檢測mpl基因515位點突變類型的方法和引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測MPL基因515位點突變類型的引物和方法：提取出樣本中的基因組DNA后，利用一對擴增引物MPL-F和MPL-R擴增待檢MPL515位點區(qū)段，獲得PCR擴增產(chǎn)物，隨后對PCR擴增產(chǎn)物進行純化獲得單鏈核苷酸模板，最后利用一條測序引物MPL-S進行焦磷酸測序，并將測序結(jié)果與預先確定的標準比對序列進行比對，從而確定MPL515位點突變類型。該方法將常規(guī)PCR擴增技術(shù)和焦磷酸測序技術(shù)相結(jié)合，可快速準確高通量地檢測MPL515位點突變類型，最低能夠檢出約1%的突變，適于臨床篩查。
【專利說明】檢測MPL基因515位點突變類型的方法和引物
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬生命科學和生物【技術(shù)領域】，特別涉及檢測MPL基因515位點突變類型的方法和引物。該方法將常規(guī)PCR擴增技術(shù)和焦磷酸測序技術(shù)相結(jié)合起來，方便快捷，靈敏度高，通量大，適于臨床篩查。
【背景技術(shù)】
[0002]骨髓增殖性腫瘤(MPN)是一種惰性腫瘤，是由造血前體細胞生長激活基因改變導致的多細胞系過度增殖而引起的。雖然對造血細胞的成熟影響較少，但是所有MPN都可通過不同的頻率轉(zhuǎn)化成急性白血病。由于在MPN中，一系列的染色體重排及突變激活了酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinases, PTKs)及其下游信號轉(zhuǎn)導通路,使得腫瘤克隆性的增殖大大超越了正常造血細胞。因此涉及PTKs的分子異常已經(jīng)廣泛地應用于臨床參考、分類、微小殘留病灶的監(jiān)測等，MPL基因即是其中一種。
[0003]MPL基因(myeloproliferative leukemia gene),編碼血小板生成素受體,促進細胞的生長、增殖及分化。該受體參與調(diào)控巨核細胞的增殖和血小板的生成；此外研究還表明其對造血干細胞的維護、更新和調(diào)節(jié)也起著重要的作用。2006年，Daniela Pietra等在骨髓纖維化伴骨髓性化生的患者中檢測到了 MPL515位點發(fā)生突變，突變結(jié)果為MPL W515L。而后的MPL515位點突變篩查中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性血小板增多癥(ET)及原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)患者的MPL515位點突變發(fā)生率分別為1%和5%。
[0004]研究發(fā)現(xiàn)伴MPL W515L/K的ET患者比MPL未突變患者具有年齡高、血小板計數(shù)高以及隨訪期間動脈血栓發(fā)生率顯著增高的特點。而高齡、高白細胞計數(shù)、高血紅蛋白水平及過往的血栓形成史都預示著ET生存期較差。因此，MPL的突變狀態(tài)不失為引起醫(yī)生了解和關(guān)注患者病情的一個分子信號。
`[0005]目前用于MPL515位點突變檢測或篩查的方法主要有=Sanger測序和高靈敏度溶解曲線法(High Resolution Melt, HRM)。Sanger測序法目前是臨床應用于檢測基因突變極其普遍的一種手段，測序檢測結(jié)果堪稱金標準，但是其靈敏度不高，只能檢出突變比例大于20%的突變樣本。而HRM是廣泛用于篩查基因突變的一種新方法，其靈敏度高，能檢出小于1%甚至0.1%的突變，但是無法區(qū)分待檢區(qū)段的突變類型。只要在引物設計區(qū)段內(nèi)，哪怕不是待鑒定位置發(fā)生缺失、插入還是點突變都會錯誤地顯示出突變的結(jié)果。因此，人們需要一種靈敏度和準確度高，同時能明確檢測突變類型的篩查方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]鑒于目前篩查檢測基因MPL515位點突變方法的不足，本發(fā)明提供了用于檢測樣本中基因MPL515位點突變類型的引物，所述引物包括用于擴增待檢MPL515位點區(qū)段的一對擴增引物MPL-F和MPL-R，其核苷酸序列為:
[0007]MPL-F:5’ -CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
