一種漆酶基因Lac6及其表達蛋白和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種漆酶基因Lac6及其表達蛋白和應用，該漆酶基因Lac6的DNA序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明通過13種染料對重組雞腿菇漆酶脫色進行研究，發(fā)現(xiàn)重組漆酶Lac6+10AA的脫色作用主要發(fā)生在反應開始的1、2小時內，隨著時間的延長，脫色速度減緩，純酶的脫色效果明顯優(yōu)于粗酶液，且無論粗酶還是純酶在加入HBT后脫色率都會增加。Lac6+10AA對雷瑪唑亮藍和孔雀石綠的脫色效果比較好，加入介體HBT后脫色率都可達90%以上。具有很好的工業(yè)應用前景，能產(chǎn)生較好的經(jīng)濟效益和社會效應。
【專利說明】一種漆酶基因Lac6及其表達蛋白和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明基因工程【技術領域】，特別涉及一種漆酶基因Lac6及其表達蛋白和應用。
【背景技術】
[0002]漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，與抗壞血酸氧化酶和哺乳動物血漿銅藍蛋白同源，都屬于藍色多銅氧化酶家族，由于漆酶具有特殊的催化性能和廣泛的作用底物，其在紡織染料脫色和紙漿漂白，高分子合成，環(huán)境檢測，食品工業(yè)，解毒和生物修復等方面具有潛在應用價值，因此，關于漆酶的異源表達及其表達調控的研究成為目前國際上酶工程學和環(huán)境科學交叉領域研究的熱點。
[0003]關于食用真菌漆酶的研究越來越多，例如已經(jīng)出現(xiàn)蜜環(huán)菌、杏鮑菇、雞腿菇、平菇、香菇、金針菇等的相關報道。現(xiàn)在關于漆酶的研究不僅涉及其生物學特性、分離純化等方面，而且己經(jīng)深入到分子水平進入基因工程階段。但多種漆酶自身的表達量很低，對漆酶基因的克隆和序列分析，使其在異源宿主上高效表達重組漆酶蛋白，是解決其高表達并得以應用是一個重要的手段，因此一直有人研究漆酶的異源表達。
[0004]漆酶具有多種同功酶，不同來源的真菌漆酶，在分子量、對溫度和pH的適應性以及耐受能力、酶反應動力學等特征方面都有一定的差異，同一生物產(chǎn)生的不同同功酶的酶學特性也存在差異。因此還需要對漆酶進行不斷的深入研究。

【發(fā)明內容】

[0005]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種漆酶基因Lac60本發(fā)明的另一目的是提供一種上述漆酶基因Lac6的表達蛋白。本發(fā)明還有一目的是提供一種上述漆酶基因Lac6的應用。通過對13種不同染料的脫色作用，為漆酶的外源表達及其工業(yè)化應用提供理論依據(jù)。
[0006]技術方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:
[0007]一種漆酶基因Lac6，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述漆酶基因的表達蛋白，其氣基酸序列如SEQ ID N0.2所不。
[0009]一種所述漆酶基因的表達蛋白的表達方法，在所述的SEQ ID N0.2所不氣基酸序列上添加有10個氨基酸序列組成的表達標簽，所述的氨基酸序列為TPFPPFNTNS ;所表達的蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010]所述的漆酶基因Lac6在對染料的脫色中的應用。
[0011]有益效果:與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的漆酶基因及其表達蛋白和應用，具有的優(yōu)點在于:通過13種染料對重組雞腿菇漆酶脫色進行研究，發(fā)現(xiàn)重組漆酶Lac6+10AA的脫色作用主要發(fā)生在反應開始的1，2小時內，隨著時間的延長，脫色速度減緩，純酶的脫色效果明顯優(yōu)于粗酶液，且無論粗酶還是純酶在加入HBT后脫色率都會增加。Lac6+10AA對雷瑪唑亮藍和孔雀石綠的脫色效果比較好，加入介體HBT后脫色率都可達90%以上。具有很好的工業(yè)應用前景，能產(chǎn)生較好的經(jīng)濟效益和社會效應。【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是雞腿菇總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中，M為Marker，I為提取的雞腿菇總RNA ；
[0013]圖2是雞腿菇DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中，M為Marker，1、2為提取的雞腿菇DNA ；
[0014]圖3是簡并性引物的擴增結果圖；左圖為一號位與二號位引物PCR結果，右圖為一號位與四號位引物PCR結果；
[0015]圖4是重組質粒PCR篩選鑒定結果圖；圖中，M為Marker，1-8為陽性克隆結果；
[0016]圖5是重組質粒PCR篩選鑒定結果圖；圖中，M為Marker，1-10為陽性克隆結果；
[0017]圖6是5’ RACE擴增結果圖；M為Marker, I號泳道為擴增產(chǎn)物；C:lac65’ RA CE ；
[0018]圖7是漆酶3’ -RACE擴增結果；
[0019]圖8是Iac6+10AA Xba I，sac II酶切位點的PCR獲得電泳圖，M為Marker, I號為PCR引入酶切位點的結果；
[0020]圖9是重組質粒Iac6+10AA PCR篩選鑒定結果圖，M為Marker ;1_10號泳道為挑選的白斑做PCR的結果；
[0021]圖10是重組質粒提取結果電泳圖；M:mark, 2:lac6+10AA ；
[0022]圖11是MM平板生物反應檢測漆酶lac6活性結果圖；B:lac6+10AA ；
[0023]圖12是重組漆酶的生長曲線圖；
[0024]圖13是銅離子濃度對漆酶Iac6+10AA表達的影響結果圖；
[0025]圖14是酶液經(jīng)分離純化后SDS-PAGE檢測結果圖；
[0026]圖15雞腿菇重組漆酶Lac6+10AA的最適溫度結果圖；
[0027]圖16重組漆酶Lac6+10AA的熱穩(wěn)定性結果圖；
[0028]圖17重組漆酶Lac6+10AA的最適反應pH結果圖；
[0029]圖18重組漆酶Lac6+10AA的pH穩(wěn)定性結果圖；
[0030]圖19是不同時間對Lac6+10AA純酶(無介質)脫色的影響結果圖；
[0031]圖20是不同時間對Lac6+10AA純酶(有介質)脫色的影響影響結果圖；
[0032]圖21是重組雞腿菇漆酶Lac6+10AA對蒽醌類染料的脫色結果圖；
[0033]圖22是重組雞腿菇漆酶Lac6+10AA對偶氮類染料的脫色結果圖；
