生產(chǎn)β-丙氨酸的重組大腸桿菌菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明首要目的公開了一種生產(chǎn)β-丙氨酸的重組大腸桿菌菌株（Escherichiacoli）AHB-36，其保藏編號為CCTCC?M?2013629，所述的重組大腸桿菌菌株缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因，且含有天冬氨酸-1-脫羧酶基因；本發(fā)明的另外一個目的是提供一種上述重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，本發(fā)明構(gòu)建的重組大腸桿菌菌株敲除了天冬氨酸氨基裂解酶基因，阻止了大腸桿菌把天冬氨酸裂解為富馬酸，使得天冬氨酸全部用于β-丙氨酸的生產(chǎn)，同時該重組大腸桿菌菌株中表達(dá)天冬氨酸-1-脫羧酶，可進(jìn)一步提高β-丙氨酸的收率。
【專利說明】生產(chǎn)β-丙氨酸的重組大腸桿菌菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是涉及一種生產(chǎn)β -丙氨酸的重組大腸桿菌菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]β_丙氨酸在醫(yī)藥和食品【技術(shù)領(lǐng)域】都有廣泛的應(yīng)用，其主要用于合成泛酸、泛酸鈣，以及食品的營養(yǎng)添加劑，國內(nèi)外有關(guān)丙氨酸的生產(chǎn)，基本上以化學(xué)合成為主，如丙烯酸法、丙烯腈法等，這些化學(xué)合成法大多需要強堿強酸、高溫高壓等條件，而且產(chǎn)物純化繁瑣，對環(huán)境造成污染，特別是采用含腈的原料進(jìn)行合成，對環(huán)境及生物體都會造成損害，因此積極尋求綠色、環(huán)保的β-丙氨酸的生產(chǎn)方法具有十分重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
[0003]中國雜志《氨基酸和生物資源》2005年第27卷第I期第52_55頁中公開了一種名稱為“ β -氨基丙酸的合成與應(yīng)用”的期刊論文(β -丙氨酸又名β -氨基丙酸)，其中介紹到及川利洋等人利用產(chǎn)有機腈降解酶的微生物催化氨基丙腈水解合成丙氨酸，得到的β -丙氨酸產(chǎn)物濃度達(dá)47mmol/L (約為4.2g/L)，田脇新一郎等人利用微生物轉(zhuǎn)化β -氨基丙醇合成β -丙氨酸，得到的產(chǎn)物濃度達(dá)4g/L，但是上述生物法生產(chǎn)β -丙氨酸的產(chǎn)量較低，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。根據(jù)催化反應(yīng)原理，天冬氨酸-1-脫羧酶可以催化L-天冬氨酸生成β -丙氨酸，采用該方法的制備工藝為一步法反應(yīng)，工藝簡單，且副產(chǎn)物少，對環(huán)境污染小。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的首要目的提供一種生產(chǎn)丙氨酸的生產(chǎn)丙氨酸的重組大腸桿菌菌株(EscherichiacoI i ) AHB-36，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC M2013629 (地址:武漢市武昌珞珈山，郵編:430072)，保藏日期為2013年12月4日，所述的重組大腸桿菌菌株缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因，且含有天冬氨酸-1-脫羧酶基因，天冬氨酸-1-脫羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0005]本發(fā)明的另外一個目的是提供一種上述重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0006]1)敲除大腸桿菌的天冬氨酸氨基裂解酶基因；
[0007]2)篩選缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因的陽性克隆，該陽性克隆命名為菌株I ;
