一種乙型肝炎病毒（hbv）核酸定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)臨床診斷領(lǐng)域中的乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量檢測(cè)試劑盒，試劑盒包括磁珠法核酸提取試劑盒和HBV核酸擴(kuò)增試劑盒，其中磁珠法核酸提取試劑盒包括裂解結(jié)合液、漂洗液、洗脫液、磁珠液；HBV核酸擴(kuò)增試劑盒包括HBV-PCR反應(yīng)液、酶混合液、HBV-內(nèi)標(biāo)、HBV定量參考品1-4、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品。該發(fā)明操作簡便快速、成本低廉、檢測(cè)靈敏度高、重復(fù)性好、引物和探針保守性高、特異性強(qiáng)、覆蓋乙型肝炎病毒不同的亞型或變種、有利于提高乙肝檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性、引入高效的內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)、解決靶基因和內(nèi)標(biāo)同時(shí)擴(kuò)增而導(dǎo)致的相互抑制和干擾等問題、能夠高效的監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增整個(gè)過程、避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
【專利說明】—種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)臨床診斷領(lǐng)域中的一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎仍是全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，全球前10位疾病的死因，乙肝占第七位。據(jù)世界衛(wèi)生組織的資料表明，全世界約30%的人口，即20億人有感染乙型肝炎病毒的血清學(xué)證據(jù)，其中3.5億人為慢性感染，每年至少有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌。而中國是世界公認(rèn)的乙型肝炎大國，我國的乙肝病毒攜帶者達(dá)一億二千萬人，慢性乙肝肝炎患者有二千萬，每年因此死亡的人數(shù)近50萬。對(duì)于乙肝病毒的預(yù)防和診療是國家傳染病控制的頭等大事。
[0003]HBV酶聯(lián)免疫試劑是目前診斷乙肝的主要手段。乙肝“兩對(duì)半”酶聯(lián)免疫試劑目前已經(jīng)普遍用于臨床，急診，血液篩查等各個(gè)領(lǐng)域。但是，酶聯(lián)免疫方法作為一種間接滯后的檢測(cè)方法，他所檢測(cè)的目標(biāo)是人體內(nèi)產(chǎn)生的抗體而不是病原體本身。因此，雖然酶聯(lián)免疫方法經(jīng)過幾代的改良和進(jìn)化，在靈敏度、特異性、精確度和穩(wěn)定性等方面有了巨大的提高。但是任然不能消除對(duì)“窗口期”標(biāo)本的漏檢。所謂“窗口期”，是指從感染病原體開始，直至用酶聯(lián)免疫學(xué)檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到該病原體存在為止的這一段時(shí)間。乙肝的“窗口期”比較長，大約為59天，因此，HBV酶聯(lián)免疫試劑容易造成漏檢，不利于乙肝的早期診斷。近年來核酸分子檢測(cè)技術(shù)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)和臨床研究中顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，相比較免疫診斷技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、診斷快速等優(yōu)點(diǎn)。血清中的HBV DNA是病毒復(fù)制和肝炎進(jìn)程的確切標(biāo)志，所以血清中HBV DNA的檢測(cè)，已成為診斷乙肝的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。近幾年來，通過熒光定量PCR方法直接檢測(cè)HBV DNA已經(jīng)成為一種通用乙肝醫(yī)學(xué)檢測(cè)方法，大大提高了乙肝的檢測(cè)準(zhǔn)確性，有利于疾病的早期診斷，可將“窗口期”大大的縮短。目前，乙肝熒光定量PCR檢測(cè)目前已經(jīng)是通過國家認(rèn)證臨床PCR實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目之一。乙肝熒光定量PCR檢測(cè)在乙肝病人的康復(fù)治療過程中具有用藥指導(dǎo)意義，同時(shí)，乙肝病毒載量的精確判讀，也為患者提供了準(zhǔn)確的康復(fù)治療方案。
[0004]目前，國內(nèi)已有多種基于熒光定量PCR技術(shù)的乙肝定量檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于臨床檢測(cè)中，這些試劑盒所提供的乙肝核酸提取方法主要是糖元沉淀法和離心柱法。該類試劑盒具有一定的優(yōu)點(diǎn)，但是，存在很多不足之處。如糖元沉淀法雖然操作比較簡單，但是無法有效去除復(fù)雜樣本(如高血脂、高膽紅素，溶血等樣本)中的PCR擴(kuò)增抑制物，容易導(dǎo)致出現(xiàn)檢測(cè)假陰性，導(dǎo)致樣本的漏檢。離心柱法雖然無需高速離心，但是需頻繁更換離心管，用時(shí)長，操作繁瑣，容易導(dǎo)致核酸“氣溶膠”污染。因此，研究開發(fā)一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒是目前急待解決的新課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，該發(fā)明從根本上解決現(xiàn)有乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量PCR技術(shù)存在的靈敏度低、準(zhǔn)確性差等問題，其設(shè)計(jì)的TaqMan熒光探針具有靈敏度高，特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，核酸DNA提取方法簡單，核酸純度高，成本較低，特別適用于乙型肝炎病毒(HBV)精確的定量檢測(cè)。