[0034]圖23是重組雞腿菇漆酶Lac6+10AA對三苯甲烷類染料的脫色結果圖。
【具體實施方式】
[0035]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0036]實施例1
[0037](I)雞腿菇菌絲的獲取
[0038]將雞腿菇菌種從試管斜面接種到PDA平板上，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用滅過菌的直徑為Icm的打孔器在長滿菌絲的PDA平板上(雞腿菇需十天左右)打孔，挑四塊菌落放于每個滅過菌的250mL三角瓶中(每瓶含有30mL液體培養(yǎng)基)，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在第10天，加入咖啡酸(終濃度為ImM)誘導，第22天收集菌絲。將菌絲用紗布過濾，然后用PBS沖洗兩次,液氮速凍后放入_80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0039](2)總RNA的提取
[0040]采用Invitrogen的TRIZOL試劑提取，具體過程:將雞腿菇樣品從_80°C冰箱中取出，液氮研磨成粉末；取適量粉末加入ImL TRIZOL試劑，振蕩6次，每次15s，室溫放置5min ;加入0.2mL氯仿,震蕩混合均勻，室溫靜置5min ;用小于等于12000g的轉速4°C離心15min ;上清液轉移至干凈的離心管,加入異丙醇0.25mL, NaAc0.25mL上下顛倒數(shù)次室溫靜置IOmin,用不超過12000g的轉速離心4°C離心IOmin ;棄上清,沉淀用75%乙醇清洗,用槍輕柔吹打，使沉淀漂起；用小于7500g的速度4°C離心5min ;棄上清，加入75%乙醇再次漂洗，離心步驟同上；棄上清干燥RNA，加入20-30 μ LDEPC-H2O溶解，_80°C保存。
[0041]提取的RNA跑瓊脂糖電泳，經(jīng)電泳分離和溴化乙錠染色后，根據(jù)高豐度的28S和18S核糖體RNA (rRNA)條帶的亮度來判斷RNA的完整性。粗提取的RNA經(jīng)非變性1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1所示，樣品出現(xiàn)18S和28S兩條RNA特征亮帶，RNA質量較好，可以后續(xù)使用。
[0042](3)雞腿菇基因組DNA的提取
[0043]真菌DNA的提取方法參照實驗手冊:取Ig菌絲，用液氮研磨充分；加入IOmL D NAlysis buffer (0.1M Tris-Hcl (pH8.0),0.05M EDTA，0.5%SDS，1%β -巰基乙醇，65°C保溫Ih ;加入等體積苯酹:氯仿:異戍醇(25:24:1), 1000Og,4°C, 15min ;轉上清至一干凈離心管，加等體積氯仿:異戊醇(24:1)，10000g，4°C，15min ;轉上清液，加入1/3體積的3M NaAc(ρΗ5.2)，一倍體積異丙醇;-20°C放置I小時，10000g，4°C，5min ;加入15mL75%乙醇，漂洗DNA沉淀，室溫放置干燥30min (至無乙醇味)；加入500 μ L TE buffer溶解，轉移到1.5mL的離心管；加入RNasel0uL，37°C保溫Ih ;酚仿抽提:①加入I倍體積酚,室溫放置lOmin，13000rmp, IOmin,取上清?·，② 1/2 體積酹+1/2 體積氯仿，室溫放置 lOmin, 13000rmp, IOmin,取上清?、垡槐扼w積氯仿，室溫放置lOmin, 13000rmp, IOmin,取上清。乙醇沉淀:①2倍體積無水乙醇，1/10 體積 3M NaAc (ρΗ5.2)，_20°C放置數(shù)小時；? 4°C，16000rmp，離心 15min，棄上清；③加入75%乙醇漂洗沉淀2次，風干；④加入500 μ L TE buffer溶解沉淀，-20°C保存。
[0044]提取的DNA用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖2所示，可見在5000bp以上有清晰條帶，此DNA可用作后續(xù)試驗。
[0045](4)雞腿菇漆酶基因組DNA序列的獲得
[0046]多數(shù)真菌漆酶是單體蛋白質，酶分子中一般都含有4個銅原子，根據(jù)銅結合區(qū)的保守氨基酸序列可設計簡并性引物，克隆漆酶。
[0047]擴增漆酶基因片段引物:一號位正向引物:5’ -CAYTGGCAYGGNTTYTTYCA-3 ’ ；二號位反向引物:5’ -GRCTGTGGTACCAGAANGTNCC-3’ ；四號位反向引物:5’ -TGCCARTCDATRTGRCARTG_3’。
[0048]普通PCR，采用 25 μ L PCR 體系:2yL25XdNTP Mix, 1.5μ L Mg+ (MgCl2),
2.5μ L10XAdvantage2PCR buffer, 15.375 μ L PCR-H2O, 2.5 μ L 模板 DNA，0.125 μ L RTaq,
0.5μ L正向引物，0.5μ L反向引物。
[0049]PCR 條件:95°C (lmin),95°C (30s)，55°C (30s)，72°C (2min) ;28circles。
[0050]目的片段的回收，步驟如下:(I)先稱量空的1.5mL的離心管的質量，隨后稱量放入膠的離心管的重量。以便測得膠的重量，Img對應I μ L。(2)加入buffer GC于68°C恒溫水浴中6~Smin至完全溶解(期間每過2分鐘最好搖晃數(shù)次以確保充分溶解)。(3)將溶解后的溶液轉入純化專用離心管中，12000g，lmin。(4)棄管中溶液，加入500MLDNA WashingBuffer, 12000g, Imin0 (5)棄管中溶液，空轉一次以去除DNA Wa shing Buffer中殘留的酒精。(6)取一干凈的離心管，將過濾器置于離心管中。(7)加入約30yL ddH20充分溶解，12000g，離心lmin。(8)為保證目的樣完全溶解，將試管中的溶解液吸出并再次打入過濾器，再次離心。(9)取5 μ L提純后的DNA，進行鑒定DNA質量。
[0051]使用一號位正向引物和二號位反向引物、一號位正向引物和四號位反向引物，以提取的DNA為模板，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖3所示，一號位與二號位引物的擴增產(chǎn)物大小在200bp左右，一號位與四號位引物的擴增產(chǎn)物大小在1600bp左右，這與預期結果相同，可用這些擴增產(chǎn)物進行后續(xù)試驗。
[0052]純化產(chǎn)物與PCR載體的連接:純化產(chǎn)物加A (腺嘌呤)尾后放入PCR儀中，70°C，30min。加尾體系為:I μ L10XPCR buffer (Mg2+free)、I μ L MgCl2 (25mM)U μ L d ATP(50X )>1 μ L Taq polymerase、7 μ L 純化產(chǎn)物。
