Foxe1基因和wnt3基因的應(yīng)用及該基因的甲基化擴(kuò)增引物和探針的制作方法
【專利摘要】FOXE1基因和WNT3基因的應(yīng)用及該基因的甲基化擴(kuò)增引物和探針，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明一方面提供FOXE1基因和/或WNT3基因作為甲基化結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)記物的應(yīng)用，另一方面提供FOXE1基因和WNT3基因甲基化擴(kuò)增引物和探針。本發(fā)明確定FOXE1基因和WNT3基因可以在結(jié)直腸癌中作為腫瘤標(biāo)志物使用，這兩個(gè)甲基化腫瘤標(biāo)志物連用的話敏感性能高達(dá)79%，特異性為59%，即使I期腫瘤患者的敏感性也能達(dá)到63.3%，顯示在全血DNA中尋找甲基化腫瘤標(biāo)志物的可行性。本發(fā)明的甲基化擴(kuò)增引物和探針能夠檢測(cè)到FOXE1和WNT3基因在結(jié)直腸癌患者和正常對(duì)照全血DNA中的甲基化狀態(tài)有顯著性差異。
【專利說明】F0XE1基因和WNT3基因的應(yīng)用及該基因的甲基化擴(kuò)增引物和探針
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種FOXEl基因和WNT3基因的應(yīng)用及該基因的甲基化擴(kuò)增引物和探針。
【背景技術(shù)】[0002]結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其較高的發(fā)病率和死亡率對(duì)人類的健康造成了嚴(yán)重的威脅。目前結(jié)腸鏡對(duì)結(jié)直腸癌檢查的靈敏度和特異性最高，但由于費(fèi)用較高、患者痛苦較大和操作要求高等原因降低了患者愿意做該項(xiàng)檢查的程度，致使很多患者拖到晚期。腫瘤標(biāo)志物具有微創(chuàng)、檢測(cè)方便、費(fèi)用低、便于普查等優(yōu)點(diǎn)，并具有較高的敏感性和特異性，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是多種基因損傷的結(jié)果，目前還沒找到理想的腫瘤標(biāo)志物。
[0003]基因啟動(dòng)子過甲基化的本質(zhì)是一種DNA分子異常，它與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，是導(dǎo)致許多腫瘤相關(guān)基因表達(dá)失活的一個(gè)重要原因。在一般正常的細(xì)胞中，基因調(diào)控區(qū)CpG島處于非甲基化的狀態(tài)，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變后，這些CG區(qū)域往往呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)。目前DNA甲基化研究是腫瘤分子生物學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。甲基化和抑癌基因的失活有關(guān)，高水平的甲基化常常和腫瘤的高危險(xiǎn)性相關(guān)，可以用于腫瘤的分類診斷，成為重要的分子生物學(xué)標(biāo)記，異常的基因啟動(dòng)子甲基化多發(fā)生于腫瘤早期，這為大多數(shù)腫瘤的早期診斷及判斷腫瘤預(yù)后、轉(zhuǎn)歸、評(píng)價(jià)療效提供了一個(gè)非常有前景的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種FOXEl基因和WNT3基因的應(yīng)用及該基因的甲基化擴(kuò)增引物和探針的技術(shù)方案。
[0005]所述的FOXEl基因和/或WNT3基因作為甲基化結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)記物的應(yīng)用。
[0006]所述的一種甲基化結(jié)直腸癌腫瘤的擴(kuò)增引物和探針，其特征在于包括FOXEl標(biāo)記引物和/或WNT3標(biāo)記引物，
所述的FOXEl標(biāo)記引物包括引物Foxel M_F JMlJFoxel M-R和探針Foxel Probe,所述的Foxel M-F序列如SEQ ID N0.1所示，所述的引物Foxel M-R序列如SEQ ID N0.2所示，所述的探針Foxel Probe序列如SEQ ID N0.3所示；
所述的WNT3標(biāo)記引物包括引物Wnt3 M_F、引物Wnt3 M-R和探針Wnt3 Probe，所述的引物Wnt3 M-F序列如SEQ ID N0.4所示，所述的引物Wnt3 M-R序列如SEQ ID N0.5所示，所述的探針fct3 Probe序列如SEQ ID N0.6所示。
[0007]本發(fā)明中的FOXEl基因和WNT3基因?yàn)楝F(xiàn)有公開的基因。
[0008]本發(fā)明通過系統(tǒng)全面地分析Wnt基因及其拮抗基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞株、正常結(jié)直腸粘膜、結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織、結(jié)直腸癌患者及正常對(duì)照DNA中的甲基化狀態(tài)，分析其與各臨床資料之間的關(guān)系，確定一個(gè)具有較高靈敏度和特異性的Wnt/ β -catanin通路的甲基化基因譜作為結(jié)直腸癌的腫瘤標(biāo)志物，以便進(jìn)一步將其開發(fā)成為具有獨(dú)立自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的結(jié)直腸癌體外診斷試劑盒。