[0008]3)雙酶切質(zhì)粒pET24a ( + )以及谷氨酸棒桿菌的PanD基因，用T4連接酶將酶切產(chǎn)物pET24a ( + )和PanD的DNA片段進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET24a_PanD。
[0009]4)通過熱激法將重組質(zhì)粒pET24a_PanD轉(zhuǎn)入菌株I中，即得用于生產(chǎn)β _丙氨酸的重組大腸桿菌菌株。
[0010]本發(fā)明敲除大腸桿菌的天冬氨酸氨基裂解酶基因，使得天冬氨酸氨基裂解酶的活性缺失，從而避免天冬氨酸通過其他途徑代謝，這樣天冬氨酸即可全部用于發(fā)酵轉(zhuǎn)化得到β-丙氨酸，有效提高β-丙氨酸的產(chǎn)率。簡單的說，基因敲除是指將基因組中的目標(biāo)基因刪除或者破壞，而本發(fā)明敲除大腸桿菌的天冬氨酸氨基裂解酶基因的方法是破壞目標(biāo)基因，即在大腸桿菌的基因組中插入一段外源基因，使得大腸桿菌的天冬氨酸氨基裂解酶的活性喪失，從而實現(xiàn)天冬氨酸氨基裂解酶基因的敲除，本發(fā)明具體敲除大腸桿菌的天冬氨酸氨基裂解酶基因的步驟為:
[0011]a)以piJ773質(zhì)粒的DNA為PCR擴增模板擴增Apr基因，PCR擴增Apr基因所用的引物 aspA-KO-U、aspA-KO-D 的核苷酸序列如 SEQIDN0.2 和 SEQIDN0.3 所示；
[0012]b)通過電轉(zhuǎn)化法將PCR擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌中，即得敲除天冬氨酸氨基裂解酶基因的大腸桿菌；所述PCR擴增的條件為:94°C預(yù)變性5min，I個循環(huán)；94°C變性 45s、50°C退火 45s、72°C延伸 90s，10 個循環(huán)；94°C變性 45s、55°C退火 45s、72°C延伸90s，15個循環(huán)；72°C延伸10min，l個循環(huán)，所述的pKD46質(zhì)粒主要用于原核生物的基因敲除，攜帶該質(zhì)粒的菌株通過PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化來進(jìn)行基因敲除時效率較高。
[0013]篩選缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因的大腸桿菌的方法為采用兩對引物對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗證，第一對引物aspA-1-F、aspA-1-R的核苷酸序列如SEQIDN0.4和SEQIDN0.5所示，第二對引物aspA-2-F、aspA-2-R的核苷酸序列如SEQIDN0.6和SEQIDN0.7所示。
[0014]本發(fā)明的最后一個目的是提供一種上述重組大腸桿菌菌株在生產(chǎn)丙氨酸中的應(yīng)用，具體的，重組大腸桿菌菌株發(fā)酵催化L-天冬氨酸生成β -丙氨酸。
[0015]本發(fā)明構(gòu)建的重組大腸桿菌菌株敲除了天冬氨酸氨基裂解酶基因，阻止了大腸桿菌把天冬氨酸裂解為富馬酸，使得天冬氨酸全部用于丙氨酸的生產(chǎn)，同時該重組大腸桿菌菌株中表達(dá)天冬氨酸-1-脫羧酶，進(jìn)一步提高β -丙氨酸的產(chǎn)率，β -丙氨酸的生產(chǎn)過程采用常溫常壓操作，生產(chǎn)的原料及產(chǎn)物均無有害有毒物質(zhì)，采用本發(fā)明構(gòu)建的重組大腸桿菌菌株用于β-丙氨酸的生產(chǎn)過程不斷流加L-天冬氨酸，使得β-丙氨酸濃度逐漸積累，反應(yīng)結(jié)束后只需要經(jīng)過簡單的過膜除菌體，脫色，結(jié)晶，重結(jié)晶就可以得到精制品，采用本發(fā)明構(gòu)建的重組大腸桿菌菌株進(jìn)行生物酶法轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸以生產(chǎn)β -丙氨酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%以上，產(chǎn)品純度達(dá)99%以上，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0017]圖2是pIJ773質(zhì)粒的圖譜；