[0053]將上述加完A尾的片段連接到PCR載體上，4°C連接過夜。連接體系為:I μ LlOXligation buffer,2y L PCR2.lvector、6 μ L 加 A 尾后的產(chǎn)物、I μ L T4DNAIigase0
[0054]制備大腸桿菌感受態(tài)細胞:活化大腸桿菌，用IL的三角瓶(加250mL LB培養(yǎng)基)培養(yǎng)菌，約2小時,測OD值在0.5即可。分裝50mL離心管中離心,2000g,離心6mi m。加IOmL氯化1丐(先在冰中放置)懸浮，3管并I管,最后定容至20mL。1200g,6min離心。加IOmL氯化鈣輕輕懸浮，在冰中放 置30min。1200g,6min離心。加2mL~3mL氯化鈣懸浮,分裝IOOul一管，一80°C保存。
[0055]轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞:①將DH5 α感受態(tài)細胞(200 μ I)從_80°C冰箱中取出，冰上解凍。②將連接產(chǎn)物加入化凍的DH5a中，用移液槍混合均勻。③冰浴30min甚至更長時間。④42°C熱擊2min (精確)。⑤加入0.5mL LB培養(yǎng)基，37°C，200rpm，搖床培養(yǎng)I小時。⑥由于菌液較濃，故不進行離心濃縮，IPTG40y L和X_Gal20l.! L混合均勻，后將菌體加入涂LBA平板。⑦37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
[0056]藍白斑及菌落PCR篩選陽性克隆并測序:從涂布含有IPTG和X-Gal的LBA平板中挑取白斑為模板，以T7、M13reverse為引物用程序2.2.4.2進行PCR擴增，篩選長度合適的白斑，取陽性菌株測序。把兩組PCR產(chǎn)物與PCR載體相連接，轉入大腸桿菌感受態(tài)，涂布含有IPTG和X-Gal的LBA平板，37°C過夜培養(yǎng)得到藍白斑，根據(jù)β -葡糖糖苷酶的α -互補原理，知道得到的白斑是插入外源基因片段的陽性克隆。對白斑進行菌落PCR篩選，以確定插入外源基因片段的重組質粒。
[0057]由于M13reverse，T7引物間長度大約180bp，所以擴增出來的片段比插入片段要大，結果如圖4和5所示,重組轉化效率很高，隨機各挑取若干測序。以通用M13reverse,T7為引物PCR篩選出擴增出片段長度合適的菌體，測序。獲得雞腿菇基因組DNA序列片段。在NCBI網(wǎng)上，將以上序列依次經(jīng)過blast確定它們是漆酶基因片段無誤。
[0058]引物設計是RACE能否成功的重要因素。根據(jù)已測序獲得的雞腿菇基因組DNA序列片段設計了用于擴增雞腿菇5’端序列的基因特異性引物:[0059]Laccase6GSPl:5，-GGACATTGATTGACACCAGTCGCGCCA-3，；[0060]5’ RACE 反應體系:2.5μ L5，RACE-ready cDNA、5y L UPM (10X )、1 μ L LaccaseGSPl >41.5 μ L Master Mix (34.5 μ L PCR_H20、I μ L50 X Advantage2polymerase Mix、5μ L10XAdvantage2PCR bufferU μ L50XdNTP Mix)。
[0061]PCR 程序:94°C預變性 5min ；94°C 30s,65°C 30s, 72°C 3min ；34cycles ；72°C 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0062]使用CLONTECH 公司的 SMARTTM RACE cDNA Amplification 試劑盒，以總 RNA 為原料合成的5’ -RACE ready cDNA為模版(方法同3’ -RACE ready cDNA)，用試劑盒自帶引物UPM和漆酶特異性引物Laccase6GSPl擴增，電泳檢測結果如圖6所示，漆酶基因5’ -RACE擴增后在500bp左右位置都出現(xiàn)一條特異性亮帶，擴增效果明顯，擴增產(chǎn)物使用TIANGEN的Universal DNA Purification Kit 純化后-20°C保存。
[0063]目的片段的回收純化、純化產(chǎn)物與PCR載體的連接、重組質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞、藍白斑篩選陽性克隆、測序，方法均同上。
[0064]漆酶5’ -RACE擴增、純化后的片段與PCR2.1Vector連接，轉化DH5 α，涂布含有IPTG和X-Gal的LBA平板，根據(jù)β-葡糖糖苷酶的α -互補原理，得到的白斑很有可能是插入外源基因片段的陽性克隆。因此每組隨機挑取10個白色菌落進行菌落PCR擴增，而后通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選擇條帶位置正確的送公司測序。獲得5’ -RACE序列片段序列如下:
[0065]CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG GGCTACTAATATTGTCTTACATACAACACAGGAGATTCTTCTGCATATACCTCGGGG GGAAAATCTACATTTTTTCCCAGGCTTGAAGAGAACATCGCACCGCCACCTCCTTT AAAACTTCTCCTTAAACCGAAAATAATGTCTCAAGCAGATGCATATTTAAACGCTG GTTCCGACACTCAACTTTAGACTCATCTTCTCTTATCATGACACTCACGACCTCCCG CTTGGGAATAACCAACTCTCTTTTTGTCGCTCTTTTGGGTGTGAACACCTACACTCT TGCTTCAGTCCTCATACCGCACTCGACTCTGACTCTCACGAATCAGTTGATTGCTCC CGATGGCTTCCAACGCTCTGCCATTGTGGTCAACGGCGAACATCCAGGACCACTGA TTCAGGCGACTAAGGGTGACGGATTTATGGTAAATGTGGTTAATCAACTCACAGAC CCTACCATGCAGAGGGCAGCGTCTGTACATTGGCATGGTTTTTTTCAACGAGGAA
[0066]序列中，波浪線線部分為基因特異性引物GSPI互補的堿基序列，斜體劃線部分為5’ -RACE模板最5’端的Long UP+Smart II oligo,陰影部分的ATG為漆酶lac6起始密碼子。將短片段序列翻譯成蛋白質，使用SignalP4.0server進行信號肽的分析，結果顯示5’-RACE擴增反應已經(jīng)到最5’端，包含有基因自身的信號肽，前28個氨基酸為信號肽序列。
[0067](5)漆酶cDNA全長的獲得
