具有體內(nèi)示蹤和腫瘤治療作用的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及其制備方法
【專利摘要】一種具有體內(nèi)示蹤和腫瘤治療作用的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及制備方法。所述細(xì)胞是一種由人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，該細(xì)胞能夠進(jìn)行腫瘤治療，同時(shí)具有分子成像功能，經(jīng)瘤內(nèi)注射后能夠在活體狀態(tài)下實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其在體內(nèi)分布和存活情況。具體說是將海腎熒光素酶-紅色熒光蛋白-自殺基因胸苷激酶三融合基因轉(zhuǎn)染入人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，借助活體成像系統(tǒng)收集熒光素信號(hào)來監(jiān)測(cè)其對(duì)Nude小鼠乳腺癌模型的靶向治療；對(duì)注射了轉(zhuǎn)染三融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞的小鼠給予胸苷激酶的底物更西洛韋，通過旁觀者效應(yīng)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞周圍腫瘤細(xì)胞的死亡。
【專利說明】具有體內(nèi)示蹤和腫瘤治療作用的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞治療領(lǐng)域,涉及一種具有體內(nèi)示蹤和腫瘤治療作用的細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，乳腺癌已經(jīng)成為全世界女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重地威脅著女性的身心健康。在當(dāng)今技術(shù)條件下，其原發(fā)腫瘤病灶可以通過手術(shù)進(jìn)行根治，但是手術(shù)給患者帶來極大的痛苦。目前對(duì)乳腺癌多應(yīng)用化療進(jìn)行治療，大多數(shù)化療藥物并不能夠特異性地作用于腫瘤細(xì)胞，在對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷的同時(shí)也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生一定殺傷作用，導(dǎo)致嚴(yán)重毒副作用，患者往往并不能獲得長(zhǎng)期生存，且治療費(fèi)用昂貴，給患者帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前對(duì)于腫瘤治療迫切需要找到一種能夠靶向腫瘤病灶部位的載體，將抗癌藥物或基因特異性運(yùn)輸?shù)侥[瘤病灶，而不對(duì)周圍的正常組織造成影響，成功應(yīng)用這種載體將顯著提高腫瘤治療效果，降低副作用。近年來有研究應(yīng)用骨髓、胚胎或臍帶中分離得到的內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)性地腫瘤靶向治療，雖然被證實(shí)具有一定的有效性，但這類內(nèi)皮前體細(xì)胞來源有限且不易獲得，難以應(yīng)用于臨床。人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新和分化的能力，其在體外能夠進(jìn)行擴(kuò)增，如果能夠被證實(shí)具有腫瘤靶向性，將對(duì)應(yīng)用于臨床治療具有重要意義。此外，為了觀測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況，并監(jiān)測(cè)載體細(xì)胞在體內(nèi)的分布、增殖和機(jī)體排斥的過程，可以應(yīng)用體內(nèi)分子成像技術(shù)進(jìn)行追蹤，其具有微創(chuàng)、直觀、動(dòng)態(tài)觀察的特點(diǎn)，并能夠?qū)ν恢粍?dòng)物在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，能夠很好地評(píng)估靶向治療的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于解決目前應(yīng)用于試驗(yàn)性腫瘤靶向治療的臨床局限性，提供一種具有能夠進(jìn)行體內(nèi)示蹤并具有腫瘤治療作用的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞以及制備方法。
[0004]本發(fā)明提供的具有體內(nèi)示蹤和腫瘤治療作用的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，是由人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、經(jīng)攜帶有海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和胸苷激酶的三融合基因的慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后構(gòu)建而成，該細(xì)胞能夠進(jìn)行體內(nèi)示蹤，并在給予胸苷激酶底物更西洛韋后誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的凋亡。
[0005]本發(fā)明所涉及的細(xì)胞制備和腫瘤靶向治療、體內(nèi)示蹤的方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
