一株產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯的嗜熱菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯的嗜熱菌Aneurinibacillus?sp.XH2，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（簡(jiǎn)稱CCTCC），保藏日期2013年11月6日，保藏號(hào)為CCTCC?M2013550。本發(fā)明是首次報(bào)道Aneurinibacillus屬的菌株可以產(chǎn)生聚3-羥基丁酸酯。Aneurinibacillus?sp.XH2能在較高溫度50℃下合成聚3-羥基丁酸酯，其發(fā)酵溫度高于其他聚3-羥基丁酸酯常溫生產(chǎn)菌（發(fā)酵溫度為30-40℃），可以有效避免雜菌的污染，從而具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一株產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯的嗜熱菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株產(chǎn)生聚3-羥基丁酸酯的嗜熱菌Aneurinibacillus sp.XH2。
【背景技術(shù)】
[0002]聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates)是一類由微生物合成的高分子聚合物，是細(xì)菌胞內(nèi)的一種能源儲(chǔ)備物，因其具有生物可降解性和較好的環(huán)境相容性而被廣泛應(yīng)用，例如:環(huán)境友好的生物塑料制品、可生物降解和生物相容的手術(shù)植入物、藥物控釋載體材料、食品和飼料添加物和生物燃料等。目前，微生物來(lái)源的聚羥基脂肪酸酯已經(jīng)形成了包括:工業(yè)發(fā)酵、材料、醫(yī)藥、生物燃料和精細(xì)化工等行業(yè)在內(nèi)的龐大產(chǎn)業(yè)價(jià)值鏈。
[0003]根據(jù)單體組成，人們把微生物合成的聚羥基脂肪酸酯分成兩大類:一類是短鏈聚羥基脂肪酸酯，如聚3-羥基丁酸酯(p0ly(3-hydr0Xybutyrate)，PHB);另一類是中長(zhǎng)鏈聚羥基脂肪酸酯，如聚羥基己酸酯(Polyhydroxyhexanoate)。聚羥基脂肪酸酯的分子量從幾萬(wàn)至幾百萬(wàn)不等。影響其結(jié)構(gòu)的因素有共聚單體的個(gè)數(shù)、側(cè)鏈基團(tuán)、聚合單體的數(shù)目及羥基的位置等，隨著這些不定因素的改變而形成了不同的聚羥基脂肪酸酯，從而使其具有不同的物理化學(xué)性質(zhì)，例如:熔點(diǎn)、韌度、玻璃態(tài)溫度等。經(jīng)過(guò)對(duì)物理性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)等方面研究，發(fā)現(xiàn):PHB作為高度結(jié)晶的晶體與聚丙烯的相似度很高，具體表現(xiàn)在其熔點(diǎn)、結(jié)晶度、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度等方面。除此之外，PHB還具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如光學(xué)活性好、比重大、透氧性低、生物組織相溶性、抗凝血等，從而使其具有較好的應(yīng)用前景。[0004]雖然目前發(fā)現(xiàn)有300多種微生物可以產(chǎn)生聚羥基脂肪酸酯，但極端環(huán)境下的微生物資源因其具有適應(yīng)特殊環(huán)境的特點(diǎn)，如:嗜熱、嗜鹽、嗜壓等，因此具有重要的應(yīng)用價(jià)值和研究意義。目前PHB的生物發(fā)酵合成主要是在常溫條件(30-40°C)下進(jìn)行，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中容易造成雜菌的污染，并且經(jīng)過(guò)基因改造過(guò)的工程菌株存在不穩(wěn)定性及其他潛在風(fēng)險(xiǎn)。自然界存在的嗜熱微生物產(chǎn)生PHB的報(bào)道較少。因此，開(kāi)發(fā)利用天然嗜熱PHB產(chǎn)生菌具有重要的實(shí)際意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株新發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯(PHB)的嗜熱菌Aneurinibacillus sp.XH2。是首次報(bào)道該 Aneurinibacillus 屬的菌株可以產(chǎn)生 PHB。
[0006]本發(fā)明提供的PHB合成菌為Aneurinibacillus sp.XH2,該菌已于2013年11月6日保減在中國(guó)典型培養(yǎng)物保減中心(地址:中國(guó).武漢.武漢大學(xué))，保減編號(hào)為:CCTCCM2013550。
[0007]本發(fā)明的PHB合成菌XH2分離自勝利油田孤島采油廠原油采出水。該菌在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好(LB培養(yǎng)基組成為10g蛋白陳，5g酵母粉，5g NaCl)。菌落呈圓形，乳白色，邊緣整齊。菌株為革蘭氏陽(yáng)性。菌體長(zhǎng)桿狀，大小約為0.5-Ι.Ομπι寬，3.0-6.0 μ m長(zhǎng)。該菌的最適生長(zhǎng)溫度為50°C。其產(chǎn)生PHB細(xì)胞內(nèi)含物的透射電子顯微鏡見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1。該菌的16S rRNA基因的核苷酸序列的GenBank登錄號(hào)為:KF791865。將16S rRNA基因和GenBank中的登錄序列進(jìn)行相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株與已報(bào)道的Aneurinibacillus屬的16S rRNA基因序列相似性最高。菌株XH2和相似性高的標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖2。
[0008]本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B。發(fā)酵培養(yǎng)基為YPG (m/v):2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉。將菌種接種到50ml種子培養(yǎng)基，50°C下水浴搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150rpm,培養(yǎng)24小時(shí)后，按照1%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵48_96h。離心發(fā)酵液，棄上清，收集菌體后干燥。用氯仿對(duì)干細(xì)胞中的PHB進(jìn)行提取:使用量為lg干細(xì)胞加入10ml氯仿。于抽提瓶反應(yīng)釜中，在100°C下密封加熱4h ;冷卻后，用抽濾法去掉細(xì)胞碎片，得到澄清的氯仿溶液；將氯仿溶液加入到10倍體積的冰冷乙醇中，得到PHB沉淀，抽濾；收集沉淀；將收集的PH B沉淀物至40°C真空干燥箱中24h待其溶劑揮發(fā)完全后，即可得到PHB ;制作PHB膜的方法即用PHB再溶解于氯仿中，經(jīng)回流加熱充分融解后至平皿中，揮發(fā)干溶劑后至真空干燥箱烘干即可。經(jīng)過(guò)鑒定，該菌株Aneurinibacillus sp.XH2產(chǎn)生的聚輕基脂肪酸酯的單體為3-羥基脂肪酸，見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖3-5。