[0068]3’ -RACE Ready cDNA的合成，操作步驟:①在離心管中加入:提取的雞腿菇總RNAlu 1,3' -CDS primer I μ I, Smart II oligol μ I, Η202 μ I,將溶液混合均勻，微離心使溶液聚集在離心管底部。②70°C水浴2min。③冰上冷卻2min，微離心將溶液沉于離心管底部。④將以下物質加入該離心管中:5XFrist strand buffer2 μ I,DTT (20mM) I μ I, dNTPMix (IOmM) I μ I,PowerScript Reverse Transcriptasel μ I。⑤用槍將溶液混合均勻，微離心使溶液沉到離心管底部。⑥42°C保溫1.5h(非水浴)。⑦加入100 μ I的Tricine-EDTAbuffer ο⑧加熱72°C 7min，樣品保存在_20°C。
[0069]3’_RACE基因特異性引物(GSP2)的設計:根據(jù)已獲得的5'末端序列，使用引物設計軟件Primer Premier5.0,根據(jù)所需要的引物的退火溫度及引物長度設計出了最靠近5’端的基因特異性引物GSP2以獲得cDNA全長。
[0070]Laccase6GSP2:5’ -CTCACGACCTCCCGCTTGGGAATAACCAAC-3，；
[0071]3，-RACE 反應體系:2.5 μ L3，RACE-ready cDNA, 5 μ L UPM (10Χ ), I μ L LaccaseGSP2, 41.5 μ L Master Mix (34.5 μ L PCR_H20、I μ L50 X Advantage2polymerase Mix、5μ L10XAdvantage2PCR buffer、I μ L50XdNTP Mix)。
[0072]PCR 程序:94°C預變性 5min ；94°C 30s，65。。30s, 72°C 3min ；34cycles ；72°C 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0073]使用CLONTECH 公司的 SMARTTM RACE cDNA Amplification 試劑盒，以總 R NA 為原料合成的3’ -RACE ready cDNA為模版，用試劑盒自帶引物UPM和漆酶特異性引物GSP2擴增后，電泳檢測結果，如圖7所示，漆酶基因3’ -RACE擴增后在1500b p左右位置都出現(xiàn)一條特異性亮帶，擴增效果明顯，擴增產(chǎn)物使用TIANGEN的Univer sal DNA PurificationKit純化后-20°C保存。
[0074]漆酶3’ -RACE擴增、純化后的片段與PCR2.1Vector連接，轉化DH5 α，涂布含有IPTG和X-Gal的LBA平板，根據(jù)β-葡糖糖苷酶的α -互補原理，得到的白斑很有可能是插入外源基因片段的陽性克隆。因此每組隨機挑取10個白色菌落進行菌落PCR擴增，而后通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選擇條帶位置正確的送公司測序。
[0075]采用TIA NGEN的割膠純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物得到cDNA全長，將其連接到PC R載體上，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a，藍白斑篩選后選取白斑以T7、M13Reve rse為引物進行檢驗，選取擴出片段長度合適的菌落，擴大培養(yǎng)后測序，獲得全長序列2046bp，如SEQID N0.1所示，在NCBI網(wǎng)上，將以上序列依次經(jīng)過blast確定它們是漆酶基因片段無誤，命名為漆酶基因lac6，其表達蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0076]實施例2
[0077]本實施例使用的菌種、試劑、培養(yǎng)基如下:
[0078]酵母KM71H (Muts, Arg+)及表達載體 pPicz α B 的(Invitrogen)。PGEM-T EasyVector system I (Promega), Plasmid Miniprep Kit (B10MIGA), AxyPrep PCR Clean upKit(AXYGEN),EasySelectTM Pichia Expression Kit(Invitrogen),rTaqDNA Pl oymerase(TakaRa), Pfu DNA Ploymerase (Promega), T4DNA Ligase (Promega>In vitrogen), XbaI (promega), sac 11 (Takara ), Sac I (Fermentas ), Amp (氨節(jié)青霉素 SIGMA)、EtBr (溴化乙淀 AMERSC0)、dNTP (TakaRa, Promega)、Seakem LE agar ose (BMA),其余試劑均為常規(guī)使用試劑。
[0079]LBA固體培養(yǎng)基:除同LB培養(yǎng)基一樣加入蛋白胨、酵母浸汁、NaCl外每升培養(yǎng)基加入25g瓊脂，121°C下高溫高壓滅菌20min，當培養(yǎng)基冷卻至55°C加入Amp，使最終濃度達到100 μ g/mL，而后倒入培養(yǎng)皿制成平板。
[0080]LBZ (IL):10g Tryptone, 5g Yeast Extract, 5g NaCl,高溫高壓滅菌后冷卻到大約60°C,加入ImL ZeocinTM。若要做成平板,則在滅菌前加入15g Agar。
[0081]YPD (IL):10g Yeast Extract, 20g peptone,溶于 9OOmL 水，高溫高壓滅菌，加入IOOmL滅過菌的IOXD (20%的葡萄糖),若要做成平板,貝U在滅菌前加入15g Agar。
[0082]YPDS+ZeocinTM平板:10g Yeast Extract, 20g peptone, 182.2g Sorbitol, 20g Agar溶于900mL水,高溫高壓滅菌,加入IOOmL滅過菌的10XD(20%的葡萄糖),冷卻到大約60°C,加入lmLlOOmg/mL ZeocinTM,倒平板平板凝固后4°C保存。
[0083]BMGY:1Og Yeast Extract, 20g peptone 溶于 700mL 水，高溫高壓滅菌，冷卻到室溫后加入IOOmL pH=6的IM的磷酸鉀緩沖液(溫高壓滅菌)，IOOmLlOXYNB (濾膜滅菌)，2mL500XB(20mg biotin 溶于 IOOmL 的水，濾膜滅菌)，IOOmLlO X GY( IOOmL 甘油溶于 900mL
水高溫高壓滅菌)，混合均勻后4°C保存。
