一種玫煙色棒束孢菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種玫煙色棒束孢菌株（Isariafumosorosea）。該菌株是從江西九連山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)被蟲生真菌自然侵染的家白蟻蟲體上分離獲得的野生菌株，將野生菌株回接于家白蟻蟲體上復(fù)壯獲得本發(fā)明玫煙色棒束孢菌株，對(duì)該菌株采用單孢子分離獲得純化菌株。該純化菌株為玫煙色棒束孢菌株SCAU-IFCF02，于2013年11月1日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO：M2013526。經(jīng)長(zhǎng)期的侵染生物學(xué)研究和室內(nèi)生物測(cè)定，表明該菌株在小菜蛾和家白蟻生物防治中具有非常強(qiáng)的應(yīng)用潛力。
【專利說明】一種玫煙色棒束孢菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，涉及一種玫煙色棒束孢菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]昆蟲病原真菌是殺蟲微生物的重要組成部分，約占昆蟲病原微生物種類的60%以上。微生物農(nóng)藥的大量開發(fā)利用可有效降低和消除目前化學(xué)農(nóng)藥普遍存在的殘留、毒性和抗藥性等諸多負(fù)面作用。玫煙色棒束孢(/saria /i/fflosoriosea)是一種重要的昆蟲病原真菌，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，能寄生包括同翅目、雙翅目、鱗翅目、半翅目、鞘翅目和膜翅目等多種蔬菜、果樹及茶樹害蟲。玫煙色棒束孢對(duì)害蟲高效、對(duì)環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，因此成為國(guó)內(nèi)外生物防治研究的熱點(diǎn)。用真菌微生物農(nóng)藥防治植物病蟲害是無公害農(nóng)產(chǎn)品可持續(xù)生產(chǎn)中的重要手段之一，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]玫煙色棒束孢作為一種常見的昆蟲病原真菌應(yīng)用于害蟲防治，其生長(zhǎng)發(fā)育受多種生態(tài)因子影響，對(duì)寄主昆蟲的致病過程復(fù)雜，并涉及多種基因及其產(chǎn)物的調(diào)控，實(shí)踐應(yīng)用防效不穩(wěn)定，限制了其應(yīng)用。菌株改良雖可提高毒力并擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，但仍存在很多待解決或未知的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有玫煙色棒束孢菌株防治害蟲效果差及防效不穩(wěn)定等缺陷和技術(shù)不足，提供一種玫煙色棒束孢菌株。
[0005]本發(fā)明目的是提供上述玫煙色棒束孢菌株及其培養(yǎng)方法。
[0006]本發(fā)明上述目的通過`以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供了一種玫煙色棒束孢菌株，所述菌株為玫煙色棒束孢(hariafumosorosea (Wize) Brown & Smith)菌株 SCAU-1FCF02,該菌株于 2013 年 11 月 I 日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2013526，保藏地址為中國(guó)武漢市武漢大學(xué)。
[0007]所述玫煙色棒束孢菌株SCAU-1FCF02屬絲孢目、棒束孢屬。
[0008]所述玫煙色棒束孢菌株SCAU-1FCF02的形態(tài)學(xué)特征描述如下:
菌落形態(tài):菌落正面絨毛狀，初白色，產(chǎn)孢后呈淡玫煙色，凹凸蓬松粉層；背面乳黃色，中心至邊緣半徑15mm圓內(nèi)多條丘狀隆起。
[0009]菌絲和孢子形態(tài):通過顯微觀察，可以看到分生孢子梗著生在營(yíng)養(yǎng)菌絲上。菌絲分隔，透明，光滑，寬1.5~2.5Mm。分生孢子梗單生或者聚集成孢梗束，100X 1.5~100X2.0Mm，壁光滑，透明，大多由著生4~6個(gè)瓶梗組成輪生體的輪狀分枝組成。瓶?；壳蛐危驍M橢圓形膨大，上部細(xì)長(zhǎng)，5.7~8.0X 1.0~2.0Mm。分生孢子球形至近梭形,光滑，透明至微淡紅色，3.0~4.0X1.0~2.0Mm,無厚垣孢子。