[0009]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的突出優(yōu)點(diǎn)在于:首次報(bào)道Aneurinibacillus屬的菌株能產(chǎn)生PHB，該菌株XH2能在高溫50°C下合成PHB。其嗜熱的特點(diǎn)，使發(fā)酵溫度高于其他絕大多數(shù)天然PHB產(chǎn)生菌和工程菌(30-40°C)，可以有效避免雜菌的污染，從而具有廣闊的應(yīng)用前景。利用本專利提供的方法，該菌發(fā)酵產(chǎn)生PHB的主要單體形式為3-羥基脂肪酸(占提取物的95%以上)，有效的避免了其他雜合形式PHB造成的影響。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1是菌株Aneurinibacillus sp.XH2的透射電鏡照片；
[0011]圖2是菌株Aneurinibacillus sp.XH2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；
[0012]圖3是菌株Aneurinibacillus sp.XH2合成的PHB單體的甲醇酯化產(chǎn)物質(zhì)譜圖和化學(xué)結(jié)構(gòu)式；
[0013]圖4是菌株Aneurinibacillus sp.XH2合成的PHB產(chǎn)物紅外圖譜和購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)品的紅外圖譜；
[0014]圖5是菌株Aneurinibacillus sp.XH2合成PHB的核磁共振圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0015]在下面的實(shí)施例中，所用菌種均為Aneurinibacillus sp.XH2。
[0016]實(shí)施例中所用的不同培養(yǎng)基配方如下:
[0017](1)篩選培養(yǎng)基:
[0018]牛肉浸膏l(xiāng)g,蛋白胨lg,NaC10.5g,葡萄糖2g,瓊脂粉1.5g,蒸懼水100ml,ρΗ7.0。
[0019](2)富集培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基:
[0020]YPG培養(yǎng)基(m/v):2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉，ρΗ7.0。
[0021]實(shí)施例1 分離篩選 Aneurinibacillus sp.XH2
[0022]實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自勝利油田孤島采油廠的原油采出水。
[0023]具體實(shí)施步驟如下:
[0024]富集培養(yǎng):在水樣品中加入富集培養(yǎng)基，然后將上述富集培養(yǎng)物分裝到錐形瓶中，迅速加熱至100°c，然后再迅速轉(zhuǎn)入60°C的水浴搖床中進(jìn)行往復(fù)震蕩(150rpm)培養(yǎng)2d。
[0025]菌株分離純化:配制固體種子培養(yǎng)基，每升中含有:20g葡萄糖,20g蛋白胨,10g酵母粉，17g瓊脂粉。調(diào)整pH值至7.0 ;將富集培養(yǎng)液用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，涂布到上述固體種子培養(yǎng)基上，置于60°C的恒溫箱中培養(yǎng)2d，用接種環(huán)挑取單菌落，得到純菌。
[0026]實(shí)施例2Aneurinibacillus sp.XH2 鑒定與保藏
[0027](1)形態(tài)特征
[0028]菌株XH2的菌落在LB培養(yǎng)基上呈圓形，乳白色，邊緣整齊。為革蘭氏陽(yáng)性菌。菌體長(zhǎng)桿狀，大小約為0.5-1.0 μ m寬，2.0-6.0 μ m長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量的顆粒狀內(nèi)含物(透射電鏡見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1)。
[0029](2)菌株16S rRNA鑒定與保藏
[0030]使用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F和1492R作為擴(kuò)增引物，采取PCR方法擴(kuò)增菌株Aneurinibacillus sp.XH2的16S rRNA片段，電泳檢測(cè)后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得測(cè)序結(jié)果，并用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BLAST程序?qū)υ摼?6S rRNA序列和GenBank已收錄的序列進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)。發(fā)現(xiàn)與之序列相似性大于99%的已知菌株是Aneurinibacillus屬，因此本發(fā)明菌株鑒定為Aneurinibacillus屬，并命名為Aneurinibacillus sp.XH2。根據(jù)相似標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如說(shuō)明書(shū)附圖2。本發(fā)明菌株Aneurinibacillus sp.XH2已于2013年11月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M2013550。該菌株的16S rRNA序列已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)為KF791865。
[0031](3)菌株生理生化特征
[0032]對(duì)菌株Aneurinibacillus sp.XH2進(jìn)行了生理生化特征鑒定，結(jié)果如表1所示。
[0033]表lAneurinibacillus sp.XH2 的生理生化特征
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一株產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯的嗜熱菌Aneurinibacillus sp.XH2,其特征在于:該菌株已于2013 年11月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC M2013550。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103667153SQ201310705052
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】郗麗君, 肖梓軍, 張瑜, 朱賢琨, 鐘駿, 呂建仁 申請(qǐng)人:中國(guó)石油大學(xué)(華東)