[0084]BMMY:1Og Yeast Extract, 20g peptone 溶于 700mL 水，高溫高壓滅菌，冷卻到室溫后加入，IOOmL pH=6的IM的磷酸鉀緩沖液(溫高壓滅菌)，IOOmLlOXYNB (濾膜滅菌)，2mL500XB (20mg biotin溶于IOOmL的水，濾膜滅菌)，IOOmLlOXM (5%的甲醇)，混合均勻后4 C保存
[0085]MM 平板(IL)(含 0.2mM Cu2+, 0.1mM ABTS):0.05gABTS,0.032gCuS04,15g Agar 溶于800mL水高溫高壓滅菌，冷卻到室溫后加入IOOmLlOXYNB (濾膜滅菌)，2mL500XB (20mgbiotin溶于IOOmL的水，濾膜滅菌)，IOOmLlOXM (5%的甲醇)
[0086]分離純化溶液:A液(20mM Tris-HCl，pH8.0):稱取Tris2.4228g，加蒸餾水至800mL，用HCl調節(jié)pH至8.0后定容至1L，4°C貯存。B液(含IM NaCl的Tris-HCl緩沖液，pH8.0):稱取Tris2.4228g、NaC158.44g，加蒸餾水至800mL，用HCl調節(jié)pH至8.0后定容至1L，4°C 貯存。
[0087]分子篩層析緩沖液配制:恥％?04-似2冊04131^€61':201111NaH2PO4, 20mM NaH2PO4,調pH 到 7.0。
[0088]SDS-PAGE試劑:聚·丙烯酰胺單雙體:(30:0.8)稱取30g Arc.0.8g Bis加50mL蒸餾水充分溶解后定容至100mL，4°C貯存。
[0089]5 X seperating buffer (pH8.8):22.69g Tris base0.125mL TEMED,0.5g SDS調P H至8.8，定容至100mL。
[0090]5 X stacking buffer (pH6.8):9.85g Tris base,0.125mL TEMED,0.5g SDS 調 pH至6.8，定容至IOOmL0
[0091]5 X sample buffer:0.98g Tris base, 2.0g SDS, 7.5mL 甘油，5mL β -疏基乙醇調pH至6.8，定容至IOOmL0
[0092]I X Running buffer (pH8.3Tris-Gly): 3.027g Tris base, 14.41g glycine, 1.0gSD S調pH至8.3，定容至1L。
[0093]5%過硫酸銨:稱取0.5g AP加水定容至10mL，分裝至1.5mL離心管中，_20°C貯存。
[0094]脫色液(Destainingsolution):甲醇 400mL,蒸懼水 500mL,冰醋酸 100mL。
[0095]一、表達載體的構建
[0096]( I)漆酶兩端酶切位點的設計
[0097]選用的是pPICZ α B，若使插入的漆酶基因閱讀框架正確，必須在漆酶基因上引入正確的限制性內切酶的酶切位點。經(jīng)過分析，要引入Xba I和sac II這兩個限制性內切酶的酶切位點，設計引物:
[0098]引入10個氨基酸序列為:TPFPPFNTNS ；
[0099]對應的核苷酸序列為:ACGCCATTCCCCCCTTTCAACACCAACTCT；
[0100]酶切位點XbaI:TCTAGA, sacll =CCGCGG ；[0101]Lac6gcDNAF:5’ -GCTCTAGATGACGCCATTCCCCCCTTTCAACACCAACTCTTCAGTCCTCATACCGCACTCG-3’ ；
[0102]Lac6gcDNAR:5，-GTCCCCGCGGAACTGGCATTGGTAAAGAAGAGACA-3，；
[0103]構建的Iac6+10AA的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0104](2)含有Xba I和sac II酶切位點的基因的獲得
[0105]以重組質粒為模板，以Lac6gcDNAF、Lac6gcDNAR為上下游引物，使用具有高保真性能的Pfu酶(反應體系:5 μ LlOXpfu buffer,4y L dNTP (2.5mM)，I μ L含漆酶基因的重組質粒，I U L Primer lacgcDNAF, I μ L Primer lacgcDNAR, 0.5 μ L pfu DNA po lymerase,37.5μ L PCR-H2O),以程序 D553 (94 °C 預變性 5min，94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 3min,30cycles，72°C lOmin)擴增引入酶切位點，擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖8所示，以設計的含有酶切位點的特異性引物擴增出來的Iac6+10AA條帶都符合要求。
[0106](3)雙酶切漆酶基因和質粒pPICZ α B
[0107]將PCR引入Xba I和sac II雙酶切位點的漆酶Iac6+10AA基因使用TIANGEN的產(chǎn)物純化回收試劑盒將PCR產(chǎn)物純化后，與質粒pPICZ α B分別用Xba I和sac II雙酶切(雙酶切反應體系:4 μ LlOXbuffer C，0.4 μ L0.1%BSA, 2 μ L Xba I, I μ L sac II，15μ L 目的基因，17.6μ L PCR-H2O, 37 °C酶切3h繼續(xù)后續(xù)試驗)。將雙酶切后的Iac6+10AA基因片段及表達載體pPICZ α B使用TIANGEN的PCR clean up Kit純化回收酶切后產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切前后，結果正確。
[0108](4)漆酶基因與pPICZ α B的連接
[0109]將雙酶切后的漆酶Iac6+10AA基因分別和表達載體pPICZaB片段連接(連接體系:6 μ L雙酶切后的漆酶基因片段，2 μ L雙酶切后的pPICZ a B，I μ LlOX ligationbuffer, I μ L T4DNA ligase)后，4°C過夜。
[0110](5)連接產(chǎn)物的轉化、篩選及測序
[0111]將連接好的漆酶重組質粒pPICZ a B-10AA-lac6轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 α后涂布LBZ平板，37 °C培養(yǎng)箱過夜后，從板上挑取1-10個單菌落以3’ A0X，5’ AOX為引物(5，AOX:5，-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，；3，AOX:5，-GGCAAATGGCATTC TGACAT-3，)，D553PCR擴增，篩選擴增產(chǎn)物長度合適的菌落劃線保種，同時選取1-2個測序。電泳結果如圖9所示,重組質粒測序結果經(jīng)expasy翻譯成相應蛋白的氨基酸序列,5’部分加入了十個氨基酸，3’部分有myc標記，序列最后是6個組氨酸，且完全翻譯通順，表明重組質粒構建成功。
