一種貨架期內(nèi)具有高活菌數(shù)的枯草桿菌微膠囊的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于益生菌微膠囊制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)是一種貨架期內(nèi)具有高活菌數(shù)的枯草桿菌微膠囊的制備方法。本發(fā)明對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中的溫度、溶解氧、pH、時(shí)間和培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化控制，在膠囊制備過(guò)程中采用雙層微膠囊結(jié)合真空包裝。生產(chǎn)的枯草桿菌微膠囊在貨架期內(nèi)具有高活菌數(shù)、高抗逆性的優(yōu)點(diǎn)。其產(chǎn)品不僅可應(yīng)用于保健食品領(lǐng)域，也可應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明的菌株為益生菌，原料為無(wú)毒的天然化合物，可實(shí)現(xiàn)無(wú)污染物排放，綠色、安全、環(huán)保。
【專利說(shuō)明】一種貨架期內(nèi)具有高活菌數(shù)的枯草桿菌微膠囊的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及益生菌微膠囊制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)是一種貨架期內(nèi)具有高活菌數(shù)的枯草桿菌微膠囊的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]枯草桿菌(Bacillus subtilis),是一種好氣性革蘭氏陽(yáng)性菌,有鞭毛。枯草桿菌的內(nèi)生孢子耐高溫(120 ° C能存活20 min)，耐酸堿(100%直達(dá)大小腸的活菌)。進(jìn)入消化道后，在短期內(nèi)迅速由休眠狀態(tài)復(fù)活，繁殖成高含菌量的優(yōu)勢(shì)種群。進(jìn)而消耗掉腸道內(nèi)的氧氣，產(chǎn)生過(guò)氧化氫、細(xì)菌素，促進(jìn)有益厭氧微生物的繁殖，抑制有害細(xì)菌(大腸桿菌、沙門氏桿菌)的生長(zhǎng)，建立微生態(tài)平衡。從而預(yù)防腹瀉、下痢等腸胃道疾病。枯草桿菌在臨床醫(yī)學(xué)上屬于安全性的有益微生物，在保健食品中屬于益生菌。
[0003]益生菌是定植于人體腸道內(nèi)、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效的生活的有益微生物的總稱。隨著對(duì)人們對(duì)益生菌了解、重視和研究的深入，益生菌正從保健向醫(yī)療領(lǐng)域延伸。然而，益生菌制品在從生產(chǎn)、保藏、運(yùn)輸、經(jīng)口服過(guò)消化道到達(dá)腸道的過(guò)程中，需要經(jīng)受一系列不良環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致到達(dá)腸道的活菌數(shù)量大大減少，限制了益生菌生理功能的發(fā)揮。將益生菌包埋在微膠囊內(nèi)可減輕環(huán)境不良因素的影響，從而提高益生菌的存活率。
[0004]可用作微膠囊壁材的材料很多。有天然高分子聚合物、半合成高分子聚合物以及合成高分子聚合物，主要包括:碳水化合物，如海藻酸鈉、殼聚糖、淀粉；植物膠類，如阿拉伯膠、K-卡拉膠；動(dòng)物蛋白，如牛奶、明膠；細(xì)菌多糖，如膠凝糖、黃原膠。用來(lái)包埋益生菌的壁材通常應(yīng)具備如下特征:好的生物相容性和成膜性，合適的粘度、滲透性、親水性和溶解性等；并具有性質(zhì)穩(wěn)定性、能與芯材配合，能生物降解等。對(duì)益生菌微膠囊的研究已有諸多報(bào)道，但在需氧益生菌微膠囊中還存在有很多不足，如:耐熱性差、透氣性強(qiáng)和存活期短的問(wèn)題。解決這些問(wèn)題的主要出路在于提高菌株的抗逆性和膠囊耐受性。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明公開一種貨架期內(nèi)具有高活菌數(shù)的枯草桿菌微膠囊的制備方法，旨在提高枯草桿菌的抗逆性、保藏期，大幅降低活菌經(jīng)過(guò)消化道時(shí)的死亡率，使盡可能多的活菌到達(dá)腸道定植，起到益生保健作用。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。
[0008]一種貨架期內(nèi)具有高活菌數(shù)的枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