[0010]本發(fā)明獲得玫煙色棒束孢菌株SCAU-1FCF02的步驟如下:
S1.采樣:從江西九連山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)采取被蟲生真菌自然侵染的家白蟻；52.分離:從采回的被蟲生真菌感染的家白蟻蟲尸樣品上分離病原菌。利用5%的次氯酸鈉溶液對(duì)樣品進(jìn)行表面消毒，消毒后的樣品在滅菌水中洗滌3次，并放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板中，置于25土 1°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待菌落形成后,轉(zhuǎn)移到PDA斜面，再轉(zhuǎn)入4°C冰箱內(nèi)保存；
53.復(fù)壯:將分離到的菌株在PDA平板上培養(yǎng)15天，待形成菌落后加入含有0.03%吐溫-80的無菌水洗下孢子，然后移入燒杯中，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌30分鐘，稀釋為IX IO7個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，用小型手動(dòng)噴霧器均勻噴于家白蟻工蟻體表，保濕90%~100%，7 d后挑取感染的家白蟻，按照前面所述的方法分離得到A分離株；
54.純化:A分離株在PDA平板上培養(yǎng)15d，待形成玫煙色孢子后，挑取分生孢子制成
IX IO3個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，將懸浮液滴于放有蓋玻片的載玻片上，在生物顯微鏡下觀察，將一個(gè)液滴中只有一個(gè)分生孢子的玻片插入PDA培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，獲得B、C、D、E、F共5個(gè)分尚株；
55.鑒定:根據(jù)病原菌的培養(yǎng)形狀、菌絲、分生孢子和產(chǎn)孢器的形態(tài)進(jìn)行初步鑒定；
56.篩選:分別測(cè)定5個(gè)分離株對(duì)靶標(biāo)害蟲的致病力、菌株產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和菌落生長(zhǎng)速率，比較結(jié)果篩選出活性強(qiáng)、對(duì)害蟲防效最好的玫煙色棒束孢菌株。經(jīng)美國(guó)農(nóng)業(yè)部歐洲生物防治實(shí)驗(yàn)室昆蟲病理學(xué)專家Guy Mecardier鑒定為Jsaria fumosorosea (Wize)Brown & Smith，菌株命名為SCAU-1FCF02，于2013年11月I日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2013526，保藏地址為中國(guó)武漢市武漢大學(xué)。
[0011]本發(fā)明所用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)配方為:200g馬鈴薯，17~20g瓊脂，20g葡萄糖，1000mL水,分裝,高壓滅菌鍋滅菌(121°C, 30min)。
`[0012]蟲生真菌在遺傳、生態(tài)及生物學(xué)特性方面具有多樣性，同種真菌的不同菌株對(duì)目標(biāo)害蟲的致病力存在著顯著的差異，菌株不同，其LD5(1、LT5tl可相差數(shù)倍甚至數(shù)十倍。篩選和獲得高產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率高和致病力強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)菌株，是取得良好防治效果的前提和必要環(huán)節(jié)。在已報(bào)道的對(duì)小菜蛾毒力比較強(qiáng)的病原真菌中，球孢白僵菌CS-1在處理濃度為IXlO5孢子/ml時(shí)，在溫室條件下對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的LT5tl為3.61天(Yoon et al.,1999);綠僵菌在處理濃度為I X IO8孢子/ml時(shí)，小菜蛾2齡幼蟲的LT5tl為4.97天，對(duì)小菜蛾 2 齡幼蟲的 LC5tl 為 2.03 X IO4 孢子/ml (Ma，2000)。