[0112]二、重組質粒電轉化入Pichia pastoris
[0113](I)堿法提質粒
[0114]溶液的配制:SolutionI:25mM Tris HCl (pH8.0), IOmM EDTA, 50mM Glucos e。Solution II:0.2N NaOH，1%SDS，在使用之前混合 0.4NNaOH 和 2%SDS。Soluti on III(3M K+、5M acetate):29.4g potassium acetate+、11.5mL glacial acetic acid,定容至IjIOOmL,不能加熱滅菌，室溫保存。Lysozyme (10mg/mL)
[0115]操作步驟:I)接種含漆酶Iac6+10AA基因的DH5 α于LBZ液體培養(yǎng)基，取0.5_lmL培養(yǎng)過夜的產(chǎn)物于IO O mL新鮮的培養(yǎng)基，3 7 °C，2 O O r P m搖床培養(yǎng)直至菌體飽和(培養(yǎng)約20h);2)用 50mL 離心管 5000rpm, IOmin 離心菌體；3)加 2mL Solution I 和 IOOul Lysozyme(lOmg/mL)混合均勻，室溫放置5min ;4)加4mL Solution II，輕輕振蕩直至溶液變澄清，冰上放置 5min ;5)加 3mL Solution III,輕輕振蕩，室溫放置 5min ;6) 1000Orpm 離心 IOmin ；7)將上清液轉移到一個干凈的50mL離心管中；8)加入等體積異丙醇混合均勻，_20°C放置IOmin 或更長；9)12000rpm 離心 30min,去上清，風干沉淀;10)加 ImL 的 TE buffer(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉入1.5mL的離心管中；11)加入RNaseIOul，37°C水浴30min ;12)酚仿抽提質粒:加入1/2體積苯酹、1/2體積氯仿放lOmin, 13000rpm離心IOmin取上清；13)加入等體積氯仿放lOmin, 13000rpm離心IOmin,取上清；14)加入1/10體積3M的醋酸鈉,2倍體積的100%的乙醇冰上放置5min ；15)4°C 12000rpm離心lOmin，棄上清，沉淀用75%的乙醇洗；16)離心風干后加入70 μ I PCR-H20，取出2 μ I跑電泳，并測Α260計算DNA濃度。
[0116]利用質粒的堿法大量提取重組質粒，結果見圖10。
[0117](2)質粒線性化:用SacI單酶切質粒,使質粒線性化。SacI的酶切反應體系:10yL含有漆酶130+1(^4基因的？？102 0 8，5 4 1^0父131^作『SacI, 3.5μ L SacI限制性內切酶，31.5yL PCR-H2O0 37°C酶切Ih后，檢測酶切質量符合使用要求。
[0118](3)質粒電轉化酵母感受態(tài)細胞，步驟:1)取8(^1^制備好的感受態(tài)細胞和5-101^線性化的質粒DNA (溶于5-10 μ L PCR-H2O),混合均勻，將他們轉入冰冷的0.2cm的電轉化杯中；2)電轉化杯和線性化的質粒DNA在冰上放置5min ；3)脈沖細胞；4)迅速將ImL冰冷的IM山梨醇加入電轉化杯，將電轉化杯中的菌體混合均勻后，轉入1.5mL的離心管中；5)將離心管在30°C保溫l_2h，不要振蕩；6)涂板YPDS+ZeocinT M ；7) 30°C培養(yǎng)2-3天，至單菌落形成；8)挑10-30個單菌落，在新鮮的YPDS+Zeoc inTM劃線。
[0119]三、具有漆酶活性的陽性克隆的篩選
[0120]平板法篩選有生物活性的菌株:從YPDSZ平板中用牙簽挑取陽性克隆單菌落，點樣與含有Cu2+和ABTS的MM平板上后放置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天添加100 μ L100%的甲醇于培養(yǎng)皿的蓋子上誘導其產(chǎn)酶表達，每天觀察其顏色變化。如果看到在單菌落周圍出現(xiàn)特征性的墨綠色暈圈，證明有表達并且有活性。平板檢測結果如圖11所示，Iac6+10AA有表達。
[0121]搖瓶培養(yǎng)法鑒定重組菌株是否表達:①把重組酵母于3mL YPD+3 μ I Zeocin試管中28°C搖床培養(yǎng)；②按1%接種量將試管中菌液，接種于裝有50mLBMGY培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C 250rpm搖床培養(yǎng)至0D6QQ=30 1500_3000g室溫離心5min收集菌體，棄上清；④用BMMY重懸菌體，濃縮到原體積的2/5 (20mL);⑤將重懸的菌體放入250mL的三角瓶中，每瓶加入Cu2+至終濃度為500 μ M250rpm, 25°C培養(yǎng)；⑥每24小時添加一次100%的甲醇，至終濃度為1% ;⑦每24小時取樣0.2mL, 5000rpm離心取上清。共取樣15天；⑧按照ABTS法檢測上清液酶活，作生長曲線圖。
[0122]結果如圖12所示，使用搖瓶培養(yǎng)法的結果與MM顯色平板結果一致，Iac6+10AA有表達。
[0123]四、不同濃度銅離子對重組漆酶誘導的影響
[0124]影響重組漆酶在畢赤酵母中表達水平的因素有很多，因為銅離子是漆酶的結構組成部分，研究不同濃度銅離子對重組漆酶誘導的影響。培養(yǎng)重組漆酶Iac6+10AA，轉接入BMMY中時以不加銅離子的作為空白對照，分別設100 μ Μ、200 μ Μ、300 μ Μ、400 μ Μ、500 μ Μ、600 μ Μ6個濃度梯度，每個濃度3瓶平行樣，起始細胞濃度0D600為30，25 °C 250rpm搖床培養(yǎng)，每24h取樣并添加甲醇至終濃度為1%，離心取上清測酶活。
[0125]不同銅離子濃度對Iac6+10AA誘導產(chǎn)酶的影響如圖13所示，加入不同濃度Cu2+與未加Cu2+的培養(yǎng)基相比，酶活都有較大程度的提高，并且不同的Cu2+濃度對漆酶產(chǎn)酶的影響也不同。本實施例1曰06+1(^4培養(yǎng)效果最好的是在誘導表達時加入60(^1 Cu2+。
[0126]五、重組漆酶的分離純化
[0127]粗酶液的處理:經(jīng)BMMY誘導表達培養(yǎng)7d后的酶液，4°C 5000rpm離心IOmin取上清酶液，經(jīng)抽濾、超濾濃縮用20mM Tris-HCl (pH8.0)透析后準備過陰離子柱，每步都檢測
酶活及蛋白含量。
[0128]DEAE-SepharoseTMCL_6B的分離純化過程:處理后的粗酶液進行DEAE-SephroseTMCL-6B離子交換柱層析，采用平衡液A相:20mM Tris-HCl buffer (pH8.0);洗脫緩沖液B 相:含 IM NaCl 的 20mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.0)。上樣流速:0.5mL/min，洗脫速度:
0.5mL/min。洗脫方式:B相0-1.0M NaCl線性洗脫；分管收集洗脫液，每IOmin收集一管，檢測漆酶活性，得到有漆酶活性的收集液。
[0129]Sephadex G-75分子篩層析:將DEAE離子交換柱層析后收集到的有漆酶活性的收集液裝入透析袋中，4°C輕微攪拌透析24h (透析液:20mmol/L NaH2PO4-Na2HP04buf fer,PH7.0)，其間換3-4次緩沖液。經(jīng)透析的酶液的鹽離子濃度得到調節(jié)。處理后的酶液進行Sephadex G-75 分子篩層析,洗脫緩沖液(20mmol/L NaH2PO4-Na2HP04buffer, ρΗ7.0)。上樣流速:0.5mL/min，洗脫速度:0.5mL/min。每4min收集一管，檢測漆酶活性，得到有漆酶活性的收集液。再把層析了的酶液4°C輕微攪拌透析24h (透析液:P取.0，磷酸鹽緩沖液)，放入-20°C保存。
[0130]蛋白質含量的測定:測定酶液的蛋白質含量采用BCA Protein Assay Kit。先以不同濃度的牛血清白蛋白與工作液反應制作標準曲線。按照標準曲線的制作方法讓酶液與工作液反應，測得吸光度值，在標準曲線上找出該吸光度值所對應的蛋白質濃度。
[0131]BCA蛋白分析試劑盒中標準曲線的制作:配制一系列濃度的牛血清白蛋白標準溶液，O μ g/mL,25 μ g/mL,125 μ g/mL,250 μ g/mL,500 μ g/mL,750 μ g/mL,1000 μ g/mL,1500 μ g/mL, 2000 μ g/mL,取25 μ I每種標準蛋白，加入試劑盒中A試劑和B試劑配成的工作液，混合均勻后37°C保溫30min后冷卻至室溫測562nm的吸光度值。以測得的吸光度值為縱坐標,蛋白濃度為橫坐標制作標準曲線:y=0.0012χο
[0132]六、分離純化效果的檢測
[0133]SDS-PAGE電泳檢測純化效果，步驟如下:
[0134]I)分離膠的配制(兩塊膠的量`):4.0mL Acer-Bis (30:0.8),2.4mL5X Separatingbuffer, 5.4mL Distilled water, 4 μ L TEMED, 120 μ L AP。將分離膠溶液依次混合后(最后加入AP)，迅速將膠液注入凝膠模具中，達到所需高度后，在膠面上輕輕注入一層l-5mm的蒸餾水，然后靜置20-60分鐘等待凝膠聚合。
[0135]2)濃縮膠的配制(兩塊膠的量):1.25mL Acer-Bis (30:0.8),2.0mL5XStackingb uffer, 6.6mL Distilled water, 4 μ L TEMED, 120 μ L AP。待分離膠聚合后，先除去分離膠上的水層，再將濃縮膠溶液迅速穩(wěn)定地注入分離膠上直至頂部。小心的在頂端傾斜插入梳子，待其齒底到達玻璃板頂部時，壓平梳子，注意應避免齒端留有氣泡，靜置30分鐘等待凝膠聚合，然后小心取出梳子，不要撕裂加樣孔。[0136]3)樣品的處理:樣品和樣品緩沖液的比為4:1，本實驗取40 μ I樣品和10 μ 15倍的樣品緩沖液(含SDS)混合均勻。100°C煮lOmin。短暫離心使管壁上的冷凝水沉降到管底。
[0137]4)加樣:將凝膠放入電泳槽內，加入電泳緩沖液，使凝膠兩端浸泡在緩沖液中，接好電極，上樣。用微量注射器吸取40 μ I酶液，小心伸入加樣孔底部，穩(wěn)定的將樣品加成一窄帶?？湛字袘尤霕悠肪彌_液，以防止邊緣效應。
[0138]5)電泳:加樣完畢后，在電泳槽兩極加上電壓，在樣品進入分離膠前電壓為100V，進入分離膠后，將電壓增大到200V，到藍色的前沿走到分離膠底部時，停止電泳。
[0139]6)染色與脫色:取出凝膠，準備用考馬斯亮藍染色約4個小時，再用脫色液每5小時脫色一次。膠上會出現(xiàn)明顯而清晰的藍色條帶，照相記錄。
[0140]酶液經(jīng)分離純化后SDS-PAGE檢測，結果見圖14，純化后的Lac6+10AA分子量為75kDa，純酶用去糖基化酶處理后分子量為55kDa。
[0141]七、漆酶活力的測定
[0142]I) ABTS 法:1mL 反應混合液中，含 100yLlmmol/L (終濃度)ABTS，800 μ L0.1moI/L NaAc-HAc緩沖液(pH4.5),IOOyL酶液，在40°C以Imin內催化氧化I μ mo I ABTS的酶量為I個酶活單位(IU)。在420nm處測定Imin內的OD變化值。已知420nm處ABTS的摩爾消光系數(shù)為 ε 420=3.6X104^.cnT1。
[0143]酶活(IU/mL)=OD420/ (3.6X 104XV/106) (V 為酶液體積)
[0144]2)愈創(chuàng)木酚法:將酶液在4°C，10000r/min離心20min后取上清液0.lmL，加入
.0.3mL蒸懼水和2mL50mmol/mL (含lmmol/L愈創(chuàng)木酹)的琥拍酸緩沖液(pH5.0),混合均勻后置于37°C水浴30min，冰浴終止反應，在465nm處測其吸光值。酶活單位定義為每分鐘氧化1 μ mo l愈創(chuàng)木酹的酶量為一個酶活單位。
[0145]酶活(IU/mL)=2.4XOD465/ ( 12100X30XV/106) (V 為酶液體積)
[0146]3) 丁香醛連氮法:lmL反應混合液中，含100μ Llmmol/L (終濃度)丁香醛連氮，800 μ L0.lmol/L NaAc-HAc 緩沖液(pH4.5)，100 μ L 酶液，在 40°C 以 Imin 內催化氧化1 μ mol 丁香醛連氮的酶量為I個酶活單位(IU)。在525nm處測定Imin內的OD變化值。已知525nm處丁香醛連氮的摩爾消光系數(shù)為ε 525=6.5Χ105Μ' cnT1。
[0147]酶活(IU/mL)=OD525/ (6.5X 105XV/106) (V 為酶液體積)
[0148]4) 2，6-二甲基苯酚法:ImL反應混合液中，含100 μ Llmmol/L (終濃度)2，6_ 二甲基苯酚，800 μ L0.lmol/L NaAc-HAc 緩沖液(ρΗ4.5)，100 μ L 酶液，在 40°C 以 Imin 內催化氧化1μmο12，6-二甲基苯酚的酶量為I個酶活單位(IU)。在421nm處測定Imin內的OD變化值。已知421nm處2，6-二甲基苯酚的摩爾消光系數(shù)為ε 421=5.78X 104M—1.cnT1。
[0149]酶活(IU/mL)=OD421/ (5.78X 104XV/106) (V 為酶液體積)
[0150]八、重組雞腿菇漆酶酶學特性的分析