[0006]1、本發(fā)明所述的具有腫瘤治療作用并且能夠進(jìn)行體內(nèi)示蹤的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的制備方法，
[0007]其具體步驟為:
[0008]第1、構(gòu)建含海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合基因的具有
[0009]Bsd抗性的慢病毒表達(dá)載體；
[0010]第2、用293T細(xì)胞鋪六孔板，密度為1.5X IO6細(xì)胞/孔，用于轉(zhuǎn)染；
[0011]第3、用lipo-2000將第I步中構(gòu)建的三融合基因慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入第2步前鋪板的293T細(xì)胞；
[0012]第4、第3步293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染16小時(shí)后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基(CORNING貨號(hào):10-017-CVR)，換液后24小時(shí)收集病毒上清，儲(chǔ)于_80°C冰箱備用；
[0013]第5、用人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞鋪六孔板，密度為IX IO5細(xì)胞/孔，用于病毒感染；
[0014]第6、待第4步中的病毒上清常溫化凍后，取2毫升不含抗生素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基(gibco貨號(hào):11330-032)和I毫升第4步中的病毒上清混合后加入間充質(zhì)干細(xì)胞孔內(nèi)，并加入 polybrene (sigma 貨號(hào):H9268) 24 μ g/孔，1600rpm, 37°C離心 I 小時(shí)；
[0015]第7、離心結(jié)束后換新鮮全培養(yǎng)基2毫升/孔，繼續(xù)置于37°C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；
[0016]第8、48小時(shí)后向經(jīng)病毒感染后的間充質(zhì)干細(xì)胞加入Bsd進(jìn)行藥篩共計(jì)3天，以得到穩(wěn)定表達(dá)海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，即轉(zhuǎn)基因間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0017]2、體內(nèi)腫瘤靶向治療:
[0018]⑴用胰酶消化生長(zhǎng)良好的野生型或標(biāo)記螢火蟲熒光素酶和綠色熒光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，用PBS洗一遍并用DMEM基本培養(yǎng)基重懸至I X IO7細(xì)胞/毫升；
[0019]⑵對(duì)6-8周齡雌性Nude小鼠腹部?jī)蓚?cè)分別經(jīng)原位注射100微升上述腫瘤細(xì)胞懸液，待2周后，腹部形成腫瘤灶，建成Nude小鼠乳腺癌模型；
[0020]⑶用胰酶消化攜帶海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，用PBS洗一遍并用DMEM/F12基本培養(yǎng)基重懸至I X IO7細(xì)
胞/毫升；
`[0021]⑷經(jīng)瘤內(nèi)向乳腺癌模型Nude小鼠每側(cè)腫瘤注射100微升上述間充質(zhì)干細(xì)胞懸液；
[0022](5)經(jīng)腹腔注射更西洛韋0.5mg，每日2次，兩次給藥中間間隔12小時(shí)，連續(xù)4天；
[0023](6)重復(fù)上述步驟⑷-(5) 4次。
[0024]3、體內(nèi)化學(xué)發(fā)光成像:
[0025]⑴監(jiān)測(cè)腫瘤病灶生長(zhǎng)情況:向乳腺癌模型Nude小鼠腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物D-Luciferin (150mg/kg),待5分鐘后利用Xenogen IVIS Lumina II活體成像系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，曝光時(shí)間為30秒；
[0026]⑵監(jiān)測(cè)人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的分布:①監(jiān)測(cè)攜帶海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞:向Nude小鼠經(jīng)尾靜脈注射海腎突光素酶底物coeIenterazine (500 μ g/kg),立即利用XenogenIVIS Lumina II活體成像系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，曝光時(shí)間為5分鐘監(jiān)測(cè)攜帶螢火蟲熒光素酶和綠色熒光蛋白的乳腺癌細(xì)胞:向Nude小鼠腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg),待5分鐘后利用Xenogen IVIS Lumina II活體成像系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，曝光時(shí)間根據(jù)情況為1-3分鐘。