[0013]菌株篩選常用的4個(gè)指標(biāo)分別是菌株對(duì)靶標(biāo)害蟲的致病力、菌株產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和菌落生長(zhǎng)速率。本發(fā)明以上述指標(biāo)為依據(jù)，篩選得到玫煙色棒束孢的優(yōu)良菌株SCAU-1FCF02。接種玫煙色棒束孢菌株SCAU-1FCF02后第2天，各處理中2齡幼蟲均開始發(fā)病死亡，表明所述菌株對(duì)小菜蛾具有非常強(qiáng)的致病力。在最高濃度I X IO7個(gè)孢子/mL時(shí)，小菜蛾2、3和4齡幼蟲的累計(jì)校正死亡率分別為100%,98.93%,87.23%。在小菜蛾2、3和4齡幼蟲接種后第7天，致死中濃度LC50分別為7.63 X IO3個(gè)孢子/mL、1.05 X IO4個(gè)孢子/mL和2.40 X IO4個(gè)孢子/mL。接種玫煙色棒束孢菌株SCAU-1FCF02后小菜蛾2、3和4齡幼蟲的LC50分別為7.63X 103、1.05X 104、2.40父104個(gè)孢子/11^。在處理濃度為I X IO7個(gè)孢子/mL時(shí)，2、3和4齡幼蟲的LT50分別為1.61天、1.66天和1.80天。相比于目前常用的玫煙色棒束孢菌株，本發(fā)明所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株對(duì)小菜蛾幼蟲具有顯著的高致病力，這從其對(duì)小菜蛾的致死中濃度和致死中時(shí)兩方面均可以表現(xiàn)出來。玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株是目前為止所報(bào)道的對(duì)小菜蛾幼蟲具最低的致死濃度和最快的致死速度的昆蟲病原真菌，表現(xiàn)出該菌株在小菜蛾生物防治中具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。
[0014]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了一種玫煙色棒束孢菌株SCAU-1FCF02，該菌株能夠防治十字花科蔬菜害蟲，尤其是對(duì)家白蟻和小菜蛾的防治效果非常顯著，是目前為止所報(bào)道的對(duì)小菜蛾幼蟲致死濃度最低和致死速度最快的昆蟲病原真菌，在家白蟻和小菜蛾生物防治中具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。
[0015]另外，玫煙色棒束孢菌株SCAU-1FCF02是一種昆蟲病原真菌，作為一種活體生物農(nóng)藥，具有不同于現(xiàn)有化學(xué)殺蟲劑的全新的作用機(jī)理，對(duì)環(huán)境無污染、無殘留，對(duì)人類和家畜安全，適應(yīng)了有機(jī)食品生產(chǎn)的要求；且該菌株是從江西九連山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)被侵染的家白蟻蟲體上分離獲得，為中國(guó)本土的菌株，并非從國(guó)外引進(jìn)，能適應(yīng)本地的自然環(huán)境。在家白蟻和小菜蛾等十字花科蔬菜害蟲的生物防治中具有很強(qiáng)的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0017]除非特別說明，本發(fā)明所用試劑均為常規(guī)方法配制或市購，玫煙色棒束孢菌株的培養(yǎng)均按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)。
[0018]實(shí)施例中所用的含有0.03%吐溫-80的無菌水，所述的0.03%指的是體積比。
[0019]實(shí)施例1玫煙色棒束孢菌株SCAU_IFCR)2的獲得
1、實(shí)驗(yàn)材料和條件
(I)在江西九連山國(guó)家級(jí)自然`保護(hù)區(qū)采集到一種被蟲生真菌侵染的家白蟻(Cop to termes formosanus ) 尸3。
[0020](2)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):200g馬鈴薯，17~20g瓊脂，20g葡萄糖，1000mL水,分裝,高壓滅菌鍋滅菌(121°C, 30min)。
[0021](3)無菌操作條件:所有器皿和用具均須經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌(121°C，30min)，接種等操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。