[0018]圖3是pKD46質(zhì)粒的圖譜；
[0019]圖4是pET24a_PanD重組質(zhì)粒的圖譜；
【具體實施方式】
[0020]以下結(jié)合實施例1~5對本發(fā)明公開的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明:
[0021]實施例1
[0022]缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因的大腸桿菌菌株的構(gòu)建及鑒定:
[0023]I)擴增Apr基因:以piJ773質(zhì)粒的DNA為PCR擴增模板擴增Apr基因(piJ773質(zhì)粒購自合肥百邁生物技術(shù)有限公司)，所述的Apr基因也就是氨芐青霉素抗性基因，PCR擴增Apr基因所用的引物aspA-K0-U、aspA-K0-D的核苷酸序列如SEQIDN0.2和SEQIDN0.3所示，PCR擴增體系為:DNA模板20ng，引物(IOuM)Iul,蒸餾水40ul ;PCR擴增條件為:94°C預(yù)變性5min，I個循環(huán)；94°C變性45s、50°C退火45s、72°C延伸90s，10個循環(huán)；94°C變性45s、55°C退火45s、72°C延伸90s, 15個循環(huán)；72°C延伸IOmin, I個循環(huán)。
[0024]2)獲取DNA片段:消化步驟I得到的PCR產(chǎn)物，即消化從pIJ773質(zhì)粒的DNA中擴增出的Apr基因，從而除去pIJ773質(zhì)粒以獲取待轉(zhuǎn)化的DNA片段，消化體系為:Tangobuffe5 μ 1，PCR產(chǎn)物45 μ 1，DpnI酶I μ I ;消化條件為:在37°C條件下保溫lh，將獲取的消化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳跑膠，收回膠段，用冷凍干燥機把收回的膠段濃縮到2μ I左右。
[0025]3)轉(zhuǎn)化DNA片段:將pKD46質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)(PKD46質(zhì)粒和大腸桿菌BL21(DE3)購自合肥百邁生物技術(shù)有限公司)，制作大腸桿菌BL21 (DE3) -pKD46的感受態(tài)細(xì)胞，然后將步驟2的濃縮產(chǎn)物用PCR純化試劑盒清洗(PCR純化試劑盒購自合肥百邁生物技術(shù)有限公司，英文名稱為EasyPurePCRPurificationKit),取30ng清洗純化后的產(chǎn)物，加入2ulIigationBuffer (購自NEB公司)，lulT4連接酶，在室溫下反應(yīng)lh，然后取5ul加入50ul的BL21(DE3)-pKD46的感受態(tài)細(xì)胞中，先冰浴20min，然后在42°C條件下熱激30S后立即置于冰上2min，加入250ul的LB平板培養(yǎng)基，200轉(zhuǎn)，37°C孵育lh，取200ul菌液涂布在含有25mg/L卡那霉素的LB平板上。
[0026]4)菌株的鑒定:待轉(zhuǎn)化子長出后，挑取轉(zhuǎn)化子用第一對引物aspA-1-F和aspA-1-R進(jìn)行驗證，經(jīng)PCR驗證為正確轉(zhuǎn)化子，正確轉(zhuǎn)化子片段長度為877bp ;挑取轉(zhuǎn)化子用第二對驗證引物spA-2-F和aspA-2-R進(jìn)行驗證，經(jīng)PCR驗證為正確轉(zhuǎn)化子，正確轉(zhuǎn)化子片段長度為1411bp，驗證菌株所用的第一對引物aspA-1-F、aspA-1-R的核苷酸序列如SEQIDN0.4和SEQIDN0 .5所示，第二對引物aspA-2-F、aspA-2-R的核苷酸序列如SEQIDN0.6 和 SEQIDN0.7 所示，PCR 驗證的擴增體系為:10 Xbuffer (含 Mg2+) 5ul ；dNTP(2.5mMeachdNTP) 2ul ;引物 I (IOuM) Iul ;引物 2 (IOuM) Iul ；DNA 模板 2ul ；Taq0.5ul ；ddH2038.5ul ;PCR驗證的擴增條件為:94°C預(yù)變性5min，I個循環(huán)；94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸90s，30個循環(huán)；72°C延伸lOmin，I個循環(huán)；挑取PCR驗證后的單菌落培養(yǎng)，加入天冬氨酸溶液，在37°C、pH值為7.0的條件下培養(yǎng)12h后，天冬氨酸濃度保持穩(wěn)定，說明挑選得到的菌株I是目標(biāo)菌株，將篩選得到的菌株I命名為BL21 (DE3) AaspA。