[0027]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0028]人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞本身具有自我更新和分化的能力，目前能夠?qū)崿F(xiàn)在體外的穩(wěn)定培養(yǎng)和無限增殖，可以在未來實(shí)際應(yīng)用中獲得充足細(xì)胞來源。本發(fā)明所制備的攜帶海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)乳腺癌瘤內(nèi)注射，不僅具有腫瘤靶向性而且在給予胸苷激酶底物更西洛韋后可以誘導(dǎo)其周圍腫瘤細(xì)胞的凋亡。此過程能夠在給予海腎熒光素酶底物coelenterazine和螢火蟲熒光素酶底物D-Luciferin后進(jìn)行體內(nèi)示蹤。利用分子成像技術(shù)收集間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，能夠在活體中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)兩者在體內(nèi)的分布、增殖和誘導(dǎo)凋亡的情況。應(yīng)用本發(fā)明所制備的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行腫瘤治療具有微創(chuàng)、直觀、動(dòng)態(tài)觀察的特點(diǎn)，并能夠?qū)ν恢粍?dòng)物在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，能夠更有效地評(píng)估靶向治療的療效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1攜帶海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合報(bào)告基因的質(zhì)粒示意圖；
[0030]圖2攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)紅色熒光蛋白的情況；A是白光下攜帶三融合蛋白的間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)，B是對(duì)攜帶三融合蛋白的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)紅色熒光蛋白的檢測(cè)結(jié)果；
[0031]圖3攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞生物發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)呈正比關(guān)系；A是利用光學(xué)影像方法檢測(cè)密度梯度鋪板后攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞生物發(fā)光強(qiáng)度，B是對(duì)A圖熒光發(fā)光強(qiáng)度和攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞密度梯度數(shù)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明細(xì)胞數(shù)量與Luciferase發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系；
[0032]圖4在不同濃度更西洛韋條件下培養(yǎng)攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞5天的存活率；
[0033]圖5在40μ g/ml更西洛韋條件下培養(yǎng)攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞不同天數(shù)的存活率；
[0034]圖6攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)瘤內(nèi)注射后在乳腺癌Nude小鼠I旲型的體內(nèi)不蹤；
[0035]圖7攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)瘤內(nèi)注射，并給予更昔洛韋后在乳腺癌Nude小鼠的體內(nèi)示蹤；
[0036]圖8攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞以不同比例混合后在40 μ g/ml更西洛韋條件下培養(yǎng)5天后腫瘤細(xì)胞的存活率；
[0037]圖9攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞以1:1比例混合后在40 μ g/ml更西洛韋條件下培養(yǎng)5天后腫瘤細(xì)胞的存活率。
[0038]圖10經(jīng)原位注射人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞建立Nude小鼠乳腺癌模型后腫瘤的生長(zhǎng)情況；
[0039]圖11經(jīng)原位注射人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞建立Nude小鼠乳腺癌模型后給予攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞加更西洛韋治療后腫瘤的生長(zhǎng)情況。
[0040]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【具體實(shí)施方式】
[0041]實(shí)施例1
[0042]攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備
[0043]⑴構(gòu)建含海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合基因的具有Bsd抗性的慢病毒表達(dá)載體:將亞克隆的含海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合基因的片斷插入到商業(yè)化載體pLV-EFl a -MCS-1RES-Bsd的多克隆位點(diǎn)當(dāng)中，得到pLV-EFl a -TF-Bsd質(zhì)粒，如圖1所示；