[0022](4)菌株培養(yǎng)條件:置于25± 1°C光照恒溫箱(14L: 10D)中培養(yǎng),待菌落形成后,轉(zhuǎn)移到PDA斜面，再轉(zhuǎn)入4°C冰箱內(nèi)保存。
[0023]2、病原菌的分離與鑒定
(I)分離:從采回的被蟲生真菌感染的家白蟻蟲尸樣品上分離病原菌。利用5%的次氯酸鈉溶液對(duì)樣品進(jìn)行表面消毒，消毒后的樣品在滅菌水中洗滌3次，并放入PDA平板中，置于25±1°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉(zhuǎn)移到PDA斜面，再轉(zhuǎn)入4°C冰箱內(nèi)保存。
[0024](2)復(fù)壯:將分離到的菌株在PDA平板上培養(yǎng)15天，待形成菌落后用含有0.03%吐溫-80的無菌水洗下孢子，獲得孢子懸浮液，移入燒杯中，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌30分鐘，稀釋為IX IO7個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，用小型手動(dòng)噴霧器均勻噴于家白蟻工蟻體表，保濕90%~100%，7d后挑取感染的家白蟻，按照(I)所述的方法分離得到A分離株。
[0025](3)純化:對(duì)A分離株分別在PDA平板上培養(yǎng)15d，待形成玫煙色孢子后，挑取分生孢子制成IXlO3個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，將懸浮液滴于放有蓋玻片的載玻片上，在生物顯微鏡下觀察，將一個(gè)液滴中只有一個(gè)分生孢子的玻片插入PDA培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，獲得B、C、D、E、F共5個(gè)分離株。
[0026](4)鑒定:根據(jù)病原菌的培養(yǎng)形狀、菌絲、分生孢子和產(chǎn)孢器的形態(tài)進(jìn)行初步鑒定。
[0027]菌落形態(tài)描述:菌落正面絨毛狀，初白色，產(chǎn)孢后呈淡玫煙色，凹凸蓬松粉層；背面乳黃色，中心至邊緣半徑15_圓內(nèi)多條丘狀隆起。
[0028]菌絲和孢子形態(tài)描述:通過顯微觀察，可以看到分生孢子梗著生在營(yíng)養(yǎng)菌絲上。菌絲分隔，透明，光滑，寬1.5~2.5Mm。分生孢子梗單生或者聚集成孢梗束，100X1.5~100X2.0Mm,壁光滑，透明，大多由著生4~6個(gè)瓶梗組成輪生體的輪狀分枝組成。瓶?；壳蛐危驍M橢圓形膨大，上部細(xì)長(zhǎng)，5.7~8.0X 1.0~2.0Mm。分生孢子球形至近梭形,光滑，透明至微淡紅色，3.0~4.0X1.0~2.0Mm,無厚垣孢子。
[0029]3、玫煙色棒束孢菌株SCAU-1FCF02的篩選
蟲生真菌在遺傳、生態(tài)及生物學(xué)特性方面具有多樣性，同種真菌的不同菌株對(duì)目標(biāo)害蟲的致病力存在著顯著的差異，菌株不同，其LD5(1、LT5tl可相差數(shù)倍甚至數(shù)十倍。篩選和獲得高產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率高和致病力強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)菌株，是取得良好防治效果的前提和必要環(huán)節(jié)。菌株篩選常用的4個(gè)指標(biāo)分別是菌株對(duì)靶標(biāo)害蟲的致病力、菌株產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和菌落生長(zhǎng)速率。本發(fā)明以上述指標(biāo)為依據(jù)，篩選玫煙色棒束孢的優(yōu)良菌株。
[0030]( I)供試菌株的處理
經(jīng)純化后獲得的玫煙色棒束孢B、C、D、E、F共5個(gè)分離株，在PDA平板上于25± I °〇的恒溫箱(光照周期為光照:黑暗=14:10)中培養(yǎng)。
[0031](2)供試蟲源` 家白蟻采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，室內(nèi)利用松木塊飼養(yǎng)工蟻和白蟻，實(shí)驗(yàn)挑取健康的工蟻供室內(nèi)毒力測(cè)定。
[0032](3)菌落生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量的測(cè)定