[0006] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，試劑盒包括磁珠法核酸提取試劑盒和HBV核酸擴(kuò)增試劑盒，其中磁珠法核酸提取試劑盒包括裂解結(jié)合液、漂洗液、洗脫液、磁珠液；HBV核酸擴(kuò)增試劑盒包括HBV-PCR反應(yīng)液、酶混合液、HBV-內(nèi)標(biāo)、HBV定量參考品1-4、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品；所述磁珠法核酸提取試劑盒中裂解結(jié)合液組成為含有十二烷基硫酸鈉0.5-2.5%，TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，異硫氰酸胍 2-6.0moI/L, 1-lOmM/L EDTA (PH7.5);所述磁珠法核酸提取試劑盒中漂洗液組成為含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，氯化鈉0.1-0.3mol/L,60-80%乙醇；所述磁珠法核酸提取試劑盒中洗脫液組成為含有l(wèi)Ommol/L Tris.HCl(PH8.3),0.01-0.05%Prolin300 ;所述磁珠法核酸提取試劑盒中磁珠液組成為直徑為I μ m的氧化硅超順納米磁珠，濃度為10-40mg/ml ;所述HBV核酸擴(kuò)增試劑盒中HBV-PCR反應(yīng)液包括用于檢測(cè)靶基因和內(nèi)標(biāo)的探針、用于擴(kuò)增靶基因和內(nèi)標(biāo)的上游引物以及下游引物、PCR緩沖液；HBV核酸擴(kuò)增試劑盒中用于檢測(cè)靶基因的探針序列為:5’ -CCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTC-’3 (SEQ ID N0:l)，5，端標(biāo)記為FAM熒光發(fā)生基團(tuán)，3’端標(biāo)記為BHQl熒光淬滅基團(tuán)；用于內(nèi)標(biāo)檢測(cè)的探針序列為:5’-CAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGC-’3 (SEQ IDN0:2)，5’端標(biāo)記為HEX熒光發(fā)生基團(tuán)，3’端標(biāo)記為BHQl熒光淬滅基團(tuán)；用于擴(kuò)增靶基因的上游引物序列為:5’-CGCACCTCTCTTTACGCGGTC-’3 (SEQ ID N0:3);用于擴(kuò)增靶基因的下游引物序列為:5’-CGTTCACGGTGGTTTCCATGC-’3 (SEQ ID N0:4);用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的上游引物序列為:5’-TTCGATCTCCGTCGAACCTTG-’3 (SEQ ID N0:5);用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的下游引物序列為:5’-TTCTCAGGACTCCAGTCGCTG-’3 (SEQ ID N0:6);所述HBV核酸擴(kuò)增試劑盒中用于檢測(cè)靶基因的探針使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選靶基因探針使用濃度為Spmol ;所述用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選內(nèi)標(biāo)探針使用濃度為Spmol ;所述用于檢測(cè)靶基因的上下游引物使用濃度為10-30pmol，優(yōu)選靶基因的上下游引物使用濃度為20pmol ;所述用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選內(nèi)標(biāo)引物使用濃度為Spmol ;所述HBV核酸擴(kuò)增試劑盒中 PCR 緩沖液組成為 30mmol/L Tris-HCl (PH8.3), 10mmol/L (NH4)2S04, 30mmol/LKCl,4.5mmol/LMgCl2,0.15mmol/L dNTPs ;所述HBV核酸擴(kuò)增試劑盒中酶混合液包括熱啟動(dòng)Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG);其中熱啟動(dòng)Taq酶的用量為3_8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量為0.05-0.2U/人份；所述試劑盒中HBV-內(nèi)標(biāo)是將序列5’ -TTCGATCTCCGTCGAACCTTGCACTCTGCATCCTGGACTCATGCTGACTGCAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGCTCTACTGCACTCCTGCGTCATCACGCGACTGGAGTCCTGAGAA-’3 (SEQ ID NO:7)插入到pUC18T載體而構(gòu)成的重組體；HBV內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒使用濃度為100-500COpieS/次，優(yōu)選使用濃度為200cOpieS/次；所述試劑盒中陰性質(zhì)控品為滅活陰性人源血漿，HBV定量參考品1-4，臨界陽性質(zhì)控品和強(qiáng)陽性質(zhì)控品均由HBV病毒血清樣本稀釋而成；濃度分別為 5.0xlO5, 5.0xlO4，5.0xlO3, 5.0xlO2，1.0xlO2，1.0xlO5IU/ml, HBV病毒血清為滅活病毒血清樣本；所述試劑盒需要進(jìn)行PCR反應(yīng)，其擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間為:50°C 2min, I個(gè)循環(huán)；95°C 3min, I個(gè)循環(huán)；最后94°C 10s，60°C 30s, 42個(gè)循環(huán)采集熒光信號(hào)；所述試劑盒檢測(cè)樣本類型為血清和血漿；試劑盒的檢測(cè)靈敏度為10IU/ml，檢測(cè)線性范圍為30-30xl08IU/ml。