一種高活力飼用復合酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高活力飼用復合酶，屬于飼用酶制劑制備【技術(shù)領域】。以高產(chǎn)飼用復合酶的菌株黑曲霉DM-18為出發(fā)菌株，并進行培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝改進，經(jīng)特定發(fā)酵條件下的液體深層混合發(fā)酵，制得一種酶系全、酶活力高、耐受溫度較強、耐pH值較寬泛的飼用復合酶。本發(fā)明高活力飼用復合酶發(fā)酵液粗酶液中含有多種酶，其中蛋白酶活力6500-6700U/ml、甘露聚糖酶活力1500-1700U/ml、α-半乳糖酶活力1200-1300U/ml、果膠酶活力1000-1200U/ml。對發(fā)酵液粗酶液進行酶的熱穩(wěn)定性試驗和pH穩(wěn)定性試驗，試驗結(jié)果表明：在30-75℃，pH值2-7時各酶均有較高的酶活力，達到80%以上。
【專利說明】一種高活力飼用復合酶
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及飼用酶制劑，特別涉及一種高活力飼用復合酶。
【背景技術(shù)】[0002]國內(nèi)外的大量研究表明，在飼料中添加酶制劑可促進動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高飼料利用率，增強動物防病抗病能力，其主要功能有以下幾個方面:(1)補充動物內(nèi)源酶的不足，提高飼料的消化率和利用率。酶制劑促進了消化道對碳水化合物和其它營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提高了飼料的轉(zhuǎn)化效率，有利于動物的生長。(2)消除飼料中的抗營養(yǎng)因子，降低動物消化道食糜的黏度，改善消化機能，有利于營養(yǎng)物質(zhì)吸收。(3)改善腸道菌群分布，提高動物健康狀況。酶制劑降解非淀粉多糖后產(chǎn)生的甘露寡聚糖能促進雙歧桿菌、酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌等有益菌群增殖，進而限制沙門氏菌、彎曲桿菌和梭酸芽孢桿菌等致病細菌生長。(4)參與動物內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，提高畜禽體內(nèi)激素代謝水平，通過影響機體的激素代謝促進家禽生長。(5)減輕畜牧生產(chǎn)對環(huán)境的污染。幾乎在所有的植物飼料中，絕大部分磷酸鹽以植酸形式存在(肌醇六磷酸)。由于單胃動物消化道中植酸酶的活力很低，大部分植酸磷被排出體外，這樣不僅浪費磷源，且造成環(huán)境污染。添加植酸酶，可替代飼料配方中50%~70%的磷酸氫鈣，向環(huán)境排泄的磷相應減少30%以上，在環(huán)境保護中發(fā)揮巨大作用。(6)促進細胞包圍的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪的釋放，通過水解細胞壁，使營養(yǎng)物質(zhì)被充分吸收。
[0003]在禽畜產(chǎn)品養(yǎng)殖中應用飼用酶制劑既能提高飼料的消化率和利用率，提高畜禽及魚類的生產(chǎn)性能，又能減少畜禽排泄物中的氮、磷的排泄量，保護水體和土壤免受污染，因而飼用酶制劑作為一類高效、無毒副作用和環(huán)保型的“綠色”飼料添加劑在21世紀將有著十分廣闊的應用前景。
[0004]飼用酶制劑的商業(yè)化應用在國外也只有不到二十年的歷史。英國在1988年以前，酶制劑在雞飼料的添加率幾乎等于零，而到了 1993年，雞飼料酶制劑的添加率已達到95%以上。飼用酶制劑在我國的應用始于1992年，2005年我國飼用酶制劑的年銷售量已達到I萬噸以上。飼用酶制劑作為一類高效、無毒、無副作用和環(huán)保型的“綠色”飼料添加劑在21世紀將有十分廣闊的應用前景。我國配合飼料2009年產(chǎn)量達1.4億噸，其中按50 %左右加酶0.1 %計，則用酶約7萬噸。據(jù)國內(nèi)市場預測分析，2010年飼用復合酶制劑的市場容量預計達到7.5萬噸，而國內(nèi)飼用酶制劑的產(chǎn)能不足2萬噸，因此，飼用酶制劑在我國還有很大的市場空間和潛力。目前我國飼用酶制劑的市場已經(jīng)初步形成，并逐步發(fā)展，各類酶制劑在國內(nèi)有良好的發(fā)展勢頭和前景。
[0005]我國各地主要糧食作物差異較大，酶制劑對潛在飼料資源的利用和新飼料資源的開發(fā)有較大的作用。由此人們迫切需要發(fā)展酶制劑等環(huán)保節(jié)能型綠色飼料添加劑。我國政府也正積極通過禁止在飼料中使用抗生素、激素等方式來保障飼料和食品的安全，維護生態(tài)平衡。預計未來10年內(nèi)，隨著科技水平不斷提高，生產(chǎn)成本的下降，飼用酶的產(chǎn)銷量必然大幅度提高。飼用酶制劑在生產(chǎn)中的普遍應用雖然還面臨著許多問題，但隨著生物技術(shù)特別是基因工程技術(shù)和生產(chǎn)技術(shù)的提高，都將逐一解決。隨著人們生活水平的提高及環(huán)境意識的增強，飼用酶制劑以其不產(chǎn)生殘留、無抗藥性、不污染環(huán)境等優(yōu)勢將會進一步被推廣應用。
