一種用于糖絲菌的pcr引物及檢測糖絲菌的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領域，公開了一對用于擴增糖絲菌DNA的PCR引物，其上游引物序列如SEQ?ID?No.1所示，下游引物序列如SEQ?ID?No.2所示。本發(fā)明還提供用所述引物檢測糖絲菌的方法及試劑盒。本發(fā)明所述引物適合于純化糖絲菌擴增DNA，也適合于從混合菌群擴增糖絲菌DNA，擴增出糖絲菌安全、準確、快速、穩(wěn)定，特異性強，靈敏度高。
【專利說明】—種用于糖絲菌的PCR引物及檢測糖絲菌的方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領域，具體涉及一種用于糖絲菌的PCR引物及檢測糖絲菌的方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002]糖絲菌屬細菌屬于放線菌目假諾卡氏菌科，是一類好氧的革蘭氏陽性菌，大多數(shù)糖絲菌能在沙漠中廣泛生長。糖絲菌具有一個相對快速和簡單的生長周期，可作為實驗系統(tǒng)進行科學研究。
[0003]糖絲菌具有重要的應用價值，分離到的多株糖絲菌能生產(chǎn)多種強效抗菌素。另外糖絲菌能夠以蒽、菲、芘為惟一碳源和能源，降解及利用一些環(huán)境污染物及有機物如烷烴。因此糖絲菌越來越為人們所關注。
[0004]現(xiàn)有技術中，有兩種常用的對糖絲菌進行鑒定的方法:
[0005]1、生理生化指標鑒定。此方法是目前許多生化實驗室常用的方法，此方法需要得到菌株的純培養(yǎng)物，且實驗周期長，實驗結(jié)果受人為觀察影響因素較大，準確性不高。
[0006]2、提取菌株DNA進行測序。目前是用16SrRNA基因引物進行PCR擴增，將擴增出的DNA片段進行測序。此方法結(jié)果比較準確。但仍需要得到菌株的純培養(yǎng)物，無法從混合樣品中快速鑒定是否含有假單胞菌。
[0007]因此本領域迫切需要開發(fā)出一種能夠快速、準確判定糖絲菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所需要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術鑒定糖絲菌試驗
[0009]周期長、適用范圍窄的不足，提供一種能夠快速、準確、方便，可對混合樣品如土壤、海底沉積物、水中是否含有糖絲菌進行快速判定的方法。
[0010]為了實現(xiàn)上述目的，本申請發(fā)明人設計了一對針對糖絲菌16SrDNA基因部分片段的 PCR 引物，設計簡并引物:Sac-F:5，-GCGGTTTGTTGCGTCGG-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)，Sac-R:5，-TAGCACCCACCGTTTACG-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0011]所述16S rDNA基因是指基因組中編碼16S核糖體RNA (rRNA)分子的對應的DNA序列，也就是編碼16S rRNA的基因，本發(fā)明所述引物的16S rDNA目的基因具體如下:
[0012]GAGGCAGACCTCGCTGCTTACCATGCAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTGTACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTAGGTCTAATACCGGATATGACTCCACTAGGCATCTTGTGGGGTGGAAAGTTCCGGCGGTACAGGATGGACCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCACCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAAGCGGTTTGTTGCGTCGGCTGTGAAAACTTCACGCTTAACGTGGAGCCTGCAGTCGATACGGGCAGACTTGAGTTCGGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGCGTAGCGGTGAAATGCGCAGATACCACGACGAACGCCGGTGGGGAAGGCGGGGCT (如 SEQID N0.3 所示)。
