鴿圓環(huán)病毒的lamp檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于衛(wèi)生檢驗領(lǐng)域，公開了一種鴿圓環(huán)病毒的LAMP檢測試劑盒，它包括如SEQ?ID?No：1～4所示的核苷酸序列或者SEQ?ID?No：5～8所示的核苷酸序列。該試劑盒包含由四條LAMP引物的LAMP反應(yīng)液構(gòu)成的檢測體系。經(jīng)檢測驗證，本發(fā)明試劑盒具有良好的特異性、靈敏度，擴增快速、高效，且鑒定簡便。本發(fā)明的檢測體系在63℃等溫條件下，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏度地檢測到鴿圓環(huán)病毒，不需要復(fù)雜儀器，能較好滿足對鴿圓環(huán)病毒的現(xiàn)場檢測，為獸醫(yī)安全衛(wèi)生的檢測提供了新的技術(shù)平臺，能較好的滿足目前對鴿養(yǎng)殖現(xiàn)場檢測的迫切需要，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益。
【專利說明】鴿圓環(huán)病毒的LAMP檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬衛(wèi)生檢驗領(lǐng)域，涉及一種鴿圓環(huán)病毒的LAMP檢測試劑盒。
技術(shù)背景
[0002]鴻圓環(huán)病毒(Pigeon circovrius, PiCV)是一種免疫抑制性病原。鴻圓環(huán)病毒感染是一種接觸性傳染病和免疫抑制病，主要侵害幼鴿。鴿子感染后主要表現(xiàn)為昏睡、嗜眠、厭食、體重減輕、呼吸窘迫等癥狀，嚴(yán)重時甚至出現(xiàn)死亡，給養(yǎng)鴿業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。該病于1993年首次報道于美國加利福尼亞，同年南非也發(fā)現(xiàn)本病，此后，在加拿大、德國、t匕利時、意大利以及法國等多個國家均有感染報道。我國也有幼齡賽鴿和肉鴿圓環(huán)病毒感染的報道，患鴿主要表現(xiàn)為倦怠、消瘦、呼吸紊亂、腹瀉和競技能力下降等。
[0003]目前，鴿圓環(huán)病毒還沒有受到廣泛的關(guān)注，有關(guān)研究報道較少。在檢測方面，國內(nèi)外已有PCR檢測方法的相關(guān)報道，該方法雖然靈敏度高，但確存在著檢測時間長、操作繁瑣、需要精良設(shè)備等諸多弊端，不適合用于臨床檢測。因此，建立一種快速、敏感和方便的檢測方法將是防控該病的關(guān)鍵。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)是由T.Notomi (2000)發(fā)明的一種新型核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)依賴4條特異設(shè)計的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、快速、高特異地擴增靶序列。今年來，國外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體的檢測。Masaki Imai等人(2007)利用LAMP建立了禽流感病毒的實驗室確診體系；NobuyukiHayashi等人(2007)針對 四種香酒酵母的ITS序列設(shè)計了 LAMP特異性引物，建立了高效的LAMP檢測體系。LAMP還可以用于檢測其他與人類相關(guān)的病毒，如病毒性出血性敗血癥(VHS)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、造血組織壞死病毒(IHHNV)、番茄黃化曲葉病毒等。LAMP還可以用于對動物早期胚胎性別鑒定等。目前國內(nèi)外均未見有用于檢測鴿圓環(huán)病毒的LAMP試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種使用方便、敏感度高、鑒定簡便的鴿圓環(huán)病毒的LAMP檢測試劑盒。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]鴿圓環(huán)病毒的LAMP檢測試劑盒，它包括如SEQ ID No:1~4所示的核苷酸序列或者SEQ ID No:5~8所示的核苷酸序列。
[0008]上述鴿圓環(huán)病毒的LAMP檢測試劑盒，優(yōu)選包括:
[0009](I)LAMP反應(yīng)液:每24 μ L LAMP反應(yīng)液的配制比例為:10XThermoPolbuffer2.5 μ L> IOOmM MgSO40.5 ~1.5yL、8M Betaine0.5 ~2.0yL、10mM dNTPsl.5 ~3.0μ L、10yM 上游引物 F30.25 ~1.5 μ L、10 μ M 下游引物 Β30.25 ~1.5 μ L、40 μ M 內(nèi)上游引物 FIP0.25 ~1.5μ L、40yM 內(nèi)下游引物 BIP0.25 ~1.5μ L、8U/y L Bst DNA 聚合酶大片段0.5~2.0 μ L、用滅菌ddH20補至24 μ L ；[0010](2)陽性模板:鴿圓環(huán)病毒陽性脾臟DNA ；
[0011](3)核酸染料:SYBR Green I ；
[0012]其中，上游引物F3、下游引物B3、內(nèi)上游引物FIP、內(nèi)下游引物BIP的核苷酸序列分別如SEQ ID No:1~4所示,或者分別如SEQ ID No:5~8所示。
[0013]其中，所述的LAMP反應(yīng)液，每24 μ L LAMP反應(yīng)液的優(yōu)選配制比例為:10XThermoPol buffer2.5 μ L> IOOmM MgSO4L O μ L、8M Betainel.5 μ L> IOmM dNTPs2 μ L、10 μ M 上游引物 F30.5 μ L、10 μ M 下游引物 B30.5 μ L、40 μ M 內(nèi)上游引物 FIP0.5 μ L、40 μ M內(nèi)下游引物BIP0.5μ L、8U/y L Bst DNA聚合酶大片段1.5 μ L、用滅菌ddH20補至24 μ L。
[0014]上述的上游引物F3、下游引物Β3、內(nèi)上游引物FIP、內(nèi)下游引物BIP分別為1F3( SEQID No:1)、1B3 (SEQ ID No:2)、1FIP (SEQ ID No:3)、1BIP (SEQ ID No:4)組成的第一套引物，或 2F3(SEQ ID No:5)、2B3 (SEQ ID No:6)、2FIP (SEQ ID No:7)、2BIP (SEQ ID No:8)組成的第二套引物，所述1F3、1B3、1FIP、1BIP或2F3、2B3、2FIP、2BIP的序列見表1。表中的排序序號中的I~4為第一套引物，5~8為第二套引物。
[0015]表1
[0016]
【權(quán)利要求】
1.鴿圓環(huán)病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，它包括如SEQID No:1~4所示的核苷酸序列或者SEQ ID No:5~8所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴿圓環(huán)病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，它包括: (1)LAMP反應(yīng)液:每 24 μ L LAMP 反應(yīng)液的配制比例為:10 X ThermoPol buffer2.5 μ L、IOOmM MgSO40.5 ~1.5 μ L、8M Betaine0.5 ~2.0 μ L、IOmM dNTPsl.5 ~3.0 μ L、10 μ M 上游引物F30.25~1.5 μ L、10yM下游引物Β30.25~1.5 μ L、40 μ M內(nèi)上游引物FIP0.25~1.5μ L、40yM內(nèi)下游引物ΒΙΡΟ.25~L 5μ L、8U/y L Bst DNA聚合酶大片段0.5~2.0 μ L、用滅菌 ddH20 補至 24 μ L ； (2)陽性模板:鴿圓環(huán)病毒陽性脾臟DNA； (3)核酸染料=SYBRGreen I ； 其中，上游引物F3、下游引物Β3、內(nèi)上游引物FIP、內(nèi)下游引物BIP的核苷酸序列分別如SEQ ID No:1~4所示，或者分別如SEQ ID No:5~8所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴿圓環(huán)病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述的LAMP反應(yīng)液，每24 μ L LAMP反應(yīng)液的配制比例為:10 X ThermoPol buffer2.5 μ L、IOOmMMgSO4L O μ L、8M Betainel.5 μ L、IOmM dNTPs2 μ L、10 μ M 上游引物 F30.5 μ L、10 μ M下游引物Β30.5μ L、40yM內(nèi) 上游引物FIP0.5μ L、40yM內(nèi)下游引物BIP0.5μ L、8U/y LBstDNA聚合酶大片段1.5 μ L、用滅菌ddH20補至24 μ L。
【文檔編號】C12Q1/70GK103667536SQ201310687257
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】杜改梅, 劉茂軍, 陳熠夕, 羅碧平, 胡志華, 晏文梅, 蔣加進, 戴鼎震 申請人:金陵科技學(xué)院