(I)菌株的活化:將4°c左右的條件下保存小于一個(gè)月的枯草桿菌單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在32-45 °C, 100-300 rpm條件下培養(yǎng)12-24 h進(jìn)行初次活化，然后按1_5%的接種量第二次將初次活化的枯草桿菌培養(yǎng)液接入種子培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)4-10 h進(jìn)行再次活化，得活化種子液； (2)擴(kuò)大培養(yǎng):將活化種子液按1-10%的接種量接種于pH6.5-8.5的裝有的奶粉-豆柏?zé)o菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在35-45°C，溶解氧3 35%條件下發(fā)酵18-24 h，繼續(xù)在25-35 °C發(fā)酵18-48 h至內(nèi)生芽孢生成率3 50%，得發(fā)酵液；
(3)洗滌:將發(fā)酵液于3000-10000rpm速度下離心5-30 min,去除上清液，按體積比1:1-5的比例將沉淀的菌體用無(wú)菌水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反復(fù)洗滌1-3次，隨后用1-5%無(wú)菌奶粉液重新懸浮菌體，其活菌數(shù)> 101° cfu/ml，得菌懸液；
(4)單層微膠囊制備:按1-5%(W/V)的比例將無(wú)菌處理的海藻酸鈉、0.1-1% (W/V)的阿魏酸和1-2% (W/V)的甘油加入菌懸液中，無(wú)菌條件下充分?jǐn)嚢杌靹?，得菌膠液；以10-30ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無(wú)菌的1_10 °C冷卻的1_10% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴加邊在100-300 rpm下攪拌，固化30-60 min，無(wú)菌水洗滌三次，得單層濕微膠囊；
(5)雙層微膠囊制備:將所得單層濕微膠囊與用無(wú)菌處理的0.5-5%殼聚糖中覆膜30-60 min，無(wú)菌水洗滌三次，得雙層濕微膠囊；
(6)干燥保藏:將雙層濕微膠囊進(jìn)行低溫真空干燥后在無(wú)菌條件下進(jìn)行真空包裝，得枯草桿菌干微膠囊。
[0009]述枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，對(duì)步驟(5)中所述雙層濕微膠囊進(jìn)行低溫真空干燥為40 0C以下的任何一種干燥方式，并真空包裝。
[0010]所述枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所述的枯草桿菌菌株指的是野生型枯草桿菌、基因工程的枯草桿菌中的一種或兩種。
[0011]所述枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述奶粉原料為全脂牛奶、脫脂牛奶、羊奶和馬奶中的任一種，所述豆柏為玉米豆柏、大豆豆柏和花生柏的任一種。
[0012]所述枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，所述的無(wú)菌方法為高溫滅菌和過(guò)濾除菌中的任一種。
[0013]所述枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(3) (4) (5)中的無(wú)菌水為生理鹽水、磷酸緩沖液、自來(lái)水和蒸餾水的任一種。
[0014]一種枯草桿菌微膠囊的制備方法，包括以下步驟:
(O菌株的活化:將4°c保存小于一個(gè)月的枯草桿菌單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在32-45 °C, 100-300 rpm條件下培養(yǎng)12-24 h進(jìn)行初次活化；然后按1_5%的接種量第二次接入種子培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)4-10 h進(jìn)行再次活化，得活化種子液；
所述枯草桿菌菌株為野生型枯草桿菌和基因工程的枯草桿菌中的任一種；所述種子培養(yǎng)基為改良LB培養(yǎng)基:10 g胰蛋白胨，10 g氯化鈉，5 g酵母提取粉，5 g甘油，加水定容至1000 mL，調(diào)pH至7.0-7.4，分裝(固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂)，在115 °C下滅菌20 min，所用試劑均為分析純。
[0015](2)擴(kuò)大培養(yǎng):將活化種子液按1-10%的接種量接種于裝有pH6.5-8.5的無(wú)菌奶粉-豆柏培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在35-45°C，溶解氧3 35%條件下發(fā)酵18-24 h，繼續(xù)在25-35°C發(fā)酵18-48 h至內(nèi)生芽孢生成率3 50%，得發(fā)酵液；