[0006]目前，飼用復合酶的生產(chǎn)主要有以下三種方法:1.完全復配法:既生產(chǎn)和購買各種單一酶制劑，按配方復配，再加分散劑、稀釋劑等加工而成。主要缺點是成本高，使用時不易將酶活較高而劑量很少的酶制劑同大量飼料混合均勻，因而嚴重影響了使用的效果，這在無形中又增加了使用成本，使不少經(jīng)營者望而卻步，給推廣和應用帶來了障礙。2.多菌株混合發(fā)酵，自然互補酶系法:采用幾個菌種混合發(fā)酵，互補產(chǎn)酶法獲得與復配法較為接近的復合酶產(chǎn)品，之后只需稍加調(diào)整即為產(chǎn)品，但多菌種發(fā)酵的技術(shù)難度非常大，因為不同的菌種的各自生理特性，混合培養(yǎng)難免相互影響，要使它們在相同培養(yǎng)基上生長并合成不同的酶有一定困難。3.單菌種發(fā)酵，補加酶法:通過菌種篩選獲得優(yōu)良菌株，該菌株可以高產(chǎn)多種酶，且這些酶組成合理，能滿足簡單的飼料配方要求，用這樣的菌株發(fā)酵后獲得復合酶，再按不同的動物的不同年齡的生長需要加以補加和調(diào)整即可。
[0007]綜上所述，采用單一菌種發(fā)酵生產(chǎn)飼用復合酶是最簡單、飼用效果最好、成本最低的一種生產(chǎn)方法，中國專利CN101608175B公開了一種復合酶制劑及其制備方法和應用，以黑曲霉為出發(fā)菌株，經(jīng)液體深層發(fā)酵制備的復合酶含有以下酶種及活性:液體酸性(6-甘露聚糖酶，1300u/ml,液體a-半乳糖苷酶,300u/ml,適用于飼料和石油工業(yè)。中國專利CN101591619B公開了一種黑曲霉菌株及其應用，該菌株可以同時高產(chǎn)木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、(6-甘露聚糖酶等，可生產(chǎn)動物飼喂用復合酶，各種酶活最適PH值為4-6。
[0008]由此看來制備一種酶活力高、熱穩(wěn)定性好、最適pH范圍寬泛的飼用復合酶仍是本行業(yè)及廣大畜禽養(yǎng)殖戶的迫切需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是以高產(chǎn)飼用復合酶的菌株黑曲霉(Aspergi I Iusniger)DM-18為出發(fā)菌株，并進行培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝改進，經(jīng)特定發(fā)酵條件下的液體深層混合發(fā)酵，制得一種酶系全、酶活力高`、耐受溫度較強、耐PH值較寬泛的飼用復合酶。
[0010]本發(fā)明復合酶包括甘露聚糖酶、a -半乳糖酶、果膠酶和蛋白酶，形成了一種針對飼料原料的多酶復合體系，即飼用復合酶。
[0011]本發(fā)明高活力飼用復合酶的酶學性質(zhì)如下:
[0012](I)溫度:該復合酶中各酶溫度適應范圍較寬，適用溫度范圍為30_75°C，最適反應溫度65°C，在75°C酶活完全穩(wěn)定；
[0013](2)pH:該酶適用反應pH值范圍為2.0-7.0，在pH值為2.0時酶活完全穩(wěn)定，最適反應PH值為5-7 ；
[0014](3)酶活性:該復合酶發(fā)酵液粗酶液中含有多種酶活力，其中蛋白酶活力6500-6700U/ml、甘露聚糖酶活力1500_1700U/ml、a -半乳糖酶活力1200_1300U/ml、果膠酶活力 1000-1200U/ml。
[0015](4)熱穩(wěn)定性:該復合酶發(fā)酵液粗酶液中各酶在70°C條件下保存Ih后仍能保持85%以上酶活，75°C條件下保存Ih后保持80%以上酶活；
[0016]本發(fā)明高活力飼用復合酶的制備方法如下:將保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌種經(jīng)菌種活化和一級、二級、三級液體種子及種子罐逐級擴大培養(yǎng)得到液體種子，以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度28-30°C，攪拌速度200-700r/m，通風量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時間10-15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-33°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得固體飼用復合酶，所述調(diào)配過程加入濃縮酶液總重量0.5-5%中草藥粉劑。