[0008]MPL-R:5’ -biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’。[0009]進一步地，所述引物還包括一條用于焦磷酸測序的測序引物MPL-S，其核苷酸序列為:
[0010]MPL-S: 5，-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3，。
[0011]進一步地，依據(jù)所述測序引物能獲得MPL515位點野生型和各種突變型的測序結(jié)果序列:
[0012]MPL W515 野生型:TGGCAGTTT
[0013]MPL W515L 純合突變型:TTGCAGTTT
[0014]MPL W515K 純合突變型:AAGCAGTTT
[0015]MPL W515A 純合突變型:GCGCAGTTT
[0016]MPL W515R 純合突變型:CGGCAGTTT
[0017]MPL W515S 純合突變型:TCGCAGTTT
[0018]MPL515W/L 雜合突變型:TGCCAAGGTTTTTT
[0019]MPL515W/K 雜合突變型:TGGACGACGATTTG
[0020]MPL515W/R 雜合突變型:CTGGGGCCAAGGTTTTTT
[0021]MPL515W/S 雜合突變型:TGGCGACGATTTG`[0022]MPL515W/A 雜合突變型:TGCGACGATTTG。
[0023]進一步地，依據(jù)所述測序引物在基因MPL515中的結(jié)合位置和所述測序結(jié)果序列，確定標準比對序列，所述標準比對序列核苷酸序列如下:
[0024]MPL W515 野生型=TG2CAGT3
[0025]MPL W515L 純合突變型=T2GCAGT3
[0026]MPL W515K 純合突變型:A2GCAG
[0027]MPL W515A 純合突變型:GCGCAG
[0028]MPL W5I5R 純合突變型:CG2CAGT3
[0029]MPL W515S 純合突變型:TCGCAG
[0030]MPL515W/L 雜合突變型:tgC2A2G2T6
[0031]MPL515W/K 雜合突變型:TG2aCgAcGaT3g
[0032]MPL515W/R 雜合突變型=CtG4C2A2G2T6
[0033]MPL5I5WZS 雜合突變型:tG2cgAcGaT3g
[0034]MPL5I5WA 雜合突變型:TgcgAcGaT3g
[0035]其中C或c、T或t、G或g、A或a代表4種堿基；堿基右下角數(shù)字代表峰高比例。
[0036]本發(fā)明還提供了一種檢測基因MPL515位點突變類型的方法，包括以下步驟:
[0037](I)提取血液樣本中的DNA ；
[0038](2)利用一對擴增引物MPL-F和MPL-R對(I)中的DNA進行PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物；
[0039](3)對(2)中的擴增產(chǎn)物進行純化，得到單鏈核苷酸模板；
[0040](4)利用測序引物MPL-S對(3)中的單鏈核苷酸模板進行焦磷酸測序，獲得焦磷酸測序結(jié)果；
[0041](5)將⑷中的焦磷酸測序結(jié)果與標準比對序列進行比對，確定基因MPL515位點的突變類型，其中，[0042]MPL-F:5’ -CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
[0043]MPL-R:5’ -biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’
[0044]MPL-S:5，-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3，。
[0045]進一步地，對所述步驟(5)所述的比對過程如下:
[0046](I)先忽略峰高比例通讀測序圖中的序列，找出符合的標準比對序列，若只有一條符合，則該標準比對序列對應的突變類型即為所測到的突變類型；
[0047](2)若有多條符合，再根據(jù)標準比對序列中大寫字母表示的堿基對應的峰高比例，找出峰高比例相符的序列，其對應的突變類型即為所測到的突變類型。
[0048]進一步地，所述標準比對序列為:
[0049]MPL W515 野生型=TG2CAGT3
[0050]MPL W515L 純合突變型=T2GCAGT3
[0051]MPL W515K 純合突變型:A2GCAG
[0052]MPL W515A 純合突變型:GCGCAG
[0053]MPL W5I5R 純合突變型:CG2CAGT3
[0054]MPL W515S 純合突變型:TCGCAG
[0055]MPL515W/L 雜合`突變型:tgC2A2G2T6
[0056]MPL5I5WZK 雜合突變型:TG2aCgAcGaT3g