將5個(gè)分離株分別配制成I X IO7個(gè)孢子/mL的分生孢子懸浮液，分別取500μ?懸浮液滴入PDA培養(yǎng)基上，用三角玻璃棒涂勻，待2~3d長(zhǎng)出菌絲后用直徑為5mm的打孔器鉆取新鮮菌落，并接種于PDA平板上，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(14L:10D)。每菌株5個(gè)重復(fù)。每2天定時(shí)定方向測(cè)量菌落直徑的增長(zhǎng)量，共測(cè)4次，計(jì)算生長(zhǎng)速率(mm/天)。繼續(xù)培養(yǎng)至第15d，測(cè)定各菌株的產(chǎn)孢量。具體操作如下:用直徑13_的滅菌打孔器在菌落中心至邊緣1/2處打孔取樣，樣品放入IOmL含有0.03%吐溫-80的無菌水中，在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，使孢子分散均勻，制成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)測(cè)定產(chǎn)孢量。結(jié)果如表1所示。
[0033](4)孢子萌發(fā)率的測(cè)定
將5個(gè)分離株分別培養(yǎng)15d后，用含有0.03%吐溫-80的無菌水收集孢子并制成懸浮液(每視野內(nèi)100個(gè)左右分生孢子)，用載玻片萌發(fā)法試驗(yàn)，將孢子懸浮液直接滴在無菌載玻片上，置于底部鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在皿內(nèi)滴加4~5滴無菌水以保持100%的相對(duì)濕度(RH)，培養(yǎng)18h后鏡檢。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。結(jié)果如表1所示。
[0034](5)分離株對(duì)家白蟻工蟻的致病力測(cè)定。
[0035]制備各供試菌株的孢子懸浮液:將各供試菌株接種于PDA平板上培養(yǎng)15d，用含有
0.03%吐溫-80的無菌水洗下孢子，用磁力攪拌器攪拌30min，雙層滅菌紗布濾去菌絲，制成孢子懸浮液，并用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度為I X IO7個(gè)孢子/mL。[0036]試蟲處理:采用浸蟲法測(cè)定各分離株對(duì)家白蟻工蟻的致病力。選取健康的工蟻，用軟鑷子將供試工蟻挑入各分離株孢子懸浮液的稀釋液(用含有0.03%吐溫-80的無菌水進(jìn)行稀釋)中，浸潰IOs后挑出，將工蟻置于滅菌的濾紙上吸干多余水分后，移至底部襯有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9cm)內(nèi)，培養(yǎng)皿用保鮮膜封口，在薄膜上扎孔通氣，每個(gè)處理20頭工蟻，重復(fù)5次，共100頭工蟻。另以含有0.03%吐溫-80的無菌水作為對(duì)照，操作方法同上，重復(fù)5次。接種后，將各處理置于人工智能箱中內(nèi)，25± I°C，相對(duì)濕度90%，光照周期為光照:黑暗=14:10。12小時(shí)后開始觀察，用濾紙飼養(yǎng)處理的工蟻，視皿內(nèi)濾紙被取食情況更換新鮮的濾紙。記錄工蟻感病癥狀和死亡蟲數(shù)，共計(jì)錄7天。統(tǒng)計(jì)校正死亡率。結(jié)果如表I所示。
[0037](6)玫煙色棒束孢分離株的篩選
在篩選優(yōu)良分離株時(shí)，致病性和產(chǎn)孢量是重要的參考指標(biāo)，孢子萌發(fā)率和菌落平均生長(zhǎng)速率次之。在本發(fā)明中，從表1可以看出，菌株B的菌落平均生長(zhǎng)速率顯著高于其余菌株，B菌株的菌落生長(zhǎng)速率最快，為15.79mm/天，并且菌株B的產(chǎn)孢量在5個(gè)分菌株中也是最高的，達(dá)到2.71 X IO7個(gè)孢子/mL。菌株D次之為2.32 X IO7個(gè)孢子/mL。在孢子萌發(fā)率方面，各分離株孢子萌發(fā)率差異顯著，其中以菌株B和C孢子萌發(fā)率最高為92.11%和90.39%。生測(cè)結(jié)果顯示:菌株B感染家白蟻的校正死亡率最高，達(dá)到100%，顯示出超強(qiáng)的致病力。
[0038]表1菌株生物學(xué)特性及其對(duì)家白蟻工蟻的校正死亡率
【權(quán)利要求】