[0013]本發(fā)明的術語“引物”指作為合成引物延伸產(chǎn)物的起始位點的單鏈寡核苷酸序列，其與待復制的核酸鏈互補，長度和序列必須適合于延伸產(chǎn)物的合成。引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，核酸聚合酶可由其3'端開始合成新的核酸鏈。體外人工設計的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應、測序和探針合成等。
[0014]本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測糖絲菌的試劑盒，包含用于擴增的PCR引物，其上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如SEQ ID N0.2所示。
[0015]本發(fā)明還提供一種檢測糖絲菌的方法，包含以下步驟:
[0016]步驟1:配制PCR反應體系，94°C預變性10分鐘進行30個PCR循環(huán)，循環(huán)完畢后72°C延伸10分鐘；所述PCR反應體系中上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如 SEQ ID N0.2 所示；
[0017]步驟2:檢測擴增結(jié)果并進行測序比對。
[0018]作為優(yōu)選，步驟I所述PCR循環(huán)參數(shù)為:94°C變性lmin、56°C復性lmin、72°C延伸lmin。
[0019]作為優(yōu)選，步驟I中所述PCR反應體系為:
[0020]PCR 緩沖液:5i iL
[0021]dNTP: 4 u L
[0022]Primer F 上游引物:I ii L
[0023]Primer R 下游引物:I U L
[0024]樣品DNA:luL
[0025]Taq:0.5 U L
[0026]ddH20:37.5 U L
[0027]其中，樣品DNA濃度為10-200ng/iiL，上游引物及下游引物濃度為10-20pmol/U L0
[0028]作為優(yōu)選，步驟2所述檢測為瓊脂糖電泳檢測280bp的條帶出現(xiàn)。
[0029]本發(fā)明與現(xiàn)有的技術相比具有如下有益效果:
[0030]1.本發(fā)明所述糖絲菌檢測方法操作簡單，耗時少，結(jié)果更精確。
[0031]2.本發(fā)明所述引物目標位于16S rDNA基因，該基因在進化中較為保守，是分類學研究中常用的研究對象，具有較高特異性。
[0032]3.本發(fā)明所述方法檢測周期短，在3小時內(nèi)得出結(jié)果、適用范圍廣，無需分離純菌株即可對各種環(huán)境樣品中是否含有糖絲菌屬細菌進行檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1本發(fā)明所述引物以混合菌株DNA為模板的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖；
[0034]圖2本發(fā)明所述引物以土壤DNA為模板的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖；其中泳道1_4分別為不同土壤的DNA樣品；
[0035]圖3本發(fā)明所述引物以混合菌株DNA為模板的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖；其中泳道I和泳道2為同一 DNA樣品；
[0036]圖4本發(fā)明所述引物以糖絲菌DNA配制的梯度濃度的DNA為模板的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖；其中泳道1-6中所含DNA含量分別為200ng，200X10 —ingdOOXlO —2ng、200X10一3ng、200X 10 4ng、200X 10 5ng?！揪唧w實施方式】
[0037]本發(fā)明公開了一種用于糖絲菌的PCR引物及檢測糖絲菌的方法及試劑盒，本領域技術人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[0038]為了使本領域的技術人員更好地理解本發(fā)明的技術方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0039]實施例1:以純培養(yǎng)物基因組DNA為模板用本發(fā)明所述引物進行PCR擴增
[0040]步驟1:選取含有糖絲菌的混合菌培養(yǎng)物，提取其基因組DNA。提取方法參照TAKARA公司的細菌基因組DNA提取試劑盒，得到混合菌的基因組DNA。