[0057]MPL515W/R 雜合突變型=CtG4C2A2G2T6
[0058]MPL5I5WZS 雜合突變型:tG2cgAcGaT3g
[0059]MPL5I5WA 雜合突變型:TgcgAcGaT3g
[0060]其中C或c、T或t、G或g、A或a代表4種堿基；堿基右下角數(shù)字代表峰高比例。
[0061]進一步地，步驟⑵中的PCR擴增條件為:94°C預變性5min ;98°C變性10s，56°C退火25s，68°C延伸30s, 40個循環(huán)。
[0062]本發(fā)明還提供了一種檢測基因MPL515位點突變類型的試劑盒，其包括樣本DNA提取試劑、PCR擴增體系、單鏈核苷酸模板純化系統(tǒng)和焦磷酸測序體系，所述PCR擴增體系包括用于擴增待檢MPL515位點區(qū)段的一對擴增引物MPL-F和MPL-R，所述焦磷酸測序體系包括一條用于焦磷酸測序的測序引物MPL-S，其中，
[0063]MPL-F:5’ -CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
[0064]MPL-R:5’ -biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’
[0065]MPL-S:5’ -GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’。
[0066]進一步地，所述PCR擴增體系還包括2 XKOD Buffer, KOD酶、dNTP和去離子水。
[0067]進一步地，所述紅細胞裂解液由NH4C1、NaHC03、EDTA-Na2和ddH20配置而成。
[0068]進一步地，所述試劑盒還提供判別MPL515位點焦磷酸測序結(jié)果為野生型、純合突變型和雜合突變型的標準比對序列:
[0069]MPL W515 野生型=TG2CAGT3
[0070]MPL W515L 純合突變型=T2GCAGT3
[0071]MPL W515K 純合突變型:A2GCAG
[0072]MPL W515A 純合突變型:GCGCAG
[0073]MPL W5I5R 純合突變型:CG2CAGT3[0074]MPL W515S 純合突變型:TCGCAG
[0075]MPL515W/L 雜合突變型:tgC2A2G2T6
[0076]MPL5I5WZK 雜合突變型:TG2aCgAcGaT3g
[0077]MPL515W/R 雜合突變型=CtG4C2A2G2T6
[0078]MPL5I5WZS 雜合突變型:tG2cgAcGaT3g
[0079]MPL5I5WA 雜合突變型:TgcgAcGaT3g
[0080]其中C或c、T或t、G或g、A或a代表4種堿基；堿基右下角數(shù)字代表峰高比例。
[0081]本發(fā)明的有益效果是，該方法將常規(guī)PCR擴增技術(shù)和焦磷酸測序技術(shù)相結(jié)合起來，靈敏度高，最低能夠檢出約1%的突變，同時能明確被檢測樣本的MPL515突變類型，適于臨床篩查。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0082]圖1第一個待檢血液樣本進行篩查的焦磷酸測序圖(MPL515W/A雜合突變型)及用Sanger測序法驗證的測序圖
[0083]圖2第二個待檢血液樣本進行篩查的焦磷酸測序圖(MPL515W/L雜合突變型)及用Sanger測序法驗證的測序圖
[0084]圖3第三個待檢血液樣本進行篩查的焦磷酸測序圖(MPL515W/K雜合突變型)及用Sanger測序法驗證的測序圖`
[0085]圖4第四個待檢血液樣本進行篩查的焦磷酸測序圖(MPL W515野生型)及用Sanger測序法驗證的測序圖
【具體實施方式】
[0086]下面結(jié)合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。應當注意的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0087]實施例1:檢測基因MPL515位點突變類型的引物和試劑盒
[0088]用于檢測樣本中基因MPL515位點突變類型的引物，所述引物包括用于擴增待檢MPL515位點區(qū)段的一對擴增引物MPL-F和MPL-R，其核苷酸序列為:
[0089]MPL-F:5’ -CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
[0090]MPL-R:5’ -biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’。
[0091]優(yōu)選地，所述引物還包括一條用于焦磷酸測序的測序引物MPL-S，其核苷酸序列為:
[0092]MPL-S:5，-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3，。
[0093]優(yōu)選地，所述測序引物能獲得MPL515位點野生型和各種突變型的測序結(jié)果序列:
[0094]MPL W515 野生型:TGGCAGTTT
[0095]MPL W515L 純合突變型:TTGCAGTTT
[0096]MPL W515K 純合突變型:AAGCAGTTT
[0097]MPL W515A 純合突變型:GCGCAGTTT
[0098]MPL W515R 純合突變型:CGGCAGTTT[0099]MPL W515S 純合突變型:TCGCAGTTT
[0100]MPL515W/L 雜合突變型:TGCCAAGGTTTTTT
[0101]MPL515W/K 雜合突變型:TGGACGACGATTTG
[0102]MPL515W/R 雜合突變型:CTGGGGCCAAGGTTTTTT
[0103]MPL515W/S 雜合突變型:TGGCGACGATTTG
[0104]MPL515W/A 雜合突變型:TGCGACGATTTG。
[0105]一種檢測基因MPL515位點突變類型的試劑盒，其包括樣本DNA提取試劑、PCR擴增體系、單鏈核苷酸模板純化系統(tǒng)和焦磷酸測序體系，所述PCR擴增體系包括用于擴增待檢MPL515位點區(qū)段的一對擴增引物MPL-F和MPL-R，所述焦磷酸測序體系包括一條用于焦磷酸測序的測序引物MPL-S，其序列為:
[0106]MPL-F:5’ -CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
[0107]MPL-R:5’ -biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’
[0108]MPL-S: 5，-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3，。
[0109]優(yōu)選地，PCR擴增體系還包括2 X KOD Buffer、KOD酶、dNTP和去離子水。
[0110]優(yōu)選地，紅細胞裂解液由NH4Cl、NaHC03> EDTA-Na2和ddH20配置而成。
[0111]優(yōu)選地，該試劑盒`還提供判別MPL515位點焦磷酸測序結(jié)果為野生型、純合突變型和雜合突變型的標準比對序列，如下所示:
[0112]MPL W515 野生型=TG2CAGT3
[0113]MPL W515L 純合突變型:T2GCAGT3
[0114]MPL W515K 純合突變型:A2GCAG
[0115]MPL W515A 純合突變型:GCGCAG
[0116]MPL W515R 純合突變型:CG2CAGT3
[0117]MPL W515S 純合突變型:TCGCAG
[0118]MPL515W/L 雜合突變型:tgC2A2G2T6
[0119]MPL515W/K 雜合突變型:TG2aCgAcGaT3g
[0120]MPL515W/R 雜合突變型=CtG4C2A2G2T6
[0121]MPL515W/S 雜合突變型:tG2cgAcGaT3g
[0122]MPL5I5WA 雜合突變型:TgcgAcGaT3g
[0123]其中C或C、T或t、G或g、A或a代表4種堿基；堿基右下角數(shù)字代表峰高比例。
[0124]標準比對序列確定過程如下所示:
[0125](I)根據(jù)測序引物 MPL-S:5’ -GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’ 在 MPL 基因序列(序列NG007525)中所在的位置，及焦磷酸測序時使用的SQA測序模式及設置的程序4(CTGA)，推斷出MPL515位點野生型和各種純合突變型的測序結(jié)果序列，其堿基序列為:
[0126]MPL W515 野生型:TGGCAGTTT
[0127]MPL W515L 純合突變型:TTGCAGTTT
[0128]MPL W515K 純合突變型:AAGCAGTTT
[0129]MPL W515A 純合突變型:GCGCAGTTT
[0130]MPL W515R 純合突變型:CGGCAGTTT
[0131]MPL W515S 純合突變型:TCGCAGTTT。[0132](2)根據(jù)(I)中的MPL515位點野生型和各種突變型的測序結(jié)果序列，結(jié)合焦磷酸測序的原理及焦磷酸測序時使用的SQA測序模式及設置的程序4 (CTGA)，推斷分析出雜合突變型的測序結(jié)果序列為:
[0133]MPL515W/L 雜合突變型:TGCCAAGGTTTTTT