[0027]實施例2
[0028]本發(fā)明的重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建及鑒定:
[0029]I)重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建:
[0030]第一步，用NdeI和HindIII雙酶切谷氨酸棒桿菌的PanD基因，得到PanD基因的DNA片段，所述的PanD基因也就是谷氨酸棒桿菌的天冬氨酸_1_脫羧酶基因，用NdeI和HindIII雙酶切質(zhì)粒pET24a(+) (Novagen公司產(chǎn)品),所述質(zhì)粒pET24a(+)大小為5.3Ikb,其含有卡那霉素抗性基因和乳糖抑制子IacI基因，啟動子是T71ac，并具有多個限制性內(nèi)切酶位點，所述的酶切體系為:DNA43y I, bufferR5y I, HindIIIl μ 1，NdeIl μ I ;酶切條件為:在37°C保溫3h，如附圖3所示是酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，瓊脂糖凝膠的濃度為
1.0%，其中I~3泳道是NdeI和HindIII雙酶切質(zhì)粒pET24a(+)后的DNA片段，M泳道是DNA分子量標(biāo)簽，由下至上分子量依次為:0.25kb，0.50kb，0.75kb, 1.0kb, 1.5kb, 2.0kb，
2.5kb, 3.0kb, 3.5kb, 4.0kb, 5.0kb, 6.0kb, 10.0kb,從圖中可以看出經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳跑膠鑒定，酶切產(chǎn)物確定含有目的DNA片段；[0031]第二步，回收酶切的DNA片段膠，用T4連接酶連接PanD基因和質(zhì)粒pET24a(+)的DNA 片段，連接體系為:PanD7.5μ 1，質(zhì)粒 pET24a(+)l.5μ 1，bufferly I, T4 連接酶 I μ 1，連接條件為:在16°C條件下保溫過夜；
[0032]第三步，取5ul的連接產(chǎn)物加入到菌株BL21(DE3) AaspA的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴20min，42°C熱激30S，立即置于冰上2min，涂布到LB平板培養(yǎng)基上，所述LB平板培養(yǎng)基上含有1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%氯化鈉、1.5%瓊脂粉，以及50 μ g/ml卡那霉素。
[0033]2)重組大腸桿菌菌株的鑒定:在37°C條件下LB平板培養(yǎng)基上生長出轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落，用LB液體培養(yǎng)基將單菌落在37 °C條件下培養(yǎng)過夜，離心lmin，離心速度為12000rpm/min，提取質(zhì)粒，提取方法按照質(zhì)粒提取試劑盒(購自南京生興生物技術(shù)公司)的說明書操作。
[0034]實施例3
[0035]本發(fā)明的重組腸桿菌菌株的發(fā)酵及酶活測定:
[0036]1)重組腸桿菌菌株的發(fā)酵:
[0037]第一步，配種子液和發(fā)酵液，種子液培養(yǎng)基組成為:蛋白胨1%~1.5%，酵母提取物2%~2.5%,甘油0.4%~0.5%,磷酸二氫鉀0.2%~0.3%,磷酸氫二鉀1%~2%，卡那霉素50mg/L，余量為純凈水，用氨水調(diào)至pH為7.0~7.2 ;發(fā)酵液培養(yǎng)基組成為:蛋白胨1%~1.5%,酵母提取物2%~2.5%,甘油0.4%~0.5%,磷酸二氫鉀0.2%~0.3%,磷酸氫二鉀1%~2%，余量為純凈水，用氨水調(diào)至pH為7.0~7.2。