所述奶粉為全脂牛奶、脫脂牛奶、羊奶和馬奶中的任一種，所述豆柏為玉米豆柏、大豆豆柏和花生柏的任一種，所述的無(wú)菌方法為高溫滅菌和過(guò)濾除菌中的任一種。奶粉-豆柏培養(yǎng)基:過(guò)100目篩豆柏粉10-20克溶于1000毫升水，60°C保溫30分鐘，4000轉(zhuǎn)/min離心IOmin后取上清得豆柏培養(yǎng)基；加20-200克奶粉至豆柏培養(yǎng)基中得奶粉-豆柏培養(yǎng)基。[0016](3)洗漆:將發(fā)酵液于3000-10000 rpm速度下離心5_30 min,去除上清,按體積比1:1-5的比例將沉淀的菌體用無(wú)菌水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反復(fù)洗滌1-3次，隨后用1-5%無(wú)菌奶粉液重新懸浮菌體(活菌數(shù)≥101° cfu/ml )，得菌懸液。
[0017]所述無(wú)菌水為生理鹽水、磷酸緩沖液、自來(lái)水和蒸餾水的任一種。
[0018](4)單層微膠囊制備:按1-5% (W/V)的比例將海藻酸鈉、0.1-1% (W/V)阿魏酸和1-2% (W/V)甘油加入菌懸液中，無(wú)菌條件下充分?jǐn)嚢杌靹颍镁z液；以10-30 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無(wú)菌的1-10 °C冷卻的1-10% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(100-300 rpm),固化30-60 min,無(wú)菌水洗漆三次,得單層濕微膠囊；
(5)雙層微膠囊制備:將所得單層濕微膠囊與0.5-5%殼聚糖中覆膜30-60 min，無(wú)菌水洗滌三次，得雙層濕微膠囊；
(6 )干燥保藏:將雙層濕微膠囊進(jìn)行低溫真空干燥后在無(wú)菌條件下進(jìn)行真空包裝，得枯草桿菌干微膠囊。
[0019]所述的真空包裝中 用于脫氧的氣體可以是N2或隊(duì)、0)2、H2的混合氣。
[0020]以上所述枯草桿菌微膠囊的制備方法所制備的枯草桿菌微膠囊應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:在擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)采用優(yōu)化的培養(yǎng)條件，包括溫度、溶解氧、pH、時(shí)間和培養(yǎng)基，特別是雙溫度段培養(yǎng)，使之細(xì)胞大量繁殖和孢子大量形成；在膠囊制備中采用雙層微膠囊結(jié)合真空包裝使細(xì)胞處于良好的休眠環(huán)境。提高益生菌活菌的抗逆性、保藏期，大幅降低活菌經(jīng)過(guò)胃時(shí)胃液的破壞作用，使盡可能多的活菌到達(dá)腸道定植，起到益生保健功能。
[0022]本發(fā)明通過(guò)整合細(xì)胞生理特征與膠囊制備技術(shù)生產(chǎn)的枯草桿菌微膠囊具有貨架期內(nèi)高活菌數(shù)、高抗逆性的優(yōu)點(diǎn)。其產(chǎn)品不僅可應(yīng)用于保健食品領(lǐng)域，也可應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明的菌株為益生菌，原料為無(wú)毒的天然化合物，可實(shí)現(xiàn)無(wú)污染物排放，綠色、安全、環(huán)保。
【具體實(shí)施方式】
[0023]為了更充分理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步介紹和說(shuō)明。
[0024]以下實(shí)施例使用以下材料:
所用水均符合國(guó)家“生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)”(GB 5749— 2006)。
[0025]野生菌:枯草芽抱桿菌漢subtil is 168。
[0026]工程菌:枯草芽孢桿菌漢subti I is IBL 241 [WB800N/pHCMC05_svu022]。
[0027]培養(yǎng)基原料:全脂奶粉，雀巢全脂奶粉，雙城雀巢有限公司；豆柏，大豆豆柏，山東嘉冠油脂化工有限公司。
[0028]種子培養(yǎng)基為改良LB種子培養(yǎng)基(1L): 10 g胰蛋白胨，10 g氯化鈉，5 g酵母提取粉，5 g甘油，加水定容至1000 mL，調(diào)pH至7.0-7.4，分裝(固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂)，在115 °C下滅菌20 min,所用試劑均為分析純。
[0029]實(shí)施例1
一種枯草桿菌微膠囊的制備方法，包括以下步驟:(1)菌株的活化:將保存于4°c保存小于一個(gè)月的枯草桿菌漢subtilis 168單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在37 °C, 200 rpm條件下培養(yǎng)16-20 h進(jìn)行初次活化；然后按2%的接種量第二次接入種子培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)4-10 h進(jìn)行再次活化，得活化種子液；
