用于檢測b型tel-abl融合基因的方法和寡核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測B型TEL-ABL融合基因的方法和寡核苷酸，所述寡核苷酸包括檢測B型TEL-ABL融合基因的引物TA-F、TA-R以及探針TA-Probe；檢測內(nèi)參基因abl的引物abl-F、abl-R以及探針abl-Probe。該寡核苷酸經(jīng)測試特異性好，靈敏度高，操作簡便?？捎糜跈z測人類白血病患者體內(nèi)B型TEL-ABL融合基因是否存在及其表達(dá)水平，同時對高危人群進(jìn)行較為準(zhǔn)確的篩查，可有效地節(jié)約檢測時間，提高檢測精度。
【專利說明】用于檢測B型TEL-ABL融合基因的方法和寡核苷酸
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種用于檢測B型TEL-ABL融合基因的方法和寡核苷酸，采用實時熒光定量PCR技術(shù)，可用于檢測人類白血病患者體內(nèi)B型TEL-ABL融合基因是否存在及其表達(dá)水平，同時對高危人群進(jìn)行較為準(zhǔn)確的篩查，可有效地節(jié)約檢測時間，提聞檢測精度。
【背景技術(shù)】
[0002]TEL-ABL (又可稱為ETV6-ABL)融合基因于1995年首次被報道于國外學(xué)者Papadopoulos的研究中。TEL基因位于人類12號染色體短臂I區(qū)3帶,ABL基因位于人類9號染色體長臂3區(qū)4帶。這兩種基因融合時可能會產(chǎn)生三種斷裂方式，但在mRNA水平上，最終只會出現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)錄體，即A型融合基因和B型融合基因。這兩種類型的融合基因在ABL端的斷裂位置是一致的，即在A型融合基因和B型融合基因中，ABL端均起始自ABL基因的2號外顯子。不同的是:A型融合基因在TEL端的斷裂位置位于TEL基因的4號外顯子出型融合基因在TEL端的斷裂位置位于TEL基因的5號外顯子。這樣的融合方式也說明了 TEL基因的5號外顯子不是TEL-ABL融合基因?qū)е掳籽‘a(chǎn)生所必需的。
[0003]現(xiàn)有的研究已發(fā)現(xiàn)TEL蛋白的HLH結(jié)構(gòu)域可通過寡聚化讓酪氨酸激酶不依賴配體而持續(xù)激活，從而形成血液腫瘤。TEL蛋白的HLH結(jié)構(gòu)域也可與一些轉(zhuǎn)錄因子形成融合蛋白。TEL-ABL融合基因編碼的TEL-ABL融合蛋白是由TEL蛋白的HLH結(jié)構(gòu)域和ABL蛋白的酪氨酸蛋白激酶活性域嵌合而成的。TEL基因和BCR基因均有使ABL受體酪氨酸激酶寡聚化的能力，因而使得T EL-ABL融合基因的致病機(jī)理與BCR-ABL融合基因有些類似:TEL蛋白提供氨基端的HLH結(jié)構(gòu)域，在產(chǎn)生的融合蛋白中HLH結(jié)構(gòu)域的二聚化作用下，使得非受體型酪氨酸激酶ABL基因持續(xù)表達(dá)而使細(xì)胞惡性增殖,導(dǎo)致白血病發(fā)生。
[0004]在已報道的TEL-ABL融合基因陽性病例中，患者的男女比率為2.6:1，平均診斷年齡為48歲，其中多數(shù)患者為慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia, CML)患者，其它也包括了急性髓系白血病未分化型(acute myeloid leukemia-Ml，AML-M1)、慢性骨髓增生瘤(chronic myeloproliferative neoplasm, cMPN)及急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphoblastic leukemia, ALL)患者。
[0005]目前，抑制這種融合基因的有效藥物仍以酪氨酸激酶抑制劑為主(與BCR-ABL融合基因相似)。多篇研究報道了在體外實驗中，酪氨酸激酶抑制劑，如伊馬替尼和尼羅替尼，可以控制TEL-ABL融合基因陽性細(xì)胞的生長。即便如此，TEL-ABL融合基因陽性患者的預(yù)后仍較不理想。在已報道的TEL-ABL融合基因陽性患者中，死亡率約為65%，而且對ALL幼兒患者而言，TEL-ABL融合基因陽性將會是一個預(yù)后不良的指標(biāo)。因此，對TEL-ABL融合基因進(jìn)行定量監(jiān)測，是判斷和追蹤該融合基因陽性的白血病患者療效的良好指標(biāo)，可以較好地反映患者微小殘留病灶(Minimal Residua Disease, MRD)的動態(tài)變化。
[0006]目前臨床上已經(jīng)將TEL-ABL融合基因作為動態(tài)評估患者病情及預(yù)后的手段之一。常用的檢測技術(shù)有熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實時熒光定量PCR(RQ-PCR)等方法。FISH法盡管結(jié)果較為直觀，但是實驗過程繁瑣，涉及試劑種類繁多，費時費力，且結(jié)果需經(jīng)驗豐富的專業(yè)人士來判讀，判讀結(jié)果存在較大的主觀性。而單純的RT-PCR法則為終點定量，無法對起始模板量進(jìn)行準(zhǔn)確的估算。鑒于MRD是白血病患者復(fù)發(fā)的主要原因，因而急需一種高敏感性、高特異性、高自動化程度、污染控制好的方法來對TEL-ABL融合基因mRNA的MRD進(jìn)行檢測。
[0007]RQ-PCR方法具有較高的靈敏度和特異性，而且能對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實時在線檢測，反映TEL-ABL融合基因在樣品中的初始含量，從而節(jié)約了大量的檢測時間，還避免了污染的發(fā)生。常見的實時熒光定量PCR法有SYBR Green I染料法，雙探針雜交法以及Taqman探針法等。其中SYBR Green I由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman探針法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。
