一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，屬于干細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。以MSCSFM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子，將骨髓細(xì)胞懸液離心后，在上述培養(yǎng)基中，37℃情況下，以1x（乘號(hào)）104/cm2細(xì)胞密度進(jìn)行恒溫接種培養(yǎng)。本發(fā)明采用無血清方式進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，具有安全性、可靠性高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，屬于干細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著干細(xì)胞的研究不斷深入，其在疾病治療應(yīng)用價(jià)值也被不斷發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層的成體干細(xì)胞，是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。MSCs可來源于骨髓、脂肪、臍帶血、真皮、胎盤等組織；此外與其他干細(xì)胞相比，MSCs容易提取分離、增殖以及基因?qū)?，所以其在?xì)胞移植治療和基因治療中有很大的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)MSCs具有多向分化的潛能，能夠誘導(dǎo)分化為許多不同的組織，歸巢特性，以及免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)于組織修復(fù)和免疫疾病等的治療有很大的作用。已有不少文獻(xiàn)證實(shí)了 MSCs對(duì)肝臟疾病積極的治療作用。
[0003]然而，MSCs的細(xì)胞治療應(yīng)用依然存在一些問題:
(1)MSCs的血清培養(yǎng)存在潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。血清成分不明確，其中可能含有動(dòng)物攜帶的已知的或未知的病原體，在臨床應(yīng)用中具有潛在的危險(xiǎn)；
(2)需更多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)MSCs移植治療的有效性和安全性。雖有一些MSCs移植治療的臨床案例，但數(shù)量少，且缺少對(duì)照。
[0004](3)利用人MSCs作為研究對(duì)象，存在取材不便及安全倫理道德的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中血清培養(yǎng)所存在的安全性、有效性等方面的因素，本發(fā)明提供一種無血清方式的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法。
[0006]一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，以MSC SFM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子，將骨髓細(xì)胞懸液離心后，在上述培養(yǎng)基中，37°C情況下，以1‘ IO4 /cm2細(xì)胞密度進(jìn)行恒溫接種培養(yǎng)。
[0007]進(jìn)一步的，作為優(yōu)選:
所述的細(xì)胞外基質(zhì)包括Cell start和Fibronectin,細(xì)胞因子為10Pg/L bFGF。
[0008]所述的MSC SFM 為 99%MSC SFM +l%Supplement+雙抗。
[0009]所述的細(xì)胞外基質(zhì)Cell start使用前先以1:1000的濃度稀釋于α -MEM,置37°C培養(yǎng)箱沉淀，實(shí)驗(yàn)前吸去上清液，晾干備用。
[0010]其中，MSC SFM為商品化的試劑，公司:invitrogen，目錄號(hào):A10675_01 ;產(chǎn)品全稱:StemPro? MSC SFM XenoFree。
[0011]Cell start:公司:invitrogen,目錄號(hào):A10142 ;產(chǎn)品全稱:CELLstartTMCTS?substrate ο
[0012]bFGF:堿性成纖維生長(zhǎng)因子。[0013]a -MEM: 一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0014]Fibronectin:纖維連接蛋白。
[0015]本發(fā)明以StemPro? MSC SFM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，這種無血清培養(yǎng)的細(xì)胞個(gè)體及集落形態(tài)與有血清培養(yǎng)的具有很大的相似性，但也存在差異，其原理、有益效果以及與有血清培養(yǎng)的差異主要如下:
1.有血清和無血清培養(yǎng)的MSCs單個(gè)細(xì)胞均呈典型的梭性，集落呈菊花狀或漩渦狀，與典型的MSCs細(xì)胞形態(tài)和集落特性相符合。血清培養(yǎng)的MSCs貼壁時(shí)細(xì)胞形態(tài)狹長(zhǎng)，鋪展較開，在增殖過程中由于細(xì)胞數(shù)量及緊密度的增加使得個(gè)體細(xì)胞形態(tài)逐漸收縮變短小，集落中各細(xì)胞連接緊密；無血清培養(yǎng)的MSCs在貼壁時(shí)細(xì)胞形態(tài)短小，鋪展程度不高，而在增殖過程中逐漸鋪展開，隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸變得狹長(zhǎng)，在集落中細(xì)胞與細(xì)胞間連接不緊密。這些差異性可能是由于培養(yǎng)基的不同造成的，但并不影響MSCs的基本生物學(xué)特性。