[0041 ] 步驟2:以步驟I得到的DNA為模板，配制為100-200ng/ y L的DNA樣品，與10-20pmol/ii L的PCR引物配成如下50 y L反應體系，進行PCR擴增反應:
[0042]PCR buffer:5 U L
[0043]dNTP:4u L
[0044]Primer F 上游引物:1 U L
[0045]Primer R 下游引物:1 U L
[0046]DNA: I u L
[0047]Taq:0.5u L
[0048]ddH20:37.5 U L
[0049]步驟3:按照上述體系混合之后，將PCR管放入PCR儀器進行擴增。PCR程序如下:
[0050]I預變性94°C 10分鐘
[0051]2變性 94 °C I分鐘
[0052]3復性 56 °C I分鐘
[0053]4延伸 72 °C I分鐘
[0054]2至4循環(huán)30次
[0055]5 延伸 72°C 10 分鐘
[0056]PCR 酶采用的是 Taq 酶(TAKARA)
[0057]步驟4:電泳觀察。取出PCR終產(chǎn)物5 ii L與I ii L上樣緩沖液混合，80V, 1%瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，在凝膠電泳成像儀下紫外觀察。結(jié)果見圖1所示，其中，泳道M為marker，泳道I為含有糖絲菌的混合菌DNA樣品，可見泳道I特異擴增出280bp的條帶。將擴增出的條帶回收后進行測序。測序結(jié)果表明，所擴增的280bp條帶即為引物設計時糖絲菌屬的目標基因片段，其序列如SEQ ID N0.3所示；280bp條帶為目標基因片段。[0058]實施例2:以土壤細菌基因組DNA為模板進行PCR擴增
[0059]步驟1:取I至2克土壤樣品，提取其微生物總DNA。提取方法參照DNA Recoveryfrom Soils of Diverse Composition (JIZHONG ZHOU, 1996),得到土壤總 DNA 溶液。
[0060]步驟2:以步驟I得到的DNA為模板，配制為100-200ng/ y L的DNA樣品，與10-20pmol/ii L的PCR引物配成如下50 y L反應體系，進行PCR擴增反應:
[0061]PCR buffer:5 U L
[0062]dNTP:4u L
[0063]Primer F 上游引物:1 ii L
[0064]Primer R 下游引物:1 U L
[0065]DNA: I u L
[0066]Taq:0.5 U L
[0067]ddH20:37.5 U L
[0068]步驟3:按照上述體系混合之后，將PCR管放入PCR儀器進行擴增。PCR程序如下:
[0069]I預變性 94°C 10分鐘
[0070]2變性 94 °C I分鐘
[0071]3復性 56 °C I分鐘
[0072]4延伸 72 °C I分鐘
[0073]2至4循環(huán)30次
[0074]5 延伸 72°C 10 分鐘
[0075]PCR 酶采用的是 Taq 酶(TAKARA)
[0076]步驟4:電泳觀察。取出PCR終產(chǎn)物5 ii L與I ii L上樣緩沖液混合，80V, 1%瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，在凝膠電泳成像儀下紫外觀察，結(jié)果見圖2所示，其中，泳道M為marker，泳道1-4為土壤樣品?？梢娪镜?和泳道3可特異性擴增出280bp的條帶，泳道I和泳道4未有目標條帶出現(xiàn)。將擴增出的條帶回收后進行測序。測序結(jié)果表明，所擴增的280bp條帶即為引物設計時糖絲菌屬的目標基因片段，其序列如SEQ ID N0.3所示，為糖絲菌DNA擴增產(chǎn)物。則據(jù)此判定泳道2和泳道3的土壤樣品含有糖絲菌，泳道I和泳道4的土壤樣品則不含有糖絲菌。對泳道1-4的樣品進行培養(yǎng)鑒定，與用本發(fā)明所述引物進行PCR擴增的鑒定結(jié)果一致。
[0077]實施例3:本發(fā)明所述引物擴增糖絲菌DNA的穩(wěn)定性試驗
[0078]參照實施例1和實施例2，選取含有糖絲菌的混合菌株純培養(yǎng)物，提取其基因組DNA。
[0079]步驟2:以步驟I得到的DNA為模板，配制為100_200ng/ ii L的DNA樣品，與10-20pmol/ii L的PCR引物配成如下50 y L反應體系，進行PCR擴增反應:
[0080]PCR buffer:5 U L
[0081]dNTP:4u L
[0082]Primer F 上游引物:1 ii L
[0083]Primer R 下游引物:1 U L
[0084]DNA: I u L
[0085]Taq:0.5 U L[0086]ddH20:37.5u L
