從鈍端側(cè)面開(kāi)孔處吸取蛋清； b)然后密封開(kāi)孔，繼續(xù)孵育至第5天，從雞蛋正上方開(kāi)孔處開(kāi)口，暴露胚胎，進(jìn)行轉(zhuǎn)染； 2)雞胚轉(zhuǎn)染 在孵育第5天時(shí)，將質(zhì)粒液注射到視頂蓋內(nèi)，將第二電極插入視頂蓋底部，將第一電極放置在被轉(zhuǎn)染視頂蓋上方，在電壓18V，電脈沖長(zhǎng)度60ms，間隔100ms，電脈沖6次條件下轉(zhuǎn)染即可；其中第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，針形電極呈弧形。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雞胚視頂蓋電轉(zhuǎn)染方法，其特征在于，所述孵育溫度為37.5-37.8°C，濕度為 60%-65%。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雞胚視頂蓋電轉(zhuǎn)染方法，其特征在于，所述取出蛋清的量為3_4mlο
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雞胚視頂蓋電轉(zhuǎn)染方法，其特征在于，所述注射質(zhì)粒液的量為1-2 μ I ;所述質(zhì)粒液中質(zhì)粒的濃度為2-4 μ g/μ I。
【文檔編號(hào)】C12M1/42GK103695311SQ201310680758
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】楊慈清, 王聰睿, 李小英, 林俊堂, 范文艷, 李瓊, 劉彥禮, 付蘇雷, 賈陽(yáng)陽(yáng), 李晗 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院