[0007]本發(fā)明的要點(diǎn)在于一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，其基本原理是:首先采用納米磁珠法提取血清、血漿樣品中HBV DNA作為擴(kuò)增模板，然后應(yīng)用TaqMan熒光探針技術(shù)完成對(duì)該模板實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過程。同時(shí)擴(kuò)增體系中引入了高效的內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，通過檢測(cè)內(nèi)標(biāo)是否正常來監(jiān)測(cè)待測(cè)樣本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假陰性。其中，通過應(yīng)用專業(yè)生物信息學(xué)軟件，分析比較了 HBV基因序列，設(shè)計(jì)了高保守性、特異性和高效性的TaqMan熒光探針和引物以及內(nèi)標(biāo)的探針和引物。所述靶基因和內(nèi)標(biāo)探針分別標(biāo)記FAM和HEX熒光報(bào)告基團(tuán)；所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物在70-130個(gè)堿基對(duì)范圍。
[0008]本發(fā)明試劑盒采用吸附效果好、易于純化的磁珠法提取血清、血漿樣品中乙肝病毒核酸作為模板，應(yīng)用TaqMan熒光探針技術(shù)完成對(duì)該模板熒光定量PCR檢測(cè)過程。同時(shí)在反應(yīng)體系中添加了高效的內(nèi)標(biāo)，通過檢測(cè)內(nèi)標(biāo)是否正常來監(jiān)測(cè)待測(cè)樣本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假陰性的存在。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0010]1、引物和探針保守性高、特異性強(qiáng)、可以覆蓋乙型肝炎病毒不同的亞型或變種，有利于提高乙肝檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性。
[0011]2、檢測(cè)靈敏度高，重復(fù)性好。本發(fā)明使用自主開發(fā)的磁珠法核酸提取技術(shù)，能夠從樣品中獲得高純度乙型肝炎病毒(HBV)核酸，消除提取物對(duì)PCR反應(yīng)的干擾，加大了檢測(cè)樣本量，提高了檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性。
[0012]3、引入了高效的內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，解決了靶基因和內(nèi)標(biāo)同時(shí)擴(kuò)增而導(dǎo)致的相互抑制和干擾等問題，能夠高效的監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增整個(gè)過程，避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
[0013]4、本發(fā)明操作簡便、快速、成本低廉，并且易于開發(fā)為自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)，以便對(duì)大量樣品的進(jìn)行高通量篩檢。所檢測(cè)的樣品中包括人源或動(dòng)物源的血液、精液、唾液。適合常規(guī)血液樣品的檢測(cè)，也適合自動(dòng)化和高通量檢測(cè)。
[0014]一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有操作簡便快速、成本低廉、檢測(cè)靈敏度高、重復(fù)性好、引物和探針保守性高、特異性強(qiáng)、覆蓋乙型肝炎病毒不同的亞型或變種、有利于提高乙肝檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性、引入高效的內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)、解決靶基因和內(nèi)標(biāo)同時(shí)擴(kuò)增而導(dǎo)致的相互抑制和干擾等問題、能夠高效的監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增整個(gè)過程、避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，將廣泛的應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)臨床診斷領(lǐng)域中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0016]圖1是本發(fā)明檢測(cè)中檢所HBV國家標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)濃度和其理論濃度的擬合曲線圖。
[0017]圖2是本發(fā)明對(duì)四種濃度HBV陽性血清樣本的重復(fù)性測(cè)試檢測(cè)結(jié)果圖。
[0018]圖3是本發(fā)明對(duì)10IU/ml靈敏度血清樣本的重復(fù)測(cè)試檢測(cè)結(jié)果圖。