[0087]步驟3:按照上述體系混合之后，將PCR管放入PCR儀器進行擴增。PCR程序如下:
[0088]1預變性 94°C 10分鐘
[0089]2變性 94 °C 1分鐘
[0090]3復性 54 °C I分鐘
[0091]4延伸 72 °C I分鐘
[0092]2至4循環(huán)30次
[0093]5 延伸 72°C 10 分鐘
[0094]PCR 酶采用的是 Taq 酶(TAKARA )
[0095]步驟4:電泳觀察。取出PCR終產(chǎn)物5 ii L與I ii L上樣緩沖液混合，80V, 1%瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，在凝膠電泳成像儀下紫外觀察。結(jié)果見圖3所示，其中，泳道M為marker，泳道I和2為同一混合菌基因組DNA樣品?？梢娪镜繧和泳道2均可特異性擴增出280bp的條帶。將擴增出的條帶回收后進行測序。將擴增出的280bp條帶回收后進行測序。測序結(jié)果表明，所擴增的280bp條帶為引物設計時紅球菌屬的目標基因片段，其序列如SEQ IDN0.3所示，為糖絲菌DNA擴增產(chǎn)物。對樣品進行培養(yǎng)鑒定，與用本發(fā)明所述引物進行PCR擴增的鑒定結(jié)果一致。說明本發(fā)明所述引物擴增糖絲菌DNA重復性好，
[0096]結(jié)果穩(wěn)定。
[0097]實施例4:本發(fā)明所述引物擴增糖絲菌DNA的靈敏度試驗
[0098]取純化的糖絲菌基因組DNA配制梯度濃度的DNA溶液，原液所含DNA為200ng，依次稀釋為 DNA 濃度為 200 X 10 — Sg、200 X 10 — 2ng、200 X 10 — 3ng、200 X 10 — 4ng、200 X 10 —5ng,參照實施例1所述方法進行PCR擴增，取擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，結(jié)果可見在DNA含量在200X 10 —3ng處，仍可擴增出280bp目的條帶，而DNA含量在200X 10 —4ng和200 X 10 一5處，無任何條帶出現(xiàn)(見圖4)，說明在DNA模板含量為200X 10 —3ng時，引物仍可準確擴增出紅球菌目標條帶，靈敏度高。
[0099]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一對擴增糖絲菌DNA的PCR引物，其特征在于，其上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如SEQ ID N0.2所示。
2.一種檢測糖絲菌的試劑盒，其特征在于，包含用于擴增的PCR引物，其上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如SEQ ID N0.2所示。
3.—種檢測糖絲菌的方法，包含以下步驟: 步驟1:配制PCR反應體系，94°C預變性10分鐘進行30個PCR循環(huán)，循環(huán)完畢后72°C延伸10分鐘；所述PCR反應體系中上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如SEQID N0.2 所示； 步驟2:檢測擴增結(jié)果并進行測序比對。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其特征在于，步驟I所述PCR循環(huán)參數(shù)為:94°C變性lmin、56°C復性 lmin、72°C延伸 lmin。
5.根據(jù)權利要求3的方法，其特征在于，步驟I中所述PCR反應體系為: PCR緩沖液:5 ii L
dNTP:4u L Primer F上游引物:1 U L Primer R下游引物:1 U L 樣品 DNA:1ii L` Taq:0.5 u L ddH20:37.5u L 其中，樣品DNA濃度為10-200ng/iiL，上游引物及下游引物濃度為10-20pmol/y L。
6.根據(jù)權利要求3的方法，其特征在于，步驟2所述檢測為瓊脂糖電泳檢測280bp的條帶出現(xiàn)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103614488SQ201310689164
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權日:2013年12月16日
【發(fā)明者】梅海, 郝純, 李雪, 張勇 申請人:盎億泰地質(zhì)微生物技術（北京）有限公司