[0134]MPL515W/K 雜合突變型:TGGACGACGATTTG
[0135]MPL515W/R 雜合突變型:CTGGGGCCAAGGTTTTTT
[0136]MPL515W/S 雜合突變型:TGGCGACGATTTG
[0137]MPL515W/A 雜合突變型:TGCGACGATTTG
[0138](3)根據(jù)焦磷酸測序原理及峰圖特征，結(jié)合(I)中的MPL基因野生型和各種突變型的測序結(jié)果序列，以及⑵中的雜合突變型的測序結(jié)果序列，推斷分析MPL基因515位點焦磷酸測序圖譜的特征，編制標準比對序列。
[0139]實施例2:樣本DNA的提取
[0140]使用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)。取300 μ I待檢全血樣本加入1.5ml離心管中，加入900ul紅細胞裂解液顛倒混勻，1000Orpm離心lmin，棄上清；加200uL緩沖液GA，振蕩至徹底混勻；加入20 μ I蛋白酶K溶液，混勻；加入200 μ I緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置lOmin。再加200 μ I無水乙醇，混勻，將溶液加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30s,棄廢液；向CB3中加入500 μ I緩沖液GD, 12000rpm離心30s,棄廢液;向CB3中加入600 μ I漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄廢液；重復一次。再將CB3放回收集管中，12000rpm空離心2min ;并`將CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μ I TE，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中，所得即為樣本DNA。
[0141]IOX 紅細胞裂解液配方為:NH4C182g，NaHC038.4g，EDTA_Na23.72g，加 ddH20 定容至 1000ml0
[0142]實施例3:PCR擴增
[0143]按如下試劑及試劑量配置PCR擴增體系，其中引物MPL-F(10 μ Μ)和MPL-R(10 μ Μ)各 Iul ；2XK0D Buffer20ul, KOD 酶(lU/ul) 0.8ul，dNTP (2mM) 6ul (東洋紡(上海)生物科技有限公司)；加去離子水9.2ul ;最后加DNA模板2ul。其擴增程序如下:94°C 5min ;98°C 10s,58°C 20s, 68°C 30s，共 40 個循環(huán)；68°C 2min。
[0144]實施例4:單鏈核苷酸模板的制備
[0145]先將 Streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare LifeSciences)和Binding buffer (Qiagen)以3:47混勻。再在PCR產(chǎn)物中加入上述混合液40ul。混勻后,用純化系統(tǒng)(Vacuum prep workstation)對其進行純化,得到的即為5’端用生物素(biotin)標記的單鏈核苷酸模板；并將純化的單鏈核苷酸模板收集在包含2ulMPL-S (10μΜ)測序引物的總體系為 45ul 的 Annealing buffer (Qiagen)中。
[0146]實施例5:焦磷酸測序體系
[0147]將實施例4中制備好的溶液放置于焦磷酸設備中，開啟PyroMark ID Systems設備(Qiagen)，打開測序軟件PyroMarkTM ID,選擇SQA模式，設置程序為:4 (CTGA)，這樣測序軟件會根據(jù)程序中dNTP加樣順序及形成的峰型確定測序結(jié)果，即峰圖。[0148]將測序結(jié)果與標準比對序列進行比對，比對判斷標準為:①先忽略峰高比例通讀測序圖中的序列，找出符合的標準比對序列，若只有一條符合，則該標準比對序列對應的突變類型即為所測到的突變類型若有多條符合，再根據(jù)標準比對序列中大寫字母表示的堿基對應的峰高比例，找出峰高比例相符的序列，其對應的突變類型即為所測到的突變類型。
[0149]檢測系統(tǒng)根據(jù)程序設定，以C — T — G — A的順利加入不同的dNTP，循環(huán)加樣4次。檢測系統(tǒng)自動監(jiān)測并收集信號峰，得到測序峰圖。
[0150]實施例6:第一個待檢全血樣本檢測
[0151]對第一個待檢全血樣本按實施例2-5所述進行DNA提取、PCR擴增和單鏈模板制備及焦磷酸測序檢測，得到的測序峰圖如圖1-A，得到的測序結(jié)果序列為:tgCgaCgatg。