[0044]⑵用293Τ細(xì)胞鋪六孔板，密度為1.5 X IO6細(xì)胞/孔，用于轉(zhuǎn)染；
[0045]⑶用Iipo-2000將pLV-EFl a -TF-Bsd慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入前一天鋪板的293Τ細(xì)胞；
[0046]⑷轉(zhuǎn)染16小時(shí)后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基(DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基)，換液后24小時(shí)收集病毒上清，儲(chǔ)于_80°C冰箱備用；
[0047](5)用人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞鋪六孔板，密度為IX IO5細(xì)胞/孔，用于病毒感染；
[0048](6)待步驟(4)中病毒上清常溫化凍后，取2毫升不含抗生素的全培養(yǎng)基和I毫升病毒上清混合后加入步驟(5)中間充質(zhì)干細(xì)胞孔內(nèi)，并加入polybrene24 μ g/孔，1600rpm,37°C離心I小時(shí)；
[0049](7)離心結(jié)束后換新鮮全培養(yǎng)基2毫升/孔，繼續(xù)置于37°C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；
[0050](8) 48小時(shí)后向經(jīng)病毒感染后的間充質(zhì)干細(xì)胞加入Bsd進(jìn)行藥篩共計(jì)3天，以得到穩(wěn)定表達(dá)海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0051]在熒光顯微鏡下觀察攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞紅色熒光蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示，可見鏡下全部細(xì)胞表達(dá)紅色熒光蛋白；應(yīng)用活體成像系統(tǒng)觀察該細(xì)胞海腎熒光素酶的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示，加入稀釋后的海腎熒光素酶底物coelenterazine后,可見生物發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)呈正比線性關(guān)系。
`[0052]在人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的HSV-ttk底物更西洛韋(0-40 μ g/ml),培養(yǎng)5天后，用WST-1法檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖4所示，在40 μ g/ml更西洛韋培養(yǎng)條件下，絕大多數(shù)細(xì)胞在2天內(nèi)發(fā)生凋亡，如圖5所示。
[0053]實(shí)施例2
[0054]攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)瘤內(nèi)注射后在乳腺癌Nude小鼠模型的體內(nèi)示蹤。
[0055]⑴向6-8周雌性Nude小鼠腹部?jī)蓚?cè)分別經(jīng)原位注射攜帶螢火蟲熒光素酶和綠色熒光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞1.0X IO6個(gè)；
[0056](2) 12天后，向小鼠腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物0-1^1(^作1^11(1501^/1^)，待5分鐘后利用Xenogen IVIS Lumina II活體成像系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，曝光時(shí)間為30秒，可見兩側(cè)腹部發(fā)出熒光信號(hào)，確定Nude小鼠乳腺癌模型建立成功；
[0057]⑶用胰酶消化實(shí)施例1中得到的攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，用DMEM/F12基本培養(yǎng)基重懸至I X IO7細(xì)胞/毫升，對(duì)Nude小鼠乳腺癌模型每側(cè)腫瘤經(jīng)瘤內(nèi)注射100微升；
[0058]⑷分別在注射間充質(zhì)干細(xì)胞后立刻及注射后24小時(shí)及48小時(shí)向Nude小鼠經(jīng)尾靜脈注射海腎突光素酶底物coelenterazine (500 μ g/kg),立即利用Xenogen IVIS LuminaII活體成像系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，曝光時(shí)間為5分鐘，監(jiān)測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的分布。
[0059]在向Nude小鼠模型經(jīng)瘤內(nèi)注射三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞后，如圖6所示，注射后立即能夠在小鼠腹部監(jiān)測(cè)到海腎熒光素信號(hào)，注射后24小時(shí)大部分細(xì)胞信號(hào)仍存于腹部，注射后48小時(shí)，腹部仍有小部分信號(hào)。
[0060]實(shí)施例3
[0061]攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)瘤內(nèi)注射后并給予更西洛韋腹腔注射后在乳腺癌模型Nude小鼠的體內(nèi)示蹤。
