具有氨氮降解能力的菌合劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有氨氮降解能力的菌合劑，它是由枯草芽孢桿菌CCTCC?M2013490與類球紅細(xì)菌CCTCC?M2013491按細(xì)菌數(shù)1：1的混合物。上述具有氨氮降解能力的菌合劑在降解水體中氨氮的應(yīng)用以及在治理水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中的應(yīng)用。本發(fā)明的一種具有氨氮降解能力的菌合劑，可迅速有效的降低水體中的硝酸鹽、亞硝酸鹽含量，可以改善由于污染造成的水質(zhì)渾濁問題，水質(zhì)由渾變清，具有很強(qiáng)的凈化水質(zhì)功能，具有較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)素降解，使水產(chǎn)類動(dòng)物對(duì)飼料的吸收利用更加充分。
【專利說明】具有氨氮降解能力的菌合劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有氨氮降解能力的菌合劑及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，由于工業(yè)污水排放、畜禽業(yè)養(yǎng)殖污水排放、水產(chǎn)養(yǎng)殖污水排放、生活污水排放等引起的水體氨氮污染有加重的趨勢(shì)，不僅會(huì)引起水體中藻類及其它微生物大量繁殖，形成富營(yíng)養(yǎng)化污染，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起水中溶解氧的大量消耗，導(dǎo)致水生動(dòng)物大量死亡，造成生態(tài)破壞和一定程度的經(jīng)濟(jì)損失。在氨的致死、半致死濃度下，氨可引起養(yǎng)殖動(dòng)物的腎、脾、甲狀腺和血液組織的變化；亞硝酸鹽對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物有很強(qiáng)的毒性，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育。水體中存在的氨氮對(duì)養(yǎng)殖的水產(chǎn)品具有一定的毒性，影響了水產(chǎn)品的品質(zhì)，限制了水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展，特別是隨著高密度工廠化養(yǎng)殖技術(shù)的推廣，氨氮污染治理的需求日益突出。
[0003]國(guó)內(nèi)外大量研究表明，硝化細(xì)菌、光合細(xì)菌、芽孢桿菌及諾卡氏菌等均對(duì)養(yǎng)殖水體中的氨氮具有較強(qiáng)的去除能力，且光合細(xì)菌和硝化細(xì)菌已在實(shí)踐中取得良好效果[4]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供具有氨氮降解能力的菌合劑。
[0005] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述菌合劑的應(yīng)用。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]一種具有氨氮降解能力的菌合劑，它是由枯草芽孢桿菌CCTCC No:M2013490與類球紅細(xì)菌CCTCC No:M2013491按細(xì)菌數(shù)1:1的混合物。
[0008]本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌是發(fā)明人于2012年8月從江蘇省南京市排污口淤泥中分離出來的菌株，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和PCR鑒定，確認(rèn)為枯草芽孢桿菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，現(xiàn)已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號(hào):CCTCC No:M2013490,保藏日期:2013年10月23日。
[0009]本發(fā)明所述的類球紅細(xì)菌是發(fā)明人于2012年8月從江蘇省南京市污水處理廠活性污泥中分離出來的菌株，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和PCR鑒定，確認(rèn)為類球紅細(xì)菌，其分類命名為類球紅細(xì)菌(Rhodobacter Sphaeroides),現(xiàn)已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號(hào)=CCTCC No:M2013491，保藏日期:2013年10月23日。
[0010]類球紅細(xì)菌是一種光合細(xì)菌，它與枯草芽孢桿菌均能分解水體有機(jī)物、控制水體氮含量，起到凈化水質(zhì)的作用，并且無污染、高效率，是比較理想的凈化水質(zhì)的生物制劑。然而在將其應(yīng)用之前，需要進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)來確定其最佳的使用濃度，目的是為了用最低的投資成本來達(dá)到最好的凈化效果。[0011]上述具有氨氮降解能力的菌合劑在降解水體中氨氮的應(yīng)用。
[0012]上述具有氨氮降解能力的菌合劑在治理水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中的應(yīng)用。
[0013]有益效果:本發(fā)明的一種具有氨氮降解能力的菌合劑，可迅速有效的降低水體中的硝酸鹽、亞硝酸鹽含量，可以改善由于污染造成的水質(zhì)渾濁問題，水質(zhì)由渾變清，具有很強(qiáng)的凈化水質(zhì)功能，具有較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)素降解，使水產(chǎn)類動(dòng)物對(duì)飼料的吸收利用更加充分。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1水樣中氨氮的質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0015]圖2類球紅細(xì)菌氨氮降解的濃度曲線圖。
[0016]圖3枯草芽孢桿菌氨氮降解的濃度曲線圖。
[0017]圖4最佳組合比例氨氮降解的濃度曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0019]實(shí)施例1:
[0020]I材料與儀器
`[0021]1.1菌株來源