[0016]2.無血清培養(yǎng)培養(yǎng)體系保持了 MSCs的干性特征:具有典型的MSCs細(xì)胞和集落形態(tài)，表型特征，及具有脂肪，成骨，軟骨的分化潛能。采用脂肪、成骨、軟骨分化培養(yǎng)液對(duì)無血清體外擴(kuò)增的MSCs進(jìn)行分化培養(yǎng)，并取分化后細(xì)胞RNA進(jìn)行各分化標(biāo)志基因(Ppar、RUNX2、S0X9)及干性標(biāo)志基因(⑶29、⑶44)的熒光定量分析，結(jié)果顯示，無血清體外培養(yǎng)的MSCs也具有向脂肪、成骨、軟骨分化的能力，在分化的過程中，各分化標(biāo)志基因的表達(dá)能力逐漸增強(qiáng)，干性標(biāo)志基因的表達(dá)能力逐漸減弱。
[0017]3.基于上述兩點(diǎn)，無血清培養(yǎng)方式解決了常規(guī)有血清培養(yǎng)所存在的安全性、有效性的問題，采用本發(fā)明無血清培養(yǎng)方式，取材更方便，也更符合人性化和倫理道德對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的要求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為不同培養(yǎng)條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)(100倍下，A-C:有血清培養(yǎng)，分別培養(yǎng)第1、6、12天；D-F:無血清培養(yǎng)，分別為培養(yǎng)第1、6、12天)；
圖2為不同組別細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖；
圖3為不同組別細(xì)胞MTT增殖能力分析；
圖4為MSCs向脂肪細(xì)胞，成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化(A-C:血清培養(yǎng)的MSCs體外分化，D-F:無血清培養(yǎng)的MSCs體外分化)；
圖5-1到5-5為有血清與無血清培養(yǎng)MSCs干性標(biāo)志物與分化標(biāo)志物檢測(cè)；
圖6為RT-PCR檢測(cè)無血清培養(yǎng)間充質(zhì)干性陰性標(biāo)志物。
【具體實(shí)施方式】
[0019]培養(yǎng)基
以bFGF為生長(zhǎng)因子,Cell start/fibronectin為細(xì)胞外基質(zhì),分別建立了以下各培養(yǎng)體系:①無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF+Cellstart、②無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+Ce 11 start、③無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF+f ibronectin、④無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+f ibronectin、⑤無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF、⑥無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。通過相互之間的比較，在添加生長(zhǎng)因子bFGF的情況下，以Cell start作為細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于MSCs的體外無血清培養(yǎng)最為有利，此培養(yǎng)體系能保證細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持細(xì)胞的體外存活數(shù)量。
[0020]材料與方法 2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
新西蘭白兔由紹興文理學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地提供，正常飼養(yǎng)管理，觀察一周正常后用于實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序按本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范(2013051201)執(zhí)行。
[0021]主要試劑和儀器
試劑:D-氨基半乳糖(D-gal，Hanghong,上海)，a-MEM (吉諾，杭州)，PBS (吉諾，杭州)，抗生素(吉諾，杭州)，胎牛血清(Hyclone,美國(guó)),StemPro? MSC SFM (Invitrogen,美國(guó)),Fibronectin (Invitrogen,美國(guó)),Cellstart (Invitrogen,美國(guó))，脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基(Invitrogen,美國(guó)),成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基(Invitrogen,美國(guó)),軟骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基(Invitrogen,美國(guó))，DMSO (Sigma,美國(guó)),細(xì)胞中性脂質(zhì)油紅O染色試劑盒(Genmed,美國(guó))，細(xì)胞堿性磷酸酶活性染色試劑盒(Genmed,美國(guó)),動(dòng)物細(xì)胞糖蛋白高碘酸希爾法阿爾新藍(lán)染色試劑盒(Genmed,美國(guó))，Trizol Reagent (Invitrogen,美國(guó)),反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(艾德萊，北京)，PCR Mix (Invitrogen,美國(guó))，PKH26GL 試劑盒(Sigma,美國(guó))；MTT(Sigma,美國(guó))。