[0017]所述斜面培養(yǎng)基組成為:干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.Sg，硫酸亞鐵0.02g，葡萄糖20g，瓊脂20g,中草藥粉劑5-20g,蒸餾水lOOOmL，pH值5.8，121°C滅菌 20min。
[0018]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0019]稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；黃芩10_15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0020]所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1-1.5。
[0021]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基組成為:磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀
0.8g,硫酸亞鐵0.02g,葡萄糖20g,中草藥粉劑15-25g,海藻糖10_30g,蒸懼水lOOOmL, pH值 5.5，1 21°C 滅菌 20min。
[0022]所述種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麩皮10_15g，魚粉10-15g，氯化鈣6-10g，氯化銨l_3g，磷酸氫二鈉l_2g，中草藥粉劑15-20g，海藻糖10_30g，純凈水 lOOOmL，pH 值 5-7，121°C 滅菌 20min。
[0023]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml ；
[0024]所述成為:玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麩皮10_15g，魚粉10_15g，氯化鈣6_10g，氯化銨l_3g，磷酸氫二鈉l_2g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖10_30g，純凈水lOOOmL，pH值
5-7，121°C 滅菌 20min。
[0025]所述發(fā)酵罐發(fā)酵過程補料培養(yǎng)基重量百分比組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%,豆粉15-25%，魚粉1.0-1.5%，氯化鈣0.6-1.0%，氯化銨0.1-0.3%，磷酸氫二鈉
0.1-0.2%，中草藥粉劑5-10%，不足部分純凈水補足，pH值5-7，121-123°c滅菌30_40min。
[0026]本發(fā)明高活力飼用復合酶在制備飼料復合酶中的應用。
[0027]本發(fā)明的高產(chǎn)飼用復合酶的黑曲霉菌株具體為黑曲霉(Aspergillus niger)DM-18，是從湖南省津市市洋由鄉(xiāng)腐殖土、稻草混合樣土分離得到的黑曲霉(Aspergillusniger) HYX0022經(jīng)經(jīng)紫外誘變、紫外亞硝酸誘變、紫外線亞硝基胍復合誘變，然后對突變株逐級篩選淘汰，最后對優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測試篩選得到產(chǎn)飼用復合酶的黑曲霉DM-18。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學生命科學學院郵編:430072)，保藏號為CCTCC NO:M2013541,分類命名為黑曲霉(Aspergillus niger) DM-18。
[0028]本發(fā)明提供的高產(chǎn)飼用復合酶的黑曲霉DM-18 (CCTCC NO:M2013541)具有以下微生物學特征:[0029]1、形態(tài)學特征:
[0030]黑曲霉DM-18，生物學形態(tài)為包括分生孢子、孢梗、頂囊、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等幾部分。分生孢子頭球形至福射形，直徑150-450 ii m,分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)。孢梗莖1000-3000(長度)X 12-20 (直徑)y m，黃色或黃褐色，壁平滑；頂囊球形或近似球形，直徑35-50 u m,表面全面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，?；?5-20(長度)X3-4.0(直徑)iim，孢梗6_8(長度)X 2-4 (直徑)m，分生孢子球形或近球形，較小，直徑3.5-5.0 u m，褐色，壁粗糙。
[0031]2、培養(yǎng)學特征:
[0032]黑曲霉DM-18在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長迅速，280C 4天直徑65mm ;質(zhì)地絲絨狀或稍帶絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，褐黑色，有少量滲出液；菌落反面略帶黃色。
[0033]3、生理生化特征:
[0034]黑曲霉DM-18可在馬鈴薯、玉米粉、可溶性淀粉，糖蜜等上生長，最適PH值4.6，最適生長溫度28-34°C，最適產(chǎn)酶溫度28-30°C。
[0035]黑曲霉DM-18的篩選技術(shù)路線為:原始菌株分離、篩選與鑒定一出發(fā)菌株一斜面培養(yǎng)一孢子懸液的制備一誘變處理一平板分離一初篩一復篩一再復篩一擴大實驗(發(fā)酵性能測定)。
[0036]有益效果:
[0037]1.本發(fā)明高活力飼用復合酶以高產(chǎn)飼用復合酶的菌株黑曲霉DM-18為出發(fā)菌株，并進行培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝改進，采用梯度降溫和梯度升溫的發(fā)酵工藝，同時予以追加接種和適時補料，尤其是梯度降溫和梯度升溫的發(fā)酵工藝顯著提高了出發(fā)菌株的抗應激能力，致使菌種的產(chǎn)酶能力最大限度地顯現(xiàn)。并且本發(fā)明對培養(yǎng)基組成實施全程優(yōu)化，添加了具有抗熱應激原作用的黃芩、柴胡，添加了具有調(diào)整和修復機體功能、增強機體的免疫功能、具有微生態(tài)調(diào)節(jié)功能的黃芪、黨參等，進一步增強了微生物在同一發(fā)酵環(huán)境下的機體功能性、傳代適應性和共同協(xié)作性，進而增強了微生物的代謝功能，使得本發(fā)明所產(chǎn)飼用復合酶活力高、耐受溫度較高、穩(wěn)定性強、適于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0038]2.本發(fā)明高活力飼用復合酶發(fā)酵液粗酶液中含有多種酶活力，其中，蛋白酶活力6500-6700U/ml、甘露聚糖酶活力1500_1700U/ml、a -半乳糖酶活力1200_1300U/ml、果膠酶活力1000-1200U/ml。對發(fā)酵液粗酶液進行酶的熱穩(wěn)定性試驗和pH穩(wěn)定性試驗，試驗結(jié)果表明:在30-75°C，pH值2-7時各酶均有較高的酶活力，達到80%以上。
[0039]3.本發(fā)明高活力飼用復合酶包括甘露聚糖酶、a -半乳糖酶、果膠酶和蛋白酶，從而形成一種針對飼料原料的多酶復合體系，即可生產(chǎn)飼用復合酶，且該復合酶中的各種酶活最適PH值在2-7之間，適合動物胃腸道的消化和吸收環(huán)境，這種飼用復合酶可以廣泛應用在畜禽飼料中，能夠降低抗營養(yǎng)因子，提高消化率，具有良好的經(jīng)濟效益，同時也有利于保護生態(tài)環(huán)境，推動畜牧業(yè)的健康發(fā)展。
[0040]4.本發(fā)明高活力飼用復合酶熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性強，更加適合飼料工業(yè)加工工藝需求,加工后的飼料酶活損失低。
【具體實施方式】
[0041]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0042]實施例1飼用復合酶酶活力測定
[0043]I)酶活力單位定義:
[0044]蛋白酶酶活力單位定義:在40°C、pH5.5.條件下，Imin水解酪蛋白產(chǎn)生I ii mol酪氨酸的酶量為I個酶活力單位，以U/ml表示。
[0045]甘露聚糖酶活力單位定義:在40°C、pH5.5條件下，Imin從濃度為5mg/ml的刺槐豆膠溶液中水解釋放相當于I U mol甘露糖的還原糖所需要的酶量為I個酶活力單位，以U/ml表不。
[0046]a -半乳糖酶活力單位定義:在40°C、pH5.5條件下，Imin分解對硝基酚-a -D-吡喃半乳糖生成I U mol對硝基酚所需的酶量為I個a -半乳糖苷酶酶活單位，以U/ml表示。
[0047]果膠酶活力單位定義:在40°C、pH5.5條件下，Imin從濃度為10mg/ml的果膠溶液中水解釋放相當于I U mol的還原糖所需要的酶量為I個酶活力單位，以U/ml表示。
[0048]2)測定:將實施例2粗酶液用蒸餾水進行適當稀釋，取四支具塞試管，分別在三支(三個重復)中加入0.1ml經(jīng)稀釋的飼用復合酶粗酶液，第四支試管中加入0.1ml經(jīng)煮沸5min的滅活酶液作為對照，與用pH5.5的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的底物(具體底物濃度見步驟I所述的酶活力單位定義)一起于40°C水浴中預熱5min ;在各試管中加入