[0019]圖4是本發(fā)明檢測(cè)中檢所HBV國家標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0020]圖5是本發(fā)明檢測(cè)內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下實(shí)施例將有助于對(duì)本發(fā)明的了解，但這些實(shí)施例僅為了對(duì)本發(fā)明加以說明，本發(fā)明并不限于這些內(nèi)容。
[0022]實(shí)施例一
[0023]HBV DNA的熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)例
[0024](1)試劑準(zhǔn)備
[0025]a.PCR反應(yīng)液的配制
[0026]PCR緩沖液組成為 30mmol/L Tris_HCl(PH8.3)，10mmol/L(NH4)2S04，30mmol/LKCl，
4.5mmol/LMgCl2,0.15mmol/L dNTPs。擴(kuò)增靶基因的上游引物以及下游引物，使用濃度為20pmol，靶基因檢測(cè)的探針使用濃度為8pmol，內(nèi)標(biāo)的上游引物以及下游引物使用濃度為8pmol,內(nèi)標(biāo)探針使用濃度為8pmol。
[0027]b.按比例(裂解結(jié)合液400 μ I/人份+內(nèi)標(biāo)0.1 μ I/人份)取相應(yīng)量的裂解結(jié)合液及內(nèi)標(biāo)，充分混勻成裂解結(jié)合液-mix，瞬時(shí)離心后備用。
[0028]c.根據(jù)待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、臨界陽性和工作標(biāo)準(zhǔn)品1-4的量，按比例(PCR反應(yīng)液19 μ I/人份+酶混合液1.0 μ I/人份)，充分混勻成PCR-mix，瞬時(shí)離心后備用。酶混合液組成包括熱啟動(dòng)Taq酶4U、尿嘧啶糖基化酶(UNG) 0.2U。
[0029](2)標(biāo)本提取
[0030]a.取適量1.5ml離心管，分別標(biāo)記陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、臨界陽性對(duì)照、工作標(biāo)準(zhǔn)品1-4及待測(cè)樣本，每管中加入400 μ I裂解結(jié)合液，裂解結(jié)合液組成為含有十二烷基硫酸鈉 0.5-2.5%, Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，異硫氰酸胍 2mol/L_6.0mol/L，1-1OmM EDTA(PH7.5)。
[0031]b.每管加入200μ I待測(cè)樣本或陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、臨界陽性對(duì)照、工作標(biāo)準(zhǔn)品1-4 ;每管加入10 μ I磁珠懸液，震蕩混勻10秒鐘后，室溫靜置10分鐘，瞬時(shí)離心；
[0032]c.將離心管置于磁力架上吸附約2分鐘，棄掉上清液，瞬時(shí)離心，吸干殘液；
[0033]d.加入600 μ I漂洗液，所述漂洗液組成為含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml,氯化鈉0.1-0.3mol/L,60-80%乙醇。用移液器反復(fù)吸打10次后，瞬時(shí)離心。在磁力架上吸附2分鐘，棄掉上清液，然后瞬時(shí)離心，將離心管再置于磁力架上吸附約2分鐘，吸干殘液；
[0034]e.加入40 μ I洗脫液，所述洗脫液為含有10mmol/L Tris.HCl (PH8.3)，
0.01-0.05%Prolin300。震蕩混勻10秒鐘，然后室溫靜置2分鐘；將離心管放置在磁力架上吸附2分鐘，吸出上清液。
[0035](3)加樣和檢測(cè)
[0036]向含有PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管中，分別加入提取的樣本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、臨界陽性對(duì)照、及工作標(biāo)準(zhǔn)品各30 μ 1，蓋緊管蓋，置于PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增程序如下:
[0037]以ΑΒΙ7500為例，設(shè)置如表1:
[0038]表1PCR擴(kuò)增程序
【權(quán)利要求】
1.一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:試劑盒包括磁珠法核酸提取試劑盒和HBV核酸擴(kuò)增試劑盒，其中磁珠法核酸提取試劑盒包括裂解結(jié)合液、漂洗液、洗脫液、磁珠液；HBV核酸擴(kuò)增試劑盒包括HBV-PCR反應(yīng)液、酶混合液、HBV-內(nèi)標(biāo)、HBV定量參考品1-4、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品。
2.如權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述磁珠法核酸提取試劑盒中裂解結(jié)合液組成為含有十二烷基硫酸鈉0.5-2.5%，TritonX-100 0.5-2.0ml/100ml，異硫氰酸胍 2-6.0moI/L, 1-lOmM/L EDTA (PH7.5);所述磁珠法核酸提取試劑盒中漂洗液組成為含有Triton X-100 0.5-2.0ml/100ml，氯化鈉0.1-0.3mol/L,60-80%乙醇；所述磁珠法核酸提取試劑盒中洗脫液組成為含有l(wèi)Ommol/L Tris.HCl(PH8.3),0.01-0.05%Prolin300 ;所述磁珠法核酸提取試劑盒中磁珠液組成為直徑為I μ m的氧化硅超順納米磁珠，濃度為10-40mg/ml。