[0022]主要儀器:熒光顯微鏡(Nikon，日本)，-80°C冰箱(三洋，日本)，ELX-800酶標(biāo)儀(Bio-rad,美國(guó))，培養(yǎng)箱(三洋，日本)，以及其他常規(guī)儀器設(shè)備。
[0023]培養(yǎng)器皿:25cm2 (Corning,美國(guó))，75 cm2 (Corning,美國(guó))，4 孔板(NUNC，丹麥)6 孔板(Corning,美國(guó))，12 孔板(Corning,美國(guó)),96 孔板(Corning,美國(guó))。
[0024]方法
2.3.1 MSCs體外培養(yǎng)
2.3.1.1 MSCs體外有血清培養(yǎng)
觀察正常的新西蘭大白兔，耳緣靜脈空氣栓塞法處死，無菌分離出兩腿股骨，用碎骨鉗去除骨兩端骨骺，用注射器吸取適量PBS反復(fù)沖洗骨髓腔至含有肝素鈉的無菌離心管中，將得到的骨髓細(xì)胞懸液離心后，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為:a -MEM+10%FBS+雙抗；之后每隔3日換一次培養(yǎng)液，待培養(yǎng)瓶中的原代MSCs生長(zhǎng)至80%匯合后，用胰酶消化，加入含血清培養(yǎng)液終止胰酶作用，以1: 3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0025]體外無血清培養(yǎng)
骨髓細(xì)胞懸液離心后，為比較優(yōu)化無血清培養(yǎng)體系，以MSC SFM作為無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基((99%MSC SFM +l%Supplement+雙抗)，組合添加細(xì)胞外基質(zhì)(Cell start和Fibronectin)和細(xì)胞因子(lOPg/L bFGF)，共設(shè)置了 7種培養(yǎng)條件，分別是:①無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF+Cellstart (SF_b_C)、②無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+Cell start (SF-C)、③無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF+fibronectin (SF_b_F)、④無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+fibronectin (SF-F)、⑤無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF (SF-b)、⑥無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SF)和⑦10%血清培養(yǎng)液(S)。放置37°C培養(yǎng)箱內(nèi)孵化備用。細(xì)胞外基質(zhì)實(shí)驗(yàn)前Cell start和ECM在細(xì)胞培養(yǎng)前以1:1000的濃度稀釋于α -MEM,置37°C培養(yǎng)箱沉淀，實(shí)驗(yàn)前吸去上清液，晾干備用。其中無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF+Cell start (SF_b_C)細(xì)胞增殖效果最佳，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
[0026]增殖潛能鑒定
1)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn):按1.3.1.2上述的7種培養(yǎng)基，設(shè)置6個(gè)平行組，以f IO4 /cm2細(xì)胞密度在四孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞接種培養(yǎng)。從第2天到第7天，每天取I組細(xì)胞，胰酶消化完全后用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別對(duì)不同培養(yǎng)組分的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到7種不同培養(yǎng)條件下的MSCs細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)曲線。
[0027]) MTT測(cè)定:按1.3.1.2的7種培養(yǎng)條件，在96孔板內(nèi)設(shè)置7組細(xì)胞，每組5個(gè)重復(fù)，2d后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2-3遍，每孔加入30mL MTT溶液(5mg.mL—1)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸凈培養(yǎng)液，每孔加入IOOmL DMS0，振蕩lOmin，在酶標(biāo)儀492nm波長(zhǎng)下測(cè)得各孔的吸光度。
[0028]分化潛能鑒定
傳2-3代生長(zhǎng)穩(wěn)定的MSCs，待其長(zhǎng)至80%滿時(shí)，分別在脂肪、成骨、軟骨分化培養(yǎng)液體外誘導(dǎo)分化7-10天。之后參照Genmed公司的操作說明書，用細(xì)胞中性脂質(zhì)油紅O染色試劑盒、細(xì)胞堿性磷酸酶活性染色試劑盒、動(dòng)物細(xì)胞糖蛋白高碘酸希爾法阿爾新藍(lán)染色試劑盒分別對(duì)分化的脂肪、成骨、軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