(2)擴(kuò)大培養(yǎng):將活化種子液按4-6%的接種量接種于裝有奶粉-豆柏(5%脫脂奶粉與1%大豆豆柏4000rpm離心上清)的115°C高溫滅菌的培養(yǎng)基(pH 7.5)的發(fā)酵罐中，在37 °C，溶解氧3 30%條件下發(fā)酵20-24 h，繼續(xù)在25 °C發(fā)酵24-36 h至內(nèi)生芽孢大量形成(芽孢生成率3 50%)，得發(fā)酵液；
(3)洗滌:將發(fā)酵液于6000rpm速度下離心15 min,去除上清，按體積比1:2的比例將沉淀的菌體用無(wú)菌自來(lái)水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反復(fù)洗滌2次，隨后用1%無(wú)菌脫脂奶粉液重新懸浮菌體(活菌數(shù)≥101° cfu/ml)，得菌懸液；
(4)單層微膠囊制備:按2%(W/V)的比例將海藻酸鈉、0.5% (W/V)阿魏酸和1% (W/V)甘油加入菌懸液中，無(wú)菌條件下充分?jǐn)嚢杌靹?，得菌膠液；以20 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無(wú)菌的4°C冷卻的5% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(200 rpm),固化40min，無(wú)菌自來(lái)水洗滌三次，得單層濕微膠囊；
(5)雙層微膠囊制備:將所得單層濕微膠囊與1%殼聚糖中覆膜45min，無(wú)菌自來(lái)水洗滌三次，得雙層濕微膠囊；
(6)干燥保藏:將雙層濕微膠囊進(jìn)行低溫真空干燥后在無(wú)菌條件下進(jìn)行真空包裝，得枯草桿菌干微膠囊。
[0030]該枯草桿菌干微膠囊產(chǎn)品的保質(zhì)期≥2年，活菌數(shù)≥IXlO9個(gè)/g，芽孢3 60%;淡黃色，無(wú)異味。
[0031]以上制得的枯草桿菌干微膠囊產(chǎn)品可應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0032]實(shí)施例2
一種枯草桿菌微膠囊的制備方法，包括以下步驟:
(O菌株的活化:將保存于4°C保存小于一個(gè)月枯草桿菌漢subtilis 168單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在39 V, 200 rpm條件下培養(yǎng)16-20 h進(jìn)行初次活化；然后按2%的接種量第二次接入種子培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)4-10 h進(jìn)行再次活化，得活化種子液；
(2)擴(kuò)大培養(yǎng):將活化種子液按4-6%的接種量接種于裝有奶粉-豆柏(5%全脂奶粉與1%玉米豆柏)的115°C高溫滅菌的培養(yǎng)基(pH 8.0)的發(fā)酵罐中，在39 °C，溶解氧蘭40%條件下發(fā)酵20-24 h，繼續(xù)在30 °C發(fā)酵36-48 h至內(nèi)生芽孢大量形成(芽孢生成率3 50%)，得發(fā)酵液；
(3)洗滌:將發(fā)酵液于4000rpm速度下離心20 min,去除上清，按體積比1:3的比例將沉淀的菌體用無(wú)菌生理鹽水(0.9%NaCl)振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反復(fù)洗滌2次，隨后用1%無(wú)菌全脂奶粉液重新懸浮菌體(活菌數(shù)≥101° cfu/ml )，得菌懸液；
(4)單層微膠囊制備:按3%(W/V)的比例將海藻酸鈉、0.5% (W/V)阿魏酸和2% (W/V)甘油加入菌懸液中，無(wú)菌條件下充分?jǐn)嚢杌靹?，得菌膠液；以20 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無(wú)菌的4°C冷卻的4% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(200 rpm),固化40min，無(wú)菌生理鹽水洗滌三次，得單層濕微膠囊；
(5)雙層微膠囊制備:將所得單層濕微膠囊與2%殼聚糖中覆膜45min，無(wú)菌生理鹽水洗滌三次，得雙層濕微膠囊；(6)干燥保藏:將雙層濕微膠囊進(jìn)行低溫真空干燥后在無(wú)菌條件下進(jìn)行真空包裝，得枯草桿菌干微膠囊。
[0033]該枯草桿菌干微膠囊產(chǎn)品的保質(zhì)期> 2年，活菌數(shù)> IXlOici個(gè)/g，芽孢3 80% ；淡黃色，無(wú)異味。
[0034]以上制得的枯草桿菌干微膠囊產(chǎn)品可應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0035]實(shí)施例3