0.1ml底物，40°C精確反應30min，反應完成后在四支試管中加入0.6mlDNS試劑，搖勻，煮沸IOmin滅活顯色,迅速冷卻到室溫,用水定容到5.0ml,在550nm波長下測定吸光度。調(diào)整飼用復合酶粗酶液的稀釋倍數(shù)(用蒸餾水稀釋)，使測定的吸光度數(shù)值在標準曲線測定范圍之內(nèi)。
[0049]3)結(jié)果:經(jīng)測定，實施例2得到的發(fā)酵液發(fā)酵液粗酶液中含有多種酶活力，其中，蛋白酶活力6700U/ml、甘露聚糖酶活力1700U/ml、a -半乳糖酶活力1300U/ml、果膠酶活力1200U/ml。
[0050]實施例2
[0051]一種高活力飼用復合酶制備方法包括如下步驟:
[0052](I)菌種活化
[0053]將保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)42h進行菌種活化，如此活化3次；
[0054]所述斜面培養(yǎng)基組成為:干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.Sg，硫酸亞鐵0.02g，葡萄糖20g，瓊脂20g,中草藥粉劑12g,蒸餾水lOOOmL，pH值5.8，121°C滅菌20mino
[0055]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0056]稱取黃芪25份；黨參15份；柴胡12份；黃芩12份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至70°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0057]所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1.2。[0058]( 2)液體種子擴大培養(yǎng)
[0059]①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的斜面菌種以無菌水洗下孢子，接入500毫升搖瓶中，液體種子培養(yǎng)基裝量100毫升，30°c、IOOrpm搖床培養(yǎng)42h ；
[0060]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0061]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以8%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，液體培養(yǎng)基裝量1000毫升，300C、IOOrpm搖床培養(yǎng)42h ；
[0062]④種子罐培養(yǎng):將三級種子以8%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐，種子罐培養(yǎng)基裝量100L，控制pH值為6，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度300rpm，通風量(V/V)l:1,培養(yǎng)時間42h，溶解氧20%;
[0063]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基組成為:磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀
0.8g,硫酸亞鐵0.02g,葡萄糖20g,中草藥粉劑20g,海藻糖20g,蒸懼水lOOOmL, pH值5.5,121°C 滅菌 20min。
[0064]所述種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉55g，豆粉20g，麩皮12g，魚粉12g，氯化鈣Sg，氯化銨2g，磷酸氫二鈉2g，中草藥粉劑18g，海藻糖20g，純凈水lOOOmL，pH值6，121°C滅菌20mino [0065]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.5xl08個/ml ；
[0066](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0067]將步驟(2)中種子罐液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度350r/m，通風量(V/V)l:2，培養(yǎng)時間12h ;然后以2V /h降溫速率緩慢降溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2°C /h降溫速率緩慢降溫至4°C，此時，將步驟(2)中種子罐液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)25h ;最后以2V /h升溫速率緩慢升溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恒溫培養(yǎng)18h ；
