一種枯草芽孢桿菌及其菌劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種保藏號(hào)為CGMCC?No.8340的枯草芽孢桿菌(Busilussubtilis)，以及含有此枯草芽孢桿菌的微生物菌劑，還提供了所述枯草芽孢桿菌或微生物菌劑在防治花生果腐病中的應(yīng)用，本發(fā)明提供的保藏號(hào)為CGMCCNo.8340的枯草芽孢桿菌及含有該菌的微生物菌劑對(duì)花生果腐病菌有很強(qiáng)的拮抗作用，利用本發(fā)明篩選出的枯草芽孢桿菌菌株可以制成相應(yīng)的微生物制劑，將制得的微生物菌劑施入花生種植環(huán)境中后，通過(guò)該枯草芽孢桿菌的作用能夠防治花生果腐病的發(fā)生，從而降低花生生產(chǎn)過(guò)程中化學(xué)農(nóng)藥的施用。
【專利說(shuō)明】一種枯草芽孢桿菌及其菌劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌BS-KA2及一種用于防治鐮刀菌感染所致的花生果腐病的生物菌劑，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]鐮刀菌是一類世界性分布的真菌，它不僅可以在土壤中越冬越夏，還可侵染多種植物(糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、藥用植物及觀賞植物)，引起植物的根腐、莖腐、莖基腐、花腐和穗腐等多種病害，寄主植物達(dá)100余種，侵染寄主植物維管束系統(tǒng)，破壞植物的輸導(dǎo)組織維管束，并在生長(zhǎng)發(fā)育代謝過(guò)程中產(chǎn)生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影響產(chǎn)量和品質(zhì)，是生產(chǎn)上防治最艱難的重要病害之一。
[0003]茄鐮刀菌是鐮刀菌的一種，該病原菌在重茬花生土壤中大量繁殖，導(dǎo)致花生果腐病?；ㄉ〉闹饕“Y為花生果腐爛，輕的部分莢果為褐色或黑色，果仁小而硬實(shí)，嚴(yán)重的整個(gè)莢果都為深黑色，果皮和果仁均腐爛，一般整株或點(diǎn)片發(fā)生。染病地塊輕則減產(chǎn)20%，嚴(yán)重的減產(chǎn)50%以上，花生結(jié)莢期到采收期均有發(fā)病的可能。
[0004]目前花生果腐病已成為花生生產(chǎn)上的一種主要病害，對(duì)花生產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成了極為嚴(yán)重的威脅，該病目前主要通過(guò)殺菌劑類化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，但是效果不佳且對(duì)環(huán)境污染較為嚴(yán)重，急需尋找低污染、高防效的花生果腐病防治方式。
[0005]利用拮抗微生物防治農(nóng)作物病害由于具有低污染、低殘留、不引起病害抗性等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)得到廣泛的重視。該防治方式的關(guān)鍵是篩選出對(duì)病原微生物有拮抗作用、且抑菌譜廣的拮抗微生物并形成制劑，在花生果腐病防治上進(jìn)行應(yīng)用。目前在花生果腐病生物防治方面的研究相對(duì)較少，因此，迫切需要篩選出一種能夠高效拮抗花生果腐病病源菌的微生物菌株及相關(guān)的微生物菌劑，從而通過(guò)生物防治降低花生果腐病給花生生產(chǎn)帶來(lái)的危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服目前利用化學(xué)農(nóng)藥防治花生果腐病帶來(lái)的環(huán)境危害，提供一種能夠抑制鐮刀菌生長(zhǎng)，尤其是能夠高效拮抗花生果腐病的枯草芽孢桿菌菌株，并且本發(fā)明還提供了一種含有上述枯草芽孢桿菌菌株的用于防治鐮刀菌感染所致的花生果腐病的生物菌劑。
[0007]為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌BS-KA2于2013年10月15日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為=CGMCC N0.8340。
[0008]進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌BS-KA2具有抑制鐮刀菌生長(zhǎng)的活性。
[0009]進(jìn)一步的，本發(fā) 明所述的枯草芽孢桿菌BS-KA2用于防治花生由于感染鐮刀菌引起的果腐病。
[0010]進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌BS-KA2在制備用于防治花生果腐病的生物菌劑中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的用于防治鐮刀菌感染所致花生果腐病的生物菌劑，含有枯草芽孢桿菌BS-KA2，其中所述的枯草芽孢桿菌BS-KA2于2013年10月15日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為=CGMCC N0.8340。
[0012]進(jìn)一步的，本發(fā)明的用于防治鐮刀菌感染所致的花生果腐病的生物菌劑中所述枯草芽孢桿菌BS-KA2的含量為2 X IO7-1OX IO8個(gè)/克菌劑。
[0013]進(jìn)一步的，本發(fā)明的用于防治鐮刀菌感染的所致的花生果腐病的生物菌劑，其特征在于所述的生物菌劑為芽孢菌劑、芽孢與菌體的混合制劑。
[0014]進(jìn)一步的，本發(fā)明的用于防治鐮刀菌感染的生物菌劑，其特征在于其用于防治花生果腐病。
[0015]本發(fā)明的有益效果為:
本發(fā)明的枯草芽孢桿菌BS-KA2可以有效抑制鐮刀菌感染所致的花生果腐病，具有高效的防治作用，有效率可以達(dá)到60%以上。作為生物介入手段，可以避免化學(xué)品如農(nóng)藥引起的殘留和污染，是一種更經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、綠色的植物病害防治手段。