[0008]結(jié)合Taqman探針法的RQ-PCR方法，綜合生物學(xué)、酶學(xué)和熒光化學(xué)于一體，從擴(kuò)增到結(jié)果分析均在PCR反應(yīng)管封閉狀態(tài)下進(jìn)行，解決了 PCR產(chǎn)物污染而導(dǎo)致假陽性的問題，同時也提高了敏感度，其結(jié)果用拷貝數(shù)表示，實現(xiàn)了對PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量，易于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，與定性PCR技術(shù)相比，具有特異度好、靈敏度高、操作簡單、自動化程度高、防污染和有較大的線性范圍等優(yōu)點。該方法能夠滿足對B型TEL-ABL融合基因mRNA的MRD的檢測需求。因此本發(fā)明采用RQ-PCR結(jié)合Taqman探針法檢測B型TEL-ABL融合基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]鑒于利用現(xiàn)有技術(shù)檢測B型TEL-ABL融合基因的不足，本發(fā)明設(shè)計了檢測B型TEL-ABL融合基因和內(nèi)參基因abl的寡核苷酸，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測B型TEL-ABL融合基因。通過調(diào)整引物和探針濃度及比例，優(yōu)化PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，可使擴(kuò)增效率和速率均達(dá)到最佳。
[0010]本發(fā)明提供用于檢測B型TEL-ABL融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括:
[0011](1)檢測B型TEL-ABL融合基因的引物TA_F、TA-R及探針TA-Probe，其堿基序列為:
[0012]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測B型TEL-ABL融合基因的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括: (1)檢測B型TEL-ABL融合基因的引物TA_F、TA-R及探針TA-Probe，其堿基序列為:

2.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，TA-F、TA-R和TA-Probe的使用濃度比為 1:1:1。
3.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，abl-F、abl_R和abl-Probe的使用濃度比為1:1:1。
4.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性Imin ;95°C 15s，58°C 35 sec，40個循環(huán)，熒光信號于58°C 35 sec時采集。
5.一種檢測樣品中B型TEL-ABL融合基因的方法，包括如下步驟: (1)提取樣品中的組織RNA; (2)將(I)中提取出的組織RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA； (3)配置B型TEL-ABL融合基因檢測qPCR反應(yīng)液和內(nèi)參基因abl檢測qPCR反應(yīng)液，其中所述B型TEL-ABL融合基因檢測qPCR反應(yīng)液包括檢測B型TEL-ABL融合基因的引物TA-F、TA_R和探針TA-Probe，所述內(nèi)參基因abl檢測qPCR反應(yīng)液包括檢測內(nèi)參基因abl的引物 abl_F、abl-R 和探針 abl-Probe ； (4)將(2)中獲得的cDNA分別加入到(3)中配置的B型TEL-ABL融合基因檢測qPCR反應(yīng)液和內(nèi)參基因abl檢測qPCR反應(yīng)液中； (5)利用實時熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，獲得內(nèi)參基因abl的Ct值和B型TEL-ABL融合基因的Ct值； (6)根據(jù)(5)中的兩種Ct值，確定B型TEL-ABL融合基因是否存在，其特征在于，
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(6)中所述確定B型TEL-ABL融合基因是否存在的具體過程如下， 1)首先依據(jù)內(nèi)參基因abl的Ct值，確定內(nèi)參基因abl是否為陽性，當(dāng)Ct< 35時，為陽性，則檢測有效，當(dāng)所述Ct > 35時，為陰性，則樣品需要重新檢測； 2)若內(nèi)參基因abl為陽性，則根據(jù)B型TEL-ABL融合基因的Ct值判斷B型TEL-ABL融合基因是否為陽性，其判斷標(biāo)準(zhǔn)為=Ct〈35，為陽性；35 ^ Ct ^ 38，為疑似陽性；Ct > 38，為陰性； 3)若B型TEL-ABL融合基因為疑似陽性，需要再次驗證，直到確定所述樣品到底是B型TEL-ABL融合基因陰性或陽性時為止。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(5)的反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性Imin ;950C 15s，58°C 35 sec，40個循環(huán)，熒光信號于58°C 35 sec時采集。
【文檔編號】C12Q1/68GK103757102SQ201310718489
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】陳奕磊, 李文靜, 王淑一 申請人:成都艾迪康醫(yī)學(xué)檢測實驗室有限公司