[0022]本實(shí)驗(yàn)所需的材料是從污水處理廠活性污泥中篩選分離得到一株類球紅細(xì)菌CCTCC No:M2013491，配合常用細(xì)菌——枯草芽孢桿菌CCTCC No:M2013490，制備成類球紅細(xì)菌合劑。實(shí)驗(yàn)采用的類球紅細(xì)菌菌株，保存在LB固體培養(yǎng)基斜面上，保藏于4°C冰箱。
[0023]1.2培養(yǎng)基
[0024]1.2.1LB液體培養(yǎng)基
[0025]蛋白胨10g，酵母粉 lg, NaCLlOg，蒸餾水 1000mL, PH7.2-7.4，121°C滅菌 30 分鐘，4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0026]L2.2LB固體培養(yǎng)基
[0027]蛋白胨10g，酵母粉 lg, NaCLlOg，蒸餾水 lOOOmL，瓊脂 0.42g，PH7.2-7.4，121。。滅菌30分鐘，4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0028]1.2.3氨氮培養(yǎng)基[1](模擬水體)
[0029]葡萄糖5.0g, (NH4)2SO40.25g, NaCLl.0g，K2HP040.5g,MgSO4.7Η200.25g，水 1000mL,pH值7.0，其中氨氮含量約為50mg/L，再取5mL稀釋分裝于50mL細(xì)胞培養(yǎng)管中，121°C條件下滅菌15min,待用。
[0030]1.3清洗溶液:
[0031]氫氧化鉀100gjjC IOOmL,乙醇 900mL。
[0032]1.4氨氮測(cè)定所需試劑
[0033]蒸餾水、顯色劑(水楊酸-酒石酸鉀鈉溶液)、亞硝基鐵氰化鈉溶液，P =10g/L、次氯酸鈉。若水楊酸未全部溶解可加入數(shù)毫升的氫氧化鈉。[0034]1.5主要儀器、設(shè)備
[0035]YXQ-LS-755II立式壓力滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)
[0036]SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)
[0037]MVS-1漩渦混合器(北京東方開物科學(xué)器材有限公司)
[0038]立式恒溫振蕩箱IS-RDV3
[0039]可見分光光度計(jì):10~30_比色皿
[0040]滴瓶:其滴管滴出液體積，20滴相當(dāng)于ImL。
[0041]實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿:所有玻璃器皿均應(yīng)用清洗溶液(2.3)仔細(xì)清洗,然后用水沖洗干凈。
[0042]2 方法
[0043]2.1菌株的活化
[0044]用接種環(huán)挑取類球紅細(xì)菌和枯草芽孢桿菌菌株分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，35°C，120rpm，搖床培養(yǎng)18_20h后，4°C保存待用。
[0045]2.2活菌計(jì)數(shù)(傾注平板法)
[0046]用生理鹽水逐級(jí)稀釋，選取最后2個(gè)適宜的稀釋梯度進(jìn)行平板傾注，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行，培養(yǎng)24h后進(jìn)行活菌記數(shù)。
[0047]2.3菌株的接種[2]
[0048]2.3.1類球紅細(xì)菌:
[0049]將活化的類球紅細(xì)菌菌株按104_105CFU/ml的活菌量加至氨氮培養(yǎng)基中，35°C，120rpm,分別間隔 O，12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h，120h 進(jìn)行抽樣，最后取其平均值。
[0050]2.3.2枯草芽孢桿菌:
[0051]將活化的枯草芽孢桿菌菌株按104_105CFU/ml的活菌量加至氨氮培養(yǎng)基中，35°C，120印111，分別間隔0，1211，24卜"以此類推抽樣5天(方法同2.3.1)，最后取其平均值。2.3.3類球紅細(xì)菌合劑:
[0052]將活化的類球紅細(xì)菌和枯草芽孢桿菌菌株按5種不同的比例混合，兩種活菌數(shù)加起來在(104-105CFU/ml)之間，每組設(shè)兩個(gè)平行，加至氨氮培養(yǎng)基中，35°C，120rpm,分別間隔0，1211，24&..以此類推抽樣5天(方法同2.3.1)，最后取其平均值。
[0053]2.4合劑中組合比例的氨氮測(cè)定[3]
[0054]在堿性介質(zhì)(pH=ll.7)和亞硝基鐵氰化鈉存在下，水中的氨、銨離子與水楊酸鹽和次氯酸離子反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，在697nm處用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度。
[0055]將類球紅細(xì)菌和枯草芽孢桿菌按五種不同的比例混合:3: 1，2: 1，1: 1，1: 2，I: 3，最后根據(jù)結(jié)果選取一個(gè)最佳混合比例。每次抽樣后用水楊酸分光光度法[3]檢測(cè)氨氮的濃度。
[0056]2.5結(jié)果的計(jì)算(用曲線圖表示)
[0057]水樣中氨氮的質(zhì)量濃度按下式計(jì)算:
[0058]P N= (As — Ab — a) XD / bXV
[0059]式中:P N——水樣中氨氮的質(zhì)量濃度(以N計(jì))mg/L ；
[0060]As——樣品的吸光度(波長(zhǎng)為697nm處)；[0061]Ab——空白試驗(yàn)的吸光度(蒸餾水作參比)；
[0062]a—校準(zhǔn)曲線的截距；
[0063]b——校準(zhǔn)曲線的斜率；
[0064]V——所取水樣的體積；
[0065]D——水樣的稀釋倍數(shù)。
[0066]表1水楊酸分光光度法:標(biāo)準(zhǔn)氨氮濃度在波長(zhǎng)697納米處的值
【權(quán)利要求】
1.一種具有氨氮降解能力的菌合劑，其特征在于，它是由枯草芽孢桿菌CCTCC No:M2013490與類球紅細(xì)菌CCTCC No:M2013491按細(xì)菌數(shù)1:1的混合物。
2.權(quán)利要求1所述的具有氨氮降解能力的菌合劑在降解水體中氨氮的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的具有氨氮降解能力的菌`合劑在治理水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK103710284SQ201310714344
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】張志成, 沈志遠(yuǎn), 戴鼎震 申請(qǐng)人:金陵科技學(xué)院