[0016]本發(fā)明的枯草芽孢桿菌BS-KA2可以制成多種生物菌劑，或作為有效成分添加到現(xiàn)有生物菌劑中，當(dāng)制成芽 孢菌劑時(shí)，可適應(yīng)多種保存環(huán)境，并具有較長(zhǎng)的保質(zhì)期，在常溫常壓下，可保存1-3年，利于倉(cāng)儲(chǔ)和運(yùn)輸。
[0017]生物樣品保藏信息
枯草芽孢桿菌BS-KA2，分類命名為feci77心subtilis，已于2013年10月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，菌種保藏號(hào)為CGMCC N0.8340。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為枯草芽孢桿菌BS-KA2在固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時(shí)的菌落形態(tài)。
[0019]圖2為枯草芽孢桿菌BS-KA2復(fù)紅染色后的光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)。
[0020]【具體實(shí)施方式】
實(shí)施例1對(duì)花生果腐病具有拮抗作用的細(xì)菌的分離、篩選
采集花生果腐病發(fā)病嚴(yán)重地塊中的健康花生植株根際土壤作為試驗(yàn)材料，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)從該土壤樣品中進(jìn)行細(xì)菌分離，在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行多次分離純化，得到純培養(yǎng)菌落后，以花生果腐病鐮刀菌為指示菌，采用對(duì)峙試驗(yàn)方法進(jìn)行拮抗性能高的菌株的篩選。
[0021]具體步驟:上述土壤樣品來(lái)自河北省、寧夏、山東、山西等地的染有花生果腐病的花生田中，將該土壤經(jīng)梯度稀釋后涂布于PB培養(yǎng)基中，于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。上述培養(yǎng)基根據(jù)“微生物培養(yǎng)基手冊(cè)”的記載制備得到，培養(yǎng)基配方為:牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，自來(lái)水10001111，？!17.2~7.4，1211:滅菌201^11后使用。待平板長(zhǎng)出菌落后，挑取不同形態(tài)的單菌落采用劃線分離法反復(fù)進(jìn)行分離純化，直到得到單菌落的純培養(yǎng)物，純化后的菌株保存于PB培養(yǎng)基斜面。
[0022]以花生果腐病鐮刀菌為指示菌，采用十字交叉法測(cè)定不同菌株對(duì)鐮刀菌生長(zhǎng)的抑制率。將篩選出的細(xì)菌菌株點(diǎn)接在距平板中央3cm處的4個(gè)角上，平板中央同時(shí)接種直徑5mm的活化的花生果腐病鐮刀菌菌塊，每個(gè)菌株重復(fù)三次，28°C恒溫培養(yǎng)5d，測(cè)量、記錄抑菌圈直徑的大小并計(jì)算平均抑制率。篩選出了對(duì)花生果腐病鐮刀菌拮抗作用最強(qiáng)的菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為CGMCC N0.8340。
[0023]實(shí)施例2拮抗菌株遺傳穩(wěn)定性的確定
對(duì)篩選出的拮抗作用最強(qiáng)的菌株在PB培養(yǎng)基上采用劃線法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)15代后，采用平板對(duì)峙法測(cè)定菌株對(duì)花生果腐病鐮刀菌的拮抗效果，以原始菌株為對(duì)照，該拮抗菌株經(jīng)過(guò)15代培養(yǎng)后與原始菌株具有相同的拮抗作用，說(shuō)明該拮抗菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，將抑菌效果穩(wěn)定的拮抗菌進(jìn)行PB培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，吸取菌液進(jìn)行_80°C甘油保存。
[0024]實(shí)施例3拮抗菌株的鑒定
根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中記載的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)篩得的保藏號(hào)為:CGMCC N0.8340進(jìn)行鑒定，菌落形態(tài)觀測(cè)是在PB培養(yǎng)基上進(jìn)行的，將菌株劃線接種后，于28°C恒溫培養(yǎng)24小時(shí)觀察菌落形態(tài)。保藏號(hào)為CGMCC N0.8340的菌株的菌落近圓形，邊緣嚙蝕狀，臍突狀突起，表面皺褶，顏色為乳白色，無(wú)光澤不透明，與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密。挑取培養(yǎng)24小時(shí)菌苔革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡的100倍油鏡下觀察。在顯微鏡下可以看到，保藏號(hào)為CGMCC N0.8340的菌株為芽孢桿菌，革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢位置中生或近中生，芽孢膨大，無(wú)伴孢晶體，單個(gè)出現(xiàn)。初步確定為芽孢桿菌。