[0029]標(biāo)志物表達(dá)水平鑒定
2.3.4.1 RNA的提取與cDNA的合成
按Invitrogen Trizol說明書細(xì)胞提取RNA,然后按反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:5 m I RNA 中加入 I ml Random Primer p (dN) 6 (0.2mg.ι?1_1)>5 ml Rnase-free ddH20,70。C 溫浴 5min,冰浴 10s,離心后加入下列試劑:4 ml 5, Reaction Buffer、2 ml dNTPMix (IOmmol d I ml Rnase inhibitor (20U ?mF1)>2 ml AMV Reverse Transcriptase(IOU.ι?1_1)>20 ml Total volume,混勻后 37° C 溫浴 5min;42° C 溫浴 60min;70° C 溫浴IOmin終止反應(yīng)，-79° C保存?zhèn)溆谩?br> [0030]實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)
采用SYBR? Green法分別檢測(cè)各樣本的基因表達(dá)情況。20μ1 PCR反應(yīng)體系:10 μ?SybrGreen qPCR Master MixU μ? 引物 F (IOuM)、1 μ? 引物 R (IOuM)、7 μ? ddH20、l μ?Template (cDNA)。反應(yīng)程序:95°C 2 min，95°C 10s，60°C 40s，以 0.5°C.s-1 的速度從65°C到95°C每隔5s記錄一次熒光值，最后獲得溶解曲線。完成上述步驟后，加樣到96孔板，置于ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，采用相對(duì)定量法分別分析各組基因標(biāo)志物的表達(dá)水平,其計(jì)算公式為:基因標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量=2_(繼)’ 100%，其中ACt=Ct
檢測(cè)干性標(biāo)志物基因CD29，CD44，Ppar，Runx2與Sox9，以GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列如表1。
[0031] 檢測(cè)基因表達(dá)
對(duì)陰性標(biāo)志物⑶34，⑶166采用RT-PCR檢測(cè)，以GAPDH為對(duì)照將按1.3.4.1反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行Ρα?，20μ1 PCR反應(yīng)體系:10 μ? 2XPCR MixU μ?弓丨物F (IOuM)Uμ? 引物R (IOuM)、7 μ? ddH20、l μ? Template (cDNA)，預(yù)變性95°C 3 min，95°C 40s, 60°C40s, 72°C 408，30個(gè)循環(huán)，最終721: I min，取5 μ?擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所用引物如表1。
[0032] 表1熒光定量PCR與RT-PCR引物序列表
【權(quán)利要求】
1.一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，以MSC SFM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子，將骨髓細(xì)胞懸液離心后，在上述培養(yǎng)基中，37°C情況下，以1’IO4 /cm2細(xì)胞密度進(jìn)行恒溫接種培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的細(xì)胞外基質(zhì)包括Cell start和Fibronectin,細(xì)胞因子為10Pg/L bFGF。
3.如權(quán)利要求1所述的一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的 MSC SFM 為 99%MSC SFM +l%Supplement+雙抗。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的細(xì)胞外基質(zhì)Cell start使用前先以1:1000的濃度稀釋于α -ΜΕΜ，置37°C培養(yǎng)箱沉淀，實(shí)驗(yàn)前吸去上清液，晾干備用。
5.一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:該培養(yǎng)基以MSC SFM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子。
6.如權(quán)利要求5所述的一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述的細(xì)胞外基質(zhì)包括Cell start和Fibronectin,細(xì)胞因子為10Pg/L bFGF。
7.如權(quán)利要求5所述的一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述的MSC SFM 為 99%MSC SFM +l%Supplement+雙抗。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK103740640SQ201310701008
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】金立方, 倪堅(jiān) 申請(qǐng)人:紹興文理學(xué)院