[0062]⑴向6-8周雌性Nude小鼠腹部?jī)蓚?cè)分別經(jīng)原位注射人乳腺癌MDA_MB_231細(xì)胞1.0X IO6 個(gè)；
[0063](2) 12天后，向小鼠腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物D-Luciferin (150mg/kg)，待5分鐘后利用Xenogen IVIS Lumina II活體成像系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，曝光時(shí)間為30秒，可見兩側(cè)腹部發(fā)生信號(hào)，確定Nude小鼠乳腺癌模型建立成功。
[0064](3)用胰酶消化實(shí)施例1中得到的攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，用基本培養(yǎng)基重懸至I X IO7細(xì)胞/毫升，對(duì)Nude小鼠乳腺癌模型每側(cè)腫瘤經(jīng)瘤內(nèi)注射100微升；[0065]⑷注射間充質(zhì)干細(xì)胞半小時(shí)后經(jīng)腹腔注射更昔洛韋0.5mg，之后每12小時(shí)I次；
[0066](5)分別在注射間充質(zhì)干細(xì)胞后立刻及注射后24小時(shí)及48小時(shí)向Nude小鼠經(jīng)尾靜脈注射海腎突光素酶底物coelenterazine (500 μ g/kg),立即利用Xenogen IVIS LuminaII活體成像系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，曝光時(shí)間為5分鐘，監(jiān)測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的分布。
[0067]在向Nude小鼠乳腺癌模型經(jīng)瘤內(nèi)注射三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞并給予更昔洛韋注射后，如圖7所示，注射后立即能夠在小鼠腹部監(jiān)測(cè)到海腎熒光素信號(hào)，注射后24小時(shí)，小部分信號(hào)仍存在腹部，注射后48小時(shí)幾乎不能監(jiān)測(cè)海腎熒光素信號(hào)。
[0068]實(shí)施例4
[0069]攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷作用。
[0070]⑴用商業(yè)化的pLV-EFl a -MCS-1RES-GFP-Bsd慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293Τ細(xì)胞；
[0071]⑵轉(zhuǎn)染16小時(shí)后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，換液后24小時(shí)收集病毒上清，儲(chǔ)于_80°C冰禮備用；
[0072]⑶用人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231鋪六孔板，密度為I X IO5細(xì)胞/孔，用于病毒感染；
[0073]⑷待病毒上清常溫化凍后，取2毫升不含抗生素的全培養(yǎng)基和I毫升病毒上清混合后加入步驟(3)中孔內(nèi)，并加入polybrene24 μ g/孔，1600rpm, 37°C離心I小時(shí)；
[0074](5)離心結(jié)束后換新鮮全培養(yǎng)基2毫升/孔，繼續(xù)置于37°C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；
[0075](6) 48小時(shí)后向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Bsd進(jìn)行藥篩共計(jì)3天，以得到穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的MDA-MB-231-GFP細(xì)胞；
[0076](7)將MDA-MB-231-GFP細(xì)胞和實(shí)施例1中制備得到的攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞混合，并在培養(yǎng)基中加入更西洛韋，培養(yǎng)5天后裂解細(xì)胞，應(yīng)用多功能檢測(cè)儀測(cè)定細(xì)胞裂解液的GFP強(qiáng)度，以GFP的相對(duì)強(qiáng)度代表MDA-MB-231-GFP的存活情況。
[0077]結(jié)果如圖8-9所示，在圖8中將兩種細(xì)胞按照不同比例進(jìn)行混合后在40 μ g/ml更西洛韋條件下培養(yǎng)5天后，在40%-100%混合組中MDA-MB-231細(xì)胞死亡率大于50% ;圖9中將兩種細(xì)胞1:1混合后在40 μ g/ml更西洛韋條件下培養(yǎng)5天，在全部的給藥組MDA-MB-231的死亡率均大于50%。
[0078]實(shí)施例5
[0079]Nude小鼠乳腺癌模型腫瘤的體內(nèi)示蹤。
[0080]⑴向6-8周雌性Nude小鼠腹部?jī)蓚?cè)分別經(jīng)原位注射攜帶螢火蟲熒光素酶和綠色熒光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞1.0X IO6個(gè)；
[0081 ] (2) 12天后，向小鼠腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物D-Luciferin (150mg/kg)，待5分鐘后利用Xenogen IVIS Lumina II活體成像系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，曝光時(shí)間為30秒，可見兩側(cè)腹部散在信號(hào)，確定Nude小鼠乳腺癌模型建立成功；