[0025]16SrDNA鑒定:將保藏號(hào)為CGMCC N0.8340的菌株接種到PB培養(yǎng)液，28°C搖床培養(yǎng)24 h，采用天根生化科技(北京)有限公司基因組DNA提取試劑盒提取該菌株的基因組DNA，然后以提取的總 DNA 作為模板，以 27f(5^ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3')和 1492rC -TACGGCTA CCTTGTTA CGAC TT -3 ')引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μ?，反應(yīng)體系為:基因組 DNA 1 μ L, 10XPCR buffer 2.5 μ L，27f 引物 0.5 μ L，1492r 引物 0.5 μ L，dNTPs 2 μ L，Taq 酶(5U/ μ L) 0.25 μ L, ddH20 18.25 μ L。反應(yīng)條件為:94°C 預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，50°C退火 lmin，72°C 延伸 2min，循環(huán) 30 次；72°C 10 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，將PCR條帶大小約為1500bp的PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序后，將獲得的DNA序列(見(jiàn)序列I )，輸入GenBank，用Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比較分析。利用MEGA4.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。經(jīng)過(guò)序列分析顯示，保藏號(hào)為CGMCC N0.8340的菌株屬于枯草芽孢桿菌。
實(shí)施例4-7 枯草芽孢桿菌BS-KA2的田間應(yīng)用
將保藏號(hào)為CGMCC N0.8340枯草芽孢桿菌菌株接種到裝有1000mL PB液體培養(yǎng)基的3000mL三角瓶中，于28°C、180r/min的恒溫?fù)u床條件下培養(yǎng)36小時(shí)，離心獲得枯草芽孢桿菌的芽孢，用滅菌草炭吸附該菌的芽孢，使草炭中的終濃度為2X 108cfu/g~IOX 108cfu/g成為芽孢制劑。
[0026]在河北省靈壽縣和邢臺(tái)縣兩個(gè)花生的主要種植區(qū)的花生果腐病發(fā)病田中進(jìn)行芽孢桿菌劑的田間試驗(yàn)。將芽孢制劑和土 1:50的重量比稀釋后，在花生開(kāi)花期將該芽孢制劑溝施入花生根部土壤，使用劑量為Ikg/畝；常規(guī)對(duì)照使用常規(guī)劑量的化學(xué)農(nóng)藥高巧作為防治藥物，空白對(duì)照不施用防治藥物但施加與實(shí)施例組相同重量的草炭；每個(gè)處理3次重復(fù)，于花生收獲時(shí)調(diào)查花生果腐病的發(fā)病情況和產(chǎn)量。
[0027]調(diào)查方法:
采用5點(diǎn)取樣法，每個(gè)點(diǎn)取10穴花生，記錄總莢果重量、總莢果數(shù)、被害莢果數(shù)。
[0028]莢果分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):O級(jí):夾果完好，無(wú)被咅病斑；I級(jí):果皮部分受咅，果實(shí)完好；2級(jí):果皮全部受咅，果仁部分受害，部分完好；3級(jí):果皮果仁均受害，無(wú)完好果仁。統(tǒng)計(jì)花生各級(jí)被害數(shù)。
[0029]防效計(jì)算方法:
莢果發(fā)病率=被害莢果數(shù)/總莢果數(shù)X100
病情指數(shù)=Σ (被害果X該被害果級(jí)值)/ (總果數(shù)X最高級(jí)值)X 100防治效果(％)=(對(duì)照區(qū)病情指數(shù)一處理區(qū)病情指數(shù))/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)XlOO防治效果如表1所示，在河北的靈壽縣和邢臺(tái)市田間防病試驗(yàn)表明對(duì)花生果腐病的防治效果在60%以上。
[0030]表1不同菌劑施用對(duì)花生果腐病的防治效果
【權(quán)利要求】
1.一種枯草芽孢桿菌BS-KA2，該枯草芽孢桿菌于2013年10月15日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為=CGMCC N0.8340。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌BS-KA2，其特征在于其具有抑制鐮刀菌生長(zhǎng)的活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種枯草芽孢桿菌BS-KA2，其特征在于其用于防治花生由于感染鐮刀菌引起的果腐病的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種枯草芽孢桿菌BS-KA2，其特征在于其在制備用于防治花生果腐病的生物菌劑中的應(yīng)用。
5.一種用于防治鐮刀菌感染所致的花生果腐病的生物菌劑，其特征在于其含有枯草芽孢桿菌BS-KA2，其中所述的枯草芽孢桿菌BS-KA2于2013年10月15日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為=CGMCC N0.8340。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于防治鐮刀菌感染所致的花生果腐病的生物菌劑，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌BS-KA2的含量為2 X IO8-1OX IO8個(gè)/克菌劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于防治鐮刀菌感染所致的花生果腐病的生物菌劑，其特征在于所述的生物菌劑為芽孢`菌劑或芽孢與菌體的混合菌劑。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103789228SQ201310708367
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】賈振華, 劉昆昂, 黃亞麗, 宋聰, 馬宏, 趙芊, 黃媛媛, 宋水山, 李書(shū)生 申請(qǐng)人:河北省科學(xué)院生物研究所