[0068]溶解氧控制:通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風量，控制溶解氧20% ；
[0069]PH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在5.2 ；
[0070]補料控制:當發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時,開始添加補料培養(yǎng)基，補料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0071 ] 放罐標準:70%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0072]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉55g，豆粉20g，麩皮12g，魚粉12g，氯化鈣Sg，氯化銨2g，磷酸氫二鈉2g，中草藥粉劑40g，海藻糖20g，純凈水lOOOmL，pH值6，121°C滅菌20mino
[0073]所述補料培養(yǎng)基重量百分比組成為:麥芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉18%，魚粉
1.2%，氯化鈣0.8%，氯化銨0.2%，磷酸氫二鈉0.2%，中草藥粉劑8%，不足部分純凈水補足，pH值 6，123°C滅菌 40min。
[0074](4)發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得固體飼用復合酶。
[0075]所述調(diào)配過程加入濃縮酶液總重量3%中草藥粉劑。
[0076]經(jīng)上述制備方法得到的發(fā)酵液發(fā)酵液粗酶液中含有多種酶活力，其中，蛋白酶活力6700U/ml、甘露聚糖酶活力1700U/ml、a -半乳糖酶活力1300U/ml、果膠酶活力1200U/ml o[0077]實施例3高活力飼用復合酶的熱穩(wěn)定性分析
[0078]對飼用復合酶的熱穩(wěn)定性進行了分析，將實施例4粗酶液分別置于30°C、4(TC、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔10分鐘取樣測定飼用復合酶中各組成酶的酶活。30°C、40V、45°C、50°C下，60分鐘各組成酶酶活沒有下降。55°C、60°C與65°C下，30分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的95%，60分鐘各組成酶酶活降到85%。70°C下，30分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的90%，60分鐘各組成酶酶活降到85%。75°C下，30分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的85%，60分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的80%，與現(xiàn)有技術(shù)相比，同樣條件下達到同樣酶活耐受溫度平均提高了 5-10°C。
[0079]實施例4高活力飼用復合酶的pH穩(wěn)定性分析
[0080]對飼用復合酶酶的pH穩(wěn)定性進行了分析，將實施例4粗酶液分別置于pH值2.0、2.5,3.5,4.5,5.5,6.0,6.5,7.0下，每隔10分鐘取樣測定飼用復合酶中各組成酶的酶活。粗酶液pH值5.5、6.0、6.5、7.0下，60分鐘各組成酶酶活沒有下降。pH值4.5、3.5下，30分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的95%，60分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的85%。pH值2.5下，30分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的90%，60分鐘降到原有酶活的85%。pH值
2.0下，30分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的85%，60分鐘降到原有酶活的80%，與現(xiàn)有技術(shù)相比，同樣條件下達到同樣`酶活耐PH值較寬泛。
【權(quán)利要求】