一種枯草桿菌微膠囊的制備方法，包括以下步驟:
(1)菌株的活化:將保存于4°C保存小于一個(gè)月的枯草桿菌漢subtilis 168單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在37 °C, 200 rpm條件下培養(yǎng)16-20 h進(jìn)行初次活化；然后按2%的接種量第二次接入種子培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)4-10 h進(jìn)行再次活化，得活化種子液；
(2)擴(kuò)大培養(yǎng):將活化種子液按4-6%的接種量接種于裝有奶粉-豆柏(10%全脂奶粉與1%玉米豆柏)的115°C高溫滅菌的培養(yǎng)基(pH 7.0)的發(fā)酵罐中，在39 °C，溶解氧蘭30%條件下發(fā)酵20-24 h，繼續(xù)在28 °C發(fā)酵36-48 h至內(nèi)生芽孢大量形成(芽孢生成率3 50%)，得發(fā)酵液；
(3)洗漆:將發(fā)酵液于4000rpm速度下離心20 min,去除上清,按體積比1:3的比例將沉淀的菌體用無(wú)菌自來(lái)水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反復(fù)洗滌2次，隨后用1%無(wú)菌全脂奶粉液重新懸浮菌體(活菌數(shù)≥1010 cfu/ml )，得菌懸液；
(4)單層微膠囊制備:按3%(W/V)的比例將海藻酸鈉、0.5% (W/V)阿魏酸和1% (W/V)甘油加入菌懸液中，無(wú)菌條件下充分?jǐn)嚢杌靹颍镁z液；以20 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無(wú)菌的4°C冷卻的3% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(200 rpm),固化40min，無(wú)菌自來(lái)水洗滌三次，得單層濕微膠囊；
(5)雙層微膠囊制備:將所得單層濕微膠囊與2%殼聚糖中覆膜45min，無(wú)菌自來(lái)水洗滌三次，得雙層濕微膠囊；
(6)干燥保藏:將雙層濕微膠囊進(jìn)行低溫真空干燥后在無(wú)菌條件下進(jìn)行真空包裝，得枯草桿菌干微膠囊。
[0036]該枯草桿菌干微膠囊產(chǎn)品的保質(zhì)期≥ 2年，活菌數(shù)≥2 X 1010個(gè)/g，芽孢3 80% ；淡黃色，無(wú)異味。
[0037]以上制得的枯草桿菌干微膠囊產(chǎn)品可應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0038]實(shí)施例4
一種枯草桿菌微膠囊的制備方法，包括以下步驟:
(O菌株的活化:將保存于4°C保存小于一個(gè)月的枯草桿菌漢subtilis 241單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在37 °C, 200 rpm條件下培養(yǎng)16-20 h進(jìn)行初次活化；然后按2%的接種量第二次接入種子培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)4-10 h進(jìn)行再次活化，得活化種子液；
(2)擴(kuò)大培養(yǎng):將活化種子液按4-6%的接種量接種于裝有奶粉-豆柏(10%全脂奶粉與2%玉米豆柏)的110-115°C高溫滅菌的培養(yǎng)基(pH 7.0)的發(fā)酵罐中，在39 °C，溶解氧蘭30%條件下發(fā)酵20-24 h，繼續(xù)在28 °C發(fā)酵36-48 h至內(nèi)生芽孢大量形成(芽孢生成率^ 50%)，得發(fā)酵液；
(3)洗漆:將發(fā)酵液于4000rpm速度下離心20 min,去除上清,按體積比1:3的比例將沉淀的菌體用無(wú)菌自來(lái)水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反復(fù)洗滌2次，隨后用1%無(wú)菌全脂奶粉液重新懸浮菌體(活菌數(shù)≥101° cfu/ml )，得菌懸液；
(4)單層微膠囊制備:按2.5% (W/V)的比例將海藻酸鈉、0.5% (W/V)阿魏酸和1% (ff/V)甘油加入菌懸液中，無(wú)菌條件下充分?jǐn)嚢杌靹?，得菌膠液；以20 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無(wú)菌的4°C冷卻的3% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(200 rpm),固化60min，無(wú)菌自來(lái)水洗滌三次，得單層濕微膠囊；
(5)雙層微膠囊制備:將所得單層濕微膠囊與2%殼聚糖中覆膜45min，無(wú)菌自來(lái)水洗滌三次，得雙層濕微膠囊；
(6 )干燥保藏:將雙層濕微膠囊進(jìn)行低溫真空干燥后在無(wú)菌條件下進(jìn)行真空包裝，得枯草桿菌干微膠囊。