1.一種玫煙色棒束孢菌株(/saria /i/fflosariosea),其特征在于,所述菌株為玫煙色棒束孢菌株SCAU-1FCF02，該菌株于2013年11月I日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC NO:M 2013526。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玫煙色棒束孢菌株(/saria/i/fflosariosea),其特征在于,所述的玫煙色棒束孢菌株SCAU-1FCF02屬絲孢目、棒束孢屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玫煙色棒束孢菌株(/saria/i/fflosariosea),其特征在于,所述的玫煙色棒束孢菌株SCAU-1FCF02的形態(tài)學(xué)特征描述如下: 菌落正面絨毛狀，初白色，產(chǎn)孢后呈淡玫煙色，凹凸蓬松粉層；背面乳黃色，中心至邊緣半徑15mm的圓內(nèi)有多條丘狀隆起； 菌絲分隔，透明，光滑，寬1.5~2.5Mm； 分生孢子梗單生或者聚集成孢梗束，100X1.5~100X2.0Mm，壁光滑，透明，大多由著生4~6個(gè)瓶梗組成輪生體的輪狀分枝組成；瓶?；壳蛐?，或擬橢圓形膨大，上部細(xì)長(zhǎng)，5.7 ~8.0 X 1.0 ~2.0Mm ； 分生孢子球形至近梭形，光滑，透明至微淡紅色，3.0~4.0X 1.0~2.0Mm,無厚垣孢子。
4.權(quán)利要求1、2或3所述的玫煙色棒束孢菌株的分離方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.采樣:從江西九連山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)采取被蟲生真菌自然侵染的家白蟻； 52.分離:從采回的被蟲生真菌感染的家白蟻蟲尸樣品上分離病原菌，利用5%的次氯酸鈉溶液對(duì)樣品進(jìn)行表面消毒，消毒后的樣品在滅菌水中洗滌，并放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板中，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉(zhuǎn)移到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板斜面，冷藏保存； 53.復(fù)壯:將分離到的菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，待形成菌落后加入含有0.03%吐溫-80的無菌水洗下孢子獲得孢子懸浮液，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌30分鐘后，稀釋為I X IO7個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，均勻噴于家白蟻工蟻體表，保濕90%~100%，7 d后挑取感染的家白蟻，按照S2所述的方法分離得到A分離株； 54.純化:A分離株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，待形成玫煙色孢子后，挑取分生孢子制成IXlO3個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，將懸浮液滴于放有蓋玻片的載玻片上，在生物顯微鏡下觀察，將一個(gè)液滴中只有一個(gè)分生孢子的玻片插入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，獲得B、C、D、E、F共5個(gè)分離株； 55.鑒定:根據(jù)病原菌的培養(yǎng)形狀、菌絲、分生孢子和產(chǎn)孢器的形態(tài)進(jìn)行初步鑒定； 56.篩選:分別測(cè)定5個(gè)分離株對(duì)靶標(biāo)害蟲的致病力、菌株產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和菌落生長(zhǎng)速率，比較結(jié)果篩選出活性強(qiáng)、對(duì)害蟲防效最好的玫煙色棒束孢菌株，即玫煙色棒束孢菌株 SCAU-1FCF02。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離方法，其特征在于，所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的配制方法為:0.2g/mL的馬鈴薯，0.017~0.02g/mL的瓊脂，0.02g/mL的葡萄糖，加水定容，分裝，121°C滅菌。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103756913SQ201310721109
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】何余容, 呂利華, 念曉歌 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)