[0152]依據(jù)第一個待檢全血樣本的檢測結(jié)果和比對判斷標準，先忽略峰高比例通讀序列，找出符合的DNA堿基比對序列有兩條:tG2cgAcGaT3g (MPL515W/S)和TgcgAcGaT3g(MPL515W/A)。再根據(jù)比對序列大寫字母表示的堿基對應的峰高比例，tG2cgAcGaT3g第2位的G和倒數(shù)第3位的T，峰高比例應為2:3，待檢樣本的序列峰圖接近1:1，明顯不符，排除為MPL515W/S突變的可能；而TgcgAcGaT3g第I位的T和倒數(shù)第2位的T，峰高比例應為1:3，第一個待檢全血樣本的序列峰圖接近1:3，故為MPL515W/A雜合突變型。經(jīng)Sanger測序法檢測驗證，確實為MPL515W/A雜合突變型，見圖1-B。
[0153]實施例7:第二個待檢全血樣本檢測
[0154]對第二個待檢全血樣本按實施例2-5所述進行DNA的提取，PCR擴增，單鏈模板的制備及焦磷酸測序檢測，得到的測序峰圖如圖2-A，得到的測序結(jié)果序列為:tgcagt。根據(jù)比對判斷標準，先忽略峰高比`例通讀序列，找出符合的DNA堿基比對序列有三條=TG2CAGT3(MPL W515 野生型)、T2GCAGT3 (MPL W515L)和 tgC2A2G2T6 (MPL515W/L)。再根據(jù)比對序列大寫字母表示的堿基對應的峰高比例，TG2CAGT3第I位的T和第2位的G，峰高比例應為1:2，T2GCAGT3第I位的T和第2位的G，峰高比例應為2:1，待檢樣本的序列峰圖接近1:1，明顯不符，排除為MPL W515野生型和MPL W515L突變的可能；而tgC2A2G2T6第3位的C、第4位的A和倒數(shù)I位的T，峰高比例應為2:2:6即1:1:3，待檢樣本的序列峰圖接近1:1:3，故為MPL515W/L雜合突變型。經(jīng)Sanger測序法檢測驗證，確實為MPL515W/L雜合突變型，見圖 2-B。
[0155]實施例8:第三個待檢全血樣本檢測
[0156]對第三個待檢全血樣本按實施例2-5所述進行DNA的提取，PCR擴增，單鏈模板的制備及焦磷酸測序檢測，得到的測序峰圖如圖3-A，得到的測序結(jié)果序列為:tgaCgaCgatg。根據(jù)比對判斷標準，先忽略峰高比例通讀序列，找出符合的DNA堿基比對序列只有一條:TG2aCgAcGaT3g (MPL515W/K)。故待檢樣本即為MPL515W/K雜合突變型。經(jīng)Sanger測序法檢測驗證，確實為MPL515W/K雜合突變型，見圖3-B。
[0157]實施例9:第四個待檢全血樣本檢測
[0158]對第四個待檢全血樣本按實施例2-5所述進行DNA的提取，PCR擴增，單鏈模板的制備及焦磷酸測序檢測，得到的測序峰圖如圖4-A，得到的測序結(jié)果序列為:tgcagt。根據(jù)結(jié)果判斷標準，先忽略峰高比例通讀序列，找出符合的DNA堿基比對序列有三條=TG2CAGT3(MPL W515 野生型)、T2GCAGT3 (MPL W515L)和 tgC2A2G2T6 (MPL515W/L)。再根據(jù)比對序列大寫字母表示的堿基對應的峰高比例，TG2CAGT3第I位的T和第2位的G，峰高比例應為1:2，待檢樣本的序列峰圖也接近1:2，故為MPL W515野生型。而T2GCAGT3第I位的T和第2位的G，峰高比例應為2:1 AgC2A2G2T6第3位的C、第4位的A和倒數(shù)I位的T，峰高比例應為
2:2:6，均與待檢樣本峰圖不符。經(jīng)Sanger測序法檢測驗證，確實為MPL W515野生型，見圖4_Bo`
【權(quán)利要求】
1.用于檢測樣本中基因MPL515位點突變類型的引物，其特征在于，所述引物包括用于擴增待檢MPL 515位點區(qū)段的一對擴增引物MPL-F和MPL-R，其核苷酸序列為:
MPL-F:5’ -CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
MPL-R:5’ -biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’。
2.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物還包括一條用于焦磷酸測序的測序引物MPL-S，其核苷酸序列為:
MPL-S:5’ -GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’。