[0082]⑶分別于第18天、第23天、第28天重復(fù)上一步驟，監(jiān)測(cè)腹部腫瘤生長(zhǎng)情況。
[0083]結(jié)果如圖10所示，可見小鼠腹部腫瘤自接種腫瘤細(xì)胞后第13天至第28天生長(zhǎng)迅速。
[0084]實(shí)施例6
[0085]Nude小鼠乳腺癌模型給予攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞加更西洛韋治療后腫瘤的體內(nèi)不蹤。
[0086]⑴向6-8周雌性Nude小鼠腹部?jī)蓚?cè)分別經(jīng)原位注射攜帶螢火蟲熒光素酶和綠色熒光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞1.0X IO6個(gè)；
[0087](2) 10天后，向小鼠腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物0-1^1(^作1^11(1501^/1^)，待5分鐘后利用Xenogen IVIS Lumina II活體成像系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，曝光時(shí)間為30秒，可見腹部?jī)蓚?cè)散在信號(hào)，確定Nude小鼠乳腺癌模型建立成功；
[0088]⑶分別在第12天、第14天、第16天消化攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，用基本培養(yǎng)基重懸至I X IO7細(xì)胞/毫升，對(duì)Nude小鼠乳腺癌模型兩側(cè)腫瘤分別經(jīng)瘤內(nèi)注射100微升；
[0089]⑷連續(xù)4天經(jīng)腹腔注射更西洛韋0.5mg,每日2次，兩次給藥中間間隔12小時(shí)；
[0090](5)分別于每輪治療后，即第13天、第18天、第23天和第28天重復(fù)第2步驟，監(jiān)測(cè)腹部腫瘤生長(zhǎng)情況。
[0091]結(jié)果如圖11所示，可見經(jīng)攜帶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞加更西洛韋治療后小鼠腹部腫瘤生長(zhǎng)緩慢，明顯慢于圖10中未經(jīng)治療小鼠。
【權(quán)利要求】
1.一種具有體內(nèi)示蹤和腫瘤治療作用的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其特征在于所述的細(xì)胞是由人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、經(jīng)攜帶有海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和胸苷激酶的三融合基因的慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后構(gòu)建而成，該細(xì)胞能夠進(jìn)行體內(nèi)示蹤，并在給予胸苷激酶底物更西洛韋后誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的凋亡。
2.一種具有腫瘤治療作用并且能夠進(jìn)行體內(nèi)示蹤的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的制備方法，其具體步驟為: 第1、構(gòu)建含海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合基因的具有Bsd抗性的慢病毒表達(dá)載體； 第2、用293T細(xì)胞鋪六孔板，密度為1.5X IO6細(xì)胞/孔，用于轉(zhuǎn)染； 第3、用lipo-2000將第I步中構(gòu)建的三融合基因慢病毒表達(dá)載體和慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入第2步的293T細(xì)胞； 第4、第3步293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染16小時(shí)后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，換液后24小時(shí)收集病毒上清，儲(chǔ)于-80°C冰箱備用； 第5、用人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞鋪六孔板，密度為I X IO5細(xì)胞/孔，用于病毒感染；第6、待第4步中的病毒上清常溫化凍后，取2毫升不含抗生素的全培養(yǎng)基和I毫升第4步中的病毒上清混合后,加入間充質(zhì)干細(xì)胞孔內(nèi)，并加入polybrene24y g/孔，1600rpm,37°C離心I小時(shí)； 第7、離心結(jié)束后換新鮮全培養(yǎng)基2毫升/孔，繼續(xù)置于37°C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)； 第8、48小時(shí)后向經(jīng)病毒感染后的間充質(zhì)干細(xì)胞加入Bsd進(jìn)行藥篩共計(jì)3天，以得到穩(wěn)定表達(dá)海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，即轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK103695373SQ201310695256
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】李宗金, 韓忠朝, 冷良, 韓之波, 徐旸, 趙錢杰, 王悅冰 申請(qǐng)人:南開大學(xué), 北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)有限公司