[0009]經(jīng)312例結(jié)直腸癌患者和200例正常對(duì)照的驗(yàn)證，已確定FOXEl基因和WNT3基因可以在結(jié)直腸癌中作為腫瘤標(biāo)志物使用，這兩個(gè)甲基化腫瘤標(biāo)志物連用的話敏感性能高達(dá)79%，特異性為59%，而且即使I期腫瘤患者的敏感性也能達(dá)到63.3%，顯示在全血DNA中尋找甲基化腫瘤標(biāo)志物的可行性。另外，本發(fā)明開發(fā)的FOXEl基因和WNT3基因特異性的甲基化擴(kuò)增引物和探針能夠檢測(cè)到2個(gè)Wnt通路基因FOXEl和WNT3基因在結(jié)直腸癌患者和正常對(duì)照全血DNA中的甲基化狀態(tài)有顯著性差異。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為甲基化芯片結(jié)果顯示部分Wnt通路相關(guān)基因在5例結(jié)直腸癌患者和5例正常對(duì)照者全血DNA中的差異比較圖；
圖2為FOXEl的ddCt平均值在腫瘤患者和正常對(duì)照?qǐng)D；
圖3為WNT3的ddCt平均值在腫瘤患者和正常對(duì)照?qǐng)D。
【具體實(shí)施方式】
[0011 ] 以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例
[0012]一.材料和方 法:
1.材料:正常結(jié)直腸粘膜(約50例)取自腸鏡活檢標(biāo)本，結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織(約300例)取自手術(shù)切除標(biāo)本，所有病例均為初治患者，術(shù)前均未行放化療并經(jīng)病理確診，另外結(jié)直腸癌患者(312例)及正常對(duì)照(200例)的全血、血清和血漿。結(jié)直腸癌患者包括男181例，女131例。年齡38 - 8 2歲，平均61.6 土 12.3歲。200例健康體檢者入選正常對(duì)照組，其中男118例，女82例。年齡21- 71歲，平均年齡40.21 土 18.05歲。標(biāo)本取材獲得患者知情同意并經(jīng)邵逸夫醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
[0013]2.方法:
2.1 DNA提取及亞硫酸氫鹽修飾:采用天根公司試劑盒TIANamp Genomic DNA kit(Catalog no:DP304)提取樣本中的DNA。取 lug DNA，采用 QIAGEN公司的EpiTect BisulfitKit (Catalog no:59104)進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。
[0014]2.2芯片初篩甲基化狀態(tài)差異的基因:5例結(jié)直腸癌患者和5例正常對(duì)照者全血DNA甲基化芯片檢測(cè)委托上海康成生物工程有限公司進(jìn)行。采用的是Roch-NimbleGen CpGpromoter 芯片:Human DNA Methylation 2.1M Deluxe Promoter,其覆蓋 31548 個(gè)啟動(dòng)子，上游7.25kb至下游3.25kb以及28226個(gè)CpG島。
[0015]2.3 MethyLight定量PCR方法及相關(guān)引物和探針設(shè)計(jì):
MethyLight是一種建立在TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)上的甲基化定量分析技術(shù)，它通過一對(duì)甲基化特異性擴(kuò)增引物和一條覆蓋若干CpG位點(diǎn)的探針來對(duì)對(duì)目的基金進(jìn)行定量。
[0016]在本實(shí)驗(yàn)中通過ACTB(P-actin)參比基因來校正樣品間在模板量上的差異，合成引物和探針，序列見表1。[0017]表1.MethyLight引物和探針
【權(quán)利要求】
1.FOXEl基因和/或WNT3基因作為甲基化結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)記物的應(yīng)用。
2.一種結(jié)直腸癌腫瘤的甲基化擴(kuò)增引物和探針，其特征在于包括FOXEl標(biāo)記引物和/或WNT3標(biāo)記引物，所述的FOXEl標(biāo)記引物包括引物Foxel M-F、引物Foxel M-R和探針Foxel Probe,所述的Foxel M-F序列如SEQ ID N0.1所不,所述的引物Foxel M-R序列如SEQ ID N0.2所示，所述的探針Foxel Probe序列如SEQ ID N0.3所示;所述的WNT3標(biāo)記引物包括引物Wnt3 M-F、引物Wnt3 M-R和探針Wnt3 Probe，所述的引物Wnt3 M-F序列如SEQID N0.4所示,所述的引物Wnt3 M-R序列如SEQ ID N0.5所示,所述的探針Wnt3 Probe序列如SEQ ID N0.6 所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103849680SQ201310715497
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】胡曉彤, 何超 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院