3.如權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述HBV核酸擴(kuò)增試劑盒中HBV-PCR反應(yīng)液包括用于檢測(cè)靶基因和內(nèi)標(biāo)的探針、用于擴(kuò)增靶基因和內(nèi)標(biāo)的上游引物以及下游引物、PCR緩沖液；HBV核酸擴(kuò)增試劑盒中用于檢測(cè)靶基因的探針序列為:5’-CC TTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTC-’3(SEQ ID N0:l)，5’ 端標(biāo)記為 FAM熒光發(fā)生基團(tuán)，3’端標(biāo)記為BHQl熒光淬滅基團(tuán)；用于內(nèi)標(biāo)檢測(cè)的探針序列為:5’-CAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGC-’3 (SEQ ID NO: 2)，5’ 端標(biāo)記為 HEX 熒光發(fā)生基團(tuán)，3’ 端標(biāo)記為BHQl熒光淬滅基團(tuán)；用于擴(kuò)增靶基因的上游引物序列為:5’-CGCACCTCTCTTTACGCGGTC-’3(SEQ ID N0:3);用于擴(kuò)增靶基因的下游引物序列為:5’-CGTTCACGGTGGTTTCCATGC-’3 (SEQID NO:4);用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的上游引物序列為:5’ -TTCGATCTCCGTCGAACCTTG-’ 3 (SEQ IDN0:5);用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的下游引物序列為:5’-TTCTCAGGACTCCAGTCGCTG-’3 (SEQ ID N0:6)。
4.如權(quán)利要求1或3所述的一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述HBV核酸擴(kuò)增試劑盒中用于檢測(cè)靶基因的探針使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選靶基因探針使用濃度為8pmol ;所述用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選內(nèi)標(biāo)探針使用濃度為Spmol ;所述用于檢測(cè)靶基因的上下游引物使用濃度為10-30pmol，優(yōu)選靶基因的上下游引物使用濃度為20pmol ;所述用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選內(nèi)標(biāo)引物使用濃度為8pmol。
5.如權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述HBV核酸擴(kuò)增試劑盒中PCR緩沖液組成為30mmol/L Tris-HCl (PH8.3)，IOmmol/L(NH4)2S04，30mmol/LKCl，4.5mmol/LMgCl2，0.15mmol/L dNTPs。
6.如權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述HBV核酸擴(kuò)增試劑盒中酶混合液包括熱啟動(dòng)Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG);其中熱啟動(dòng)Taq酶的用量為3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量為0.05-0.2U/人份。
7.如權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中 HBV-內(nèi)標(biāo)是將序列 5’-TTCGATCTCCGTCGAACCTTGCACTCTGCATCCTGGACTCATGCTGACTGCAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGCTCTACTGCACTCCTGCGTCATCACGCGACTGGAGTCCTGAGAA-' 3 (SEQ ID NO:7)插入到pUC18T載體而構(gòu)成的重組體；HBV內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒使用濃度為100-500copies/次，優(yōu)選使用濃度為200copies/次。
8.如權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中陰性質(zhì)控品為滅活陰性人源血漿，HBV定量參考品1-4，臨界陽性質(zhì)控品和強(qiáng)陽性質(zhì)控品均由HBV病毒血清樣本稀釋而成；濃度分別為5.0xlO5, 5.0xlO4, 5.0xlO3, 5.0xlO2,.1.0xlO2,1.0xl05IU/ml, HBV病毒血清為滅活病毒血清樣本。
9.如權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒需要進(jìn)行PCR反應(yīng)，其擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間為:50°C 2min，l個(gè)循環(huán)；95°C 3min, I個(gè)循環(huán)；最后94°C 10s，60°C 30s, 42個(gè)循環(huán)采集熒光信號(hào)。
10.如權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒檢測(cè)樣本類型為血清和血漿；試劑盒的檢測(cè)靈敏度為10IU/ml，檢測(cè)線性范圍為 30-30xl08IU/ml。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103642941SQ201310689663
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】李望豐, 關(guān)爾鑫, 趙世源, 蔡一榮, 王丹, 肖樊, 周凱, 任旭 申請(qǐng)人:東北制藥集團(tuán)遼寧生物醫(yī)藥有限公司