[0039]該枯草桿菌干微膠囊產(chǎn)品的保質(zhì)期> 2年，活菌數(shù)> 5 X 101°個(gè)/g，芽孢3 90% ；淡黃色，無(wú)異味。 [0040]以上制得的枯草桿菌干微膠囊產(chǎn)品可應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0041]實(shí)施例5
一種枯草桿菌微膠囊的制備方法，包括以下步驟:
(O菌株的活化:將保存于4°C保存小于一個(gè)月的枯草桿菌漢subtilis 168單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在32 V, 100 rpm條件下培養(yǎng)24 h進(jìn)行初次活化；然后按1%的接種量第二次接入種子培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)10 h進(jìn)行再次活化，得活化種子液；
(2)擴(kuò)大培養(yǎng):將活化種子液按1%的接種量接種于裝有奶粉-豆柏(2%羊奶粉與1%大豆豆柏)的110-115°C高溫滅菌的培養(yǎng)基(pH 6.5)的發(fā)酵罐中，在35 °C，溶解氧蘭35%條件下發(fā)酵24 h，繼續(xù)在25 °C發(fā)酵48 h至內(nèi)生芽孢大量形成(芽孢生成率3 50%)，得發(fā)酵液；
(3)洗漆:將發(fā)酵液于3000rpm速度下離心30 min,去除上清,按體積比1:1的比例將沉淀的菌體用無(wú)菌蒸餾水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反復(fù)洗滌I次，隨后用1%無(wú)菌羊奶粉液重新懸浮菌體(活菌數(shù)≥IO9 cfu/ml )，得菌懸液；
(4)單層微膠囊制備:按1%(W/V)的比例將海藻酸鈉、0.1% (W/V)阿魏酸和1% (W/V)甘油加入菌懸液中，無(wú)菌條件下充分?jǐn)嚢杌靹?，得菌膠液；以10 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無(wú)菌的1°C冷卻的1% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(100 rpm)，固化30min，無(wú)菌蒸餾水洗滌三次，得單層濕微膠囊；
(5)雙層微膠囊制備:將所得單層濕微膠囊與0.5%殼聚糖中覆膜60 min，無(wú)菌蒸餾水洗滌三次，得雙層濕微膠囊；
(6 )干燥保藏:將雙層濕微膠囊進(jìn)行低溫真空干燥后在無(wú)菌條件下進(jìn)行真空包裝，得枯草桿菌干微膠囊。
[0042]該枯草桿菌干微膠囊產(chǎn)品的保質(zhì)期≥2年，活菌數(shù)≥I X IO8個(gè)/g，芽孢3 70% ;淡黃色，無(wú)異味。
[0043]以上制得的枯草桿菌干微膠囊產(chǎn)品可應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0044]實(shí)施例6
一種枯草桿菌微膠囊的制備方法，包括以下步驟:
(O菌株的活化:將保存于4°C保存小于一個(gè)月的枯草桿菌漢subtilis IBL 241單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在45 V, 300 rpm條件下培養(yǎng)12 h進(jìn)行初次活化；然后按5%的接種量第二次接入種子培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)4 h進(jìn)行再次活化，得活化種子液；
(2)擴(kuò)大培養(yǎng):將活化種子液按10%的接種量接種于裝有奶粉-豆柏(20%馬奶粉與2%花生柏)的過(guò)濾除菌后的培養(yǎng)基(pH 6.5)的發(fā)酵罐中，在45 °C，溶解氧3 35%條件下發(fā)酵18h，繼續(xù)在35 °C發(fā)酵18 h至內(nèi)生芽孢大量形成(芽孢生成率3 50%)，得發(fā)酵液；
(3)洗漆:將發(fā)酵液于10000rpm速度下離心5 min,去除上清,按體積比1:5的比例將沉淀的菌體用無(wú)菌磷酸緩沖液振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反復(fù)洗滌3次，隨后用5%無(wú)菌馬奶粉液重新懸浮菌體(活菌數(shù)≥IO9 cfu/ml )，得菌懸液； (4)單層微膠囊制備:按5%(W/V)的比例將海藻酸鈉、1% (W/V)阿魏酸和2% (W/V)甘油加入菌懸液中，無(wú)菌條件下充分?jǐn)嚢杌靹?，得菌膠液；以30 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無(wú)菌的10°C冷卻的10% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(300 rpm)，固化60min，無(wú)菌磷酸緩沖液洗滌三次，得單層濕微膠囊；