1.一種高活力飼用復合酶，其特征在于，包括甘露聚糖酶、a-半乳糖酶、果膠酶和蛋白酶，所述高活力飼用復合酶的酶學性質(zhì)如下: (1)溫度:該復合酶中各酶適用溫度范圍為30-75°C，最適反應溫度65°C，在75°C酶活完全穩(wěn)定； (2)pH:該酶適用反應pH值范圍為2.0-7.0，在pH值為2.0時酶活完全穩(wěn)定，最適反應PH值為5-7 ； (3)酶活性:該復合酶發(fā)酵液粗酶液中含有多種酶活力，其中蛋白酶活力6500-6700U/ml、甘露聚糖酶活力1500-1700U/ml、a-半乳糖酶活力1200_1300U/ml、果膠酶活力1000-1200U/ml ； (4)熱穩(wěn)定性:該復合酶發(fā)酵液粗酶液中各酶在70°C條件下保存Ih后保持85%以上酶活，75°C條件下保存Ih后保持80%以上酶活。
2.如權(quán)利要求1所述的高活力飼用復合酶，其特征在于，該酶以高產(chǎn)飼用復合酶的菌株黑曲霉DM-18為出發(fā)菌株，并進行培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝改進，經(jīng)特定發(fā)酵條件下的液體深層混合發(fā)酵制備。
3.如權(quán)利要求2所述的高活力飼用復合酶，其特征在于，制備方法如下:將保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌種經(jīng)菌種活化和一級、二級、三級液體種子及種子罐擴大培養(yǎng)得到液體種子，以6%接種量接入發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度28-30°C，攪拌速度200-700r/m，通風量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時間10-15h ;然后以1-20C /h降溫速率緩慢降溫至10-15。。，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-33°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ;發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得固體飼用復合酶，所述調(diào)配過程加入濃縮酶液總重量0.5-5%中草藥粉劑。
4.如權(quán)利要求3所述的高活力飼用復合酶，其特征在于，所述斜面培養(yǎng)基組成為:干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.Sg,硫酸亞鐵0.02g,葡萄糖20g，瓊脂20g，中草藥粉劑5-20g,蒸餾水1000mL, pH值5.8。
5.如權(quán)利要求3所述的高活力飼用復合酶，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基組成為:磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.8g，硫酸亞鐵0.02g，葡萄糖20g，中草藥粉劑15_25g，海藻糖 10-30g，蒸餾水 lOOOmL，pH 值 5.5。
6.如權(quán)利要求3所述的高活力飼用復合酶，其特征在于，所述種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麩皮10-15g，魚粉10_15g，氯化鈣6_10g，氯化銨l_3g，磷酸氫二鈉l_2g，中草藥粉劑15-20g，海藻糖10_30g，純凈水lOOOmL，pH值5-7。
7.如權(quán)利要求3所述的高活力飼用復合酶，其特征在于，所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為 7.0x108-8.0xlO8 個/ml。
8.如權(quán)利要求3所述的高活力飼用復合酶，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麩皮10-15g，魚粉10_15g，氯化鈣6_10g，氯化銨l_3g，磷酸氫二鈉l-2g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖10_30g，純凈水lOOOmL，pH值5-7。
9.如權(quán)利要求3-8任一所述的高活力飼用復合酶，其特征在于，所述中草藥粉劑的制備方法如下:稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，添加混合物料2_3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1-1.5，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
10.如權(quán)利要求1或 2所述的高活力飼用復合酶在制備飼料復合酶中的應用。
【文檔編號】C12N9/18GK103695396SQ201310716571
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】李洪兵, 李海清, 胡永明, 易繼云, 向左東 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司