3.如權(quán)利要求2所述的引物，其特征在于，依據(jù)所述測序引物能獲得MPL515位點野生型和各種突變型的測序結(jié)果序列: MPL W515 野生型:TGGCAGTTT MPL W515L 純合突變型:TTGCAGTTT MPL W515K 純合突變型:AAGCAGTTT MPL W515A 純合突變型:GCGCAGTTT MPL W515R 純合突變型:CGGCAGTTT
MPL W515S 純合突變型:TCGCAGTTT MPL 515W/L 雜合突變型:TGCCAAGGTTTTTT MPL 515W/K 雜合突變型:TGGACGACGATTTG MPL 515W/R 雜合突變型:CTGGGGCCAAGGITITTT MPL 515W/S 雜合突變型:TGGCGACGATTTG MPL 515W/A 雜合突變型:TGCGACGAITTG。
4.如權(quán)利要求3所述的引物，其特征在于，依據(jù)所述測序引物在基因MPL515中的結(jié)合位置和所述測序結(jié)果序列，確定標準比對序列，所述標準比對序列核苷酸序列如下: MPL W515 野生型:TG2CAGT3 MPL W515L 純合突變型:T2GCAGT3 MPL W515K純合突變型:A2GCAG MPL W515A純合突變型:GCGCAG MPL W515R 純合突變型:CG2CAGT3 MPL W515S純合突變型:TCGCAG MPL 515W/L 雜合突變型:tgC2A2G2T6 MPL 515W/K 雜合突變型:TG2aCgAcGaT3g MPL 515W/R 雜合突變型:CtG4C2A2G2T6 MPL 515W/S 雜合突變型:tG2cgAcGaT3g MPL 515W/A 雜合突變型:TgcgAcGaT3g 其中C或c、T或t、G或g、A或a代表4種堿基；堿基右下角數(shù)字代表峰高比例。
5.一種檢測基因MPL 515位點突變類型的方法，包括以下步驟: (1)提取血液樣本中的DNA； (2)利用一對擴增引物MPL-F和MPL-R對(I)中的DNA進行PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物； (3)對(2)中的擴增產(chǎn)物進行純化，得到單鏈核苷酸模板； (4)利用測序引物MPL-S對(3)中的單鏈核苷酸模板進行焦磷酸測序，獲得焦磷酸測序結(jié)果; (5)將⑷中的焦磷酸測序結(jié)果與標準比對序列進行比對，確定基因MPL 515位點的突變類型，其特征在于，
MPL-F:5’ -CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’
MPL-R:5’ -biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’
MPL-S:5’ -GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，對所述步驟(5)所述的比對過程如下: (1)先忽略峰高比例通讀測序圖中的序列，找出符合的標準比對序列，若只有一條符合，則該標準比對序列對應的突變類型即為所測到的突變類型； (2)若有多條符合，再根據(jù)標準比對序列中大寫字母表示的堿基對應的峰高比例，找出峰高比例相符的序列,其對應的突變類型即為所測到的突變類型。
7.如權(quán)利要求所述5的方法，其特征在于，所述標準比對序列為: MPL W515 野生型:TG2CAGT3 MPL W515L 純合突變型:T2GCAGT3 MPL W515K純合突變型:A2GCAG MPL W515A純合突變型:GCGCAG MPL W515R 純合突變型:CG2CAGT3 MPL W515S純合突變型:TCGCAG` MPL 515W/L 雜合突變型:tgC2A2G2T6 MPL 515W/K 雜合突變型:TG2aCgAcGaT3g MPL 515W/R 雜合突變型:CtG4C2A2G2T6 MPL 515W/S 雜合突變型:tG2cgAcGaT3g MPL 515W/A 雜合突變型:TgcgAcGaT3g 其中C或c、T或t、G或g、A或a代表4種堿基；堿基右下角數(shù)字代表峰高比例。
8.如權(quán)利要求所述5的方法，其特征在于，步驟(2)中的PCR擴增條件為:94°C預變性5min ;98°C變性 10s，56。。退火 25s，68。。延伸 30s, 40 個循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103757100SQ201310712442
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】鄒媛, 朱良俊, 杜翠, 陳紅梅, 夏成青 申請人:鄭州艾迪康醫(yī)學檢驗所（普通合伙）