(5)雙層微膠囊制備:將所得單層濕微膠囊與5%殼聚糖中覆膜30min，無(wú)菌磷酸緩沖液洗滌三次，得雙層濕微膠囊；
(6)干燥保藏:將雙層濕微膠囊進(jìn)行低溫真空干燥后在無(wú)菌條件下進(jìn)行真空包裝，得枯草桿菌干微膠囊。
[0045]該枯草桿菌干微膠囊產(chǎn)品的保質(zhì)期≥2年，活菌數(shù)≥IXlO9個(gè)/g，芽孢3 80%;淡黃色，無(wú)異味。
[0046]以上制得的枯草桿菌干微膠囊產(chǎn)品可應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0047]以上所述僅以實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，以便于讀者更容易理解，但不代表本發(fā)明的實(shí)施方式僅限于此，任何依本發(fā)明所做的技術(shù)延伸或再創(chuàng)造，均受本發(fā)明的保護(hù)。
【權(quán)利要求】
1.一種貨架期內(nèi)具有高活菌數(shù)的枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (O菌株的活化:將4°c左右的條件下保存小于一個(gè)月的枯草桿菌單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在32-45 0C , 100-300 rpm條件下培養(yǎng)12-24 h進(jìn)行初次活化，然后按1_5%的接種量第二次將初次活化的枯草桿菌培養(yǎng)液接入種子培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)4-10 h進(jìn)行再次活化，得活化種子液； (2)擴(kuò)大培養(yǎng):將活化種子液按1-10%的接種量接種于pH6.5-8.5的裝有的奶粉-豆柏?zé)o菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在35-45°C，溶解氧3 35%條件下發(fā)酵18-24 h，繼續(xù)在25-35 °C發(fā)酵18-48 h至內(nèi)生芽孢生成率3 50%，得發(fā)酵液； (3)洗滌:將發(fā)酵液于3000-10000rpm速度下離心5-30 min,去除上清液，按體積比1:1-5的比例將沉淀的菌體用無(wú)菌水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反復(fù)洗滌1-3次，隨后用1-5%無(wú)菌奶粉液重新懸浮菌體，其活菌數(shù)> 101° cfu/ml，得菌懸液； (4)單層微膠囊制備:按1-5%(W/V)的比例將無(wú)菌處理的海藻酸鈉、0.1-1% (W/V)的阿魏酸和1-2% (W/V)的甘油加入菌懸液中，無(wú)菌條件下充分?jǐn)嚢杌靹?，得菌膠液；以10-30ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無(wú)菌的1_10 °C冷卻的1_10% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴加邊在100-300 rpm下攪拌，固化30-60 min，無(wú)菌水洗滌三次，得單層濕微膠囊； (5)雙層微膠囊制備:將所得單層濕微膠囊用無(wú)菌處理的0.5-5%殼聚糖中覆膜30-60min，無(wú)菌水洗滌三次，得雙層濕微膠囊； (6)干燥保藏:將雙層濕微膠囊進(jìn)行低溫真空干燥后在無(wú)菌條件下進(jìn)行真空包裝，得枯草桿菌干微膠囊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，對(duì)步驟(5)中所述雙層濕微膠囊進(jìn)行低溫真空干燥為40 0C以下的任何一種干燥方式，并真空包裝。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所述的枯草桿菌菌株指的是野生型枯草桿菌、基因工程的枯草桿菌中的一種或兩種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述奶粉原料為全脂牛奶、脫脂牛奶、羊奶和馬奶中的任一種，所述豆柏為玉米豆柏、大豆豆柏和花生柏的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，所述的無(wú)菌方法為高溫滅菌和過(guò)濾除菌中的任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，步驟(3)(4)(5)中的無(wú)菌水為生理鹽水、磷酸緩沖液、自來(lái)水和蒸餾水的任一種。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK103704718SQ201310714772
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】童望宇, 羅學(xué)才 申請(qǐng)人:安徽大學(xué)