[0151]1)重組雞腿菇漆酶的最適溫度:為考察純化后的重組雞腿菇漆酶在不同介體及不同溫度下的反應活力，獲得最佳反應溫度，設計了不同的反應溫度，為20°C -90°C，梯度為5°C，介體分別為ABTS、愈創(chuàng)木酚、丁香醛連氮以及2，6- 二甲氧基苯酚。按照上述方法于不同溫度下檢測漆酶活力。以酶活最高者為100%。結果如圖15所示，Lac6+10AA對應ABTS，愈創(chuàng)木酚，丁香醛連氮，2，6- 二甲氧基苯酚各底物的最適溫度分別是65°C，50°C，60°C，60°C。[0152]純化后的漆酶Lac6+10AA 在 30°C _70°C 范圍內保溫 15min、30min、45min、60min后，以ABTS為底物檢測不同溫度保溫不同時間下的漆酶活性。以4°C保存未保溫的酶活為100%，結果見圖16，純化后的漆酶Lac6+10AA在30°C保溫后對酶活有促進作用，在40°C、50°C保溫一個小時，剩余酶活在80%以上，在50°C保溫一小時剩余酶活在60%以上，而在60°C下剩3.3% ；Lac6+10AA在70°C下保溫15min基本失活。結果顯示，漆酶Lac6+10AA在30 V -50 V間有較好的熱穩(wěn)定性。
[0153]2)重組雞腿菇漆酶的最適pH:為考察純化后的重組雞腿菇漆酶在不同介體及不同pH下的反應活力，獲得最佳反應pH，配置pH為1.0-12.0的廣泛緩沖液，梯度為0.5，介體分別為ABTS、愈創(chuàng)木酚、丁香醛連氮以及2，6-二甲氧基苯酚。按照上述方法在不同pH緩沖液下測定漆酶 活力。以酶活最高者為100%。結果見圖17，Lac6+10AA對應ABTS，愈創(chuàng)木酚，丁香醛連氮，2，6- 二甲氧基苯酚各底物的最適pH分別是3，5，5.5，5。
[0154]純化后的漆酶Lac6+10AA在pHl-12的條件下4°C放置24小時后測酶活，以最高酶活為100%。結果見圖18，顯示Lac6+10AA在pH3_10之間有較好的穩(wěn)定性，剩余酶活達80%以上。
[0155]參照上述方法，本實施例將克隆的漆酶基因與pPICZ α B載體直接相連，但lac6沒有表達。
[0156]實施例3重組雞腿菇漆酶對染料的脫色
[0157]酶液的制備:三角瓶培養(yǎng)克隆的重組漆酶Lac6+10AA，在25°C、500MCu2+每24h加1%甲醇誘導表達，培養(yǎng)10天后收集酶液，抽濾、超濾濃縮后-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0158](I)不同時間下重組雞腿菇漆酶對染料的脫色
[0159]2mL脫色體系中，染料終濃度50mg/L，0.lmol/L NaAc-HAc緩沖液，給酶量0.5IU/mL，HBT的終濃度O或0.lg/L，pH4.5，溫度40°C，分別在時間為1、2、3、4、12h時，測定各反應液在相應染料最大吸收波長處的吸光值(A1),同時以滅活酶液作為對照，同樣方法測得其吸光值A。，脫色率為R= (A0-A1) /A0X 100%0
[0160]如圖19和20所示，重組雞腿菇漆酶Lac6+10AA對染料的脫色率是隨著反應時間的增加而增加的，脫色率的增加主要在l_3h內，隨后增加漸緩，到12h時絕大多數(shù)染料脫色率達最大。重組漆酶對orange G, Crystal Violet,和Malachite green的脫色率分別為44.6%, 54.8%, 87.2%。
[0161](2)純酶與粗酶對三類染料脫色作用的對比
[0162]2mL脫色體系中，染料終濃度50mg/L，0.lmol/L NaAc-HAc緩沖液，給酶量(0.5IU/mL)、有介質(0.lg/L)與無介質的反應條件中，pH4.5,溫度40°C,時間為12h,測定各反應液在相應染料最大吸收波長處的吸光值(A1),同時以滅活酶液作為對照，同樣方法測得其吸光值 A。，脫色率為 R= (A0-A1) /A0X 100%0
[0163]如圖21-23所示，在無介體的情況下，Lac6+10AA粗酶對三苯基甲烷類染料脫色效果最佳，其次是蒽醌類染料，對偶氮類染料脫色相對較差。Lac6+10AA粗酶在加入HBT后，所有染料的脫色率均增加，且增加最多的是偶氮類染料中的反應艷紅X-3B，增加了 30%。雷瑪唑亮藍、活性艷藍X-BR、活性艷藍K-GR和活性艷藍K-3R(蒽醌類染料)的脫色率分別由32%、
9.39%,26.76%,43.75% 增加到 46.25%,20.34%,36.46%,48.73%。活性橙、反應艷紅 X-3B、剛果紅和活性深藍K-R (偶氮類染料)的脫色率分別由4.4%、4.55%、19.14%,72.32%增加到6.51%,34.78%,29.52%,77.85%。孔雀石綠、考馬斯亮藍G-250、甲基紫、溴酚藍和維多利亞藍B (三苯甲烷類染料)的脫色率分別由70.3%、16.04%、16.49%、22.67%、19.03%加到83.6%、20.64%,42.24%,31.28%,31.41%。
[0164]Lac6+10AA純酶對三苯基甲烷類染料脫色最佳，其次是蒽醌類染料，對偶氮類染料脫色效果較差。加入介體HBT后，脫色效果明顯增加。Lac6+10AA純酶在加入HBT后，所有染料的脫色率均增加，且增加最多的是偶氮類類染料，其次是三苯基甲烷類染料，蒽醌類染料增加較小。雷瑪唑亮藍、活性艷藍X-BR、活性艷藍K-GR和活性艷藍K-3R (蒽醌類染料)的脫色率分別由 80.98%,41.71%,67.93%,83.65% 增加到 95.34%、75.5%,80.24%,89.04%?；钚猿?、反應艷紅X-3B、剛果紅和活性深藍K-R (偶氮類染料)的脫色率分別由8.6%、7.15%、32.25%,85.49% 增加到 58.4%,87.16%,65.15%,91.7%。孔雀石綠、考馬斯亮藍 G-250、甲基紫、溴酚藍和維多利亞藍B (三苯甲烷類染料)的脫色率分別由89.73%,32.97%,47.1%、57.24%,34.52% 加到 96.33%,62.48%,78.97%,75.48%,61.8%。
[0165]總之，純酶的脫色效果比粗酶好，可能是粗酶液有底色，對吸光值的測定有影響，而且粗酶液中含有各種雜質對酶的脫色作用可能也有一定的影響。加入介質HBT后脫色效果明顯增強，Lac6+10AA純酶加入HBT后對13種染料的脫色中，3個達90%以上，6個達70%以上，除了活性橙I其 余脫色率都在60%以上。
【權利要求】
1.一種漆酶基因Lac6，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權利要求1所述漆酶基因的表達蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.—種權利要求2所述漆酶基因的表達蛋白的表達方法，其特征在于:在所述的SEQID N0.2所示氨基酸序列上添加有10個氨基酸序列組成的表達標簽，所述的氨基酸序列為TPFPPFNTNS ;所表達的蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。
4.權利要求1所述的漆酶·基因Lac6在對染料脫色中的應用。
【文檔編號】C12N15/53GK103710363SQ201310689485
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權日:2013年12月16日
【發(fā)明者】丁少軍, 顧春娟, 王燕 申請人:南京林業(yè)大學