[0038]第二步，將500ml種子液培養(yǎng)基裝在2L三角瓶中，在121°C條件下滅菌20min，冷卻后接種LB平板，搖床頻率為200~230rpm/min，在37°C條件下培養(yǎng)4h，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種。
[0039]第三步，將200ml種子液接種入4.8L的發(fā)酵液,接種量為4%,發(fā)酵液發(fā)酵培養(yǎng)條件:罐溫37°C，通風(fēng)比2.5，罐壓0.05MPa，接種1.5h后罐溫降至25~28°C，加入1%乳糖，Ih后再加入0.5%乳糖，誘導(dǎo)后攪拌，罐壓和通風(fēng)比不變，培養(yǎng)12~15h。
[0040]2)酶活測定:配制60g/L的L-天冬氨酸溶液30ml,調(diào)至pH為7.0,加入Ig發(fā)酵好的菌體，置于150rpm、37°C的水浴搖床震蕩反應(yīng)20min，取Iml菌液，用島津LC-15C高效液相色譜儀測β -丙氨酸的生成量，島津LC-15C高效液相色譜儀的色譜條件為:色譜柱:AglentZRAB0XSB-C184.6*250mm，5 μ m ;柱溫度:30°C，流速:1.0mL/min,檢測器:紫外，334nm,根據(jù)β -丙氨酸的生成量可以判斷菌液的酶活，具體是Iml菌液生產(chǎn)Iumol/min β -丙氨酸為一個酶活單位，酶活測定的結(jié)果如表1所示:
[0041]表1不同批號的反應(yīng)罐中菌液的酶活測定結(jié)果
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)β -丙氨酸的重組大腸桿菌菌株(Escherichiacoli) AHB-36,其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCCM2013629。
2.一種如權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟: 1)敲除大腸桿菌的天冬氨酸氨基裂解酶基因； 2)篩選缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因的陽性克隆，該陽性克隆命名為菌株I; 3)雙酶切質(zhì)粒pET24a( + )以及谷氨酸棒桿菌的PanD基因，用T4連接酶將酶切產(chǎn)物質(zhì)粒pET24a ( + )和PanD基因的DNA片段進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET24a_PanD ； 4)通過熱激法將重組質(zhì)粒pET24a-PanD轉(zhuǎn)入菌株I中，即得用于生產(chǎn)β_丙氨酸的重組大腸桿菌菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，其特征在于:所述敲除大腸桿菌的天冬氨酸氨基裂解酶基因的步驟如下: a)以pIJ773質(zhì)粒的DNA為PCR擴增模板擴增Apr基因，PCR擴增Apr基因所用的引物aspA-KO-U、aspA-KO-D 的核苷酸序列如 SEQIDN0.2 和 SEQIDN0.3 所示； b)通過電轉(zhuǎn)化法將PCR擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌中，即得敲除天冬氨酸氨基裂解酶基因的大腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，其特征在于:篩選缺失天冬氨酸氨基裂解酶 基因的大腸桿菌的方法為采用兩對引物對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗證，第一對引物aspA-1-F、aspA-1-R的核苷酸序列如SEQIDN0.4和SEQIDN0.5所示，第二對引物aspA-2-F、aspA-2-R 的核苷酸序列如 SEQIDN0.6 和 SEQIDN0.7 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，其特征在于:所述PCR擴增的條件為:94°C預(yù)變性5min，I個循環(huán)；94°C變性45s、50°C退火45s、72°C延伸90s，10個循環(huán)；94°C變性45s、55°C退火45s、72°C延伸90s, 15個循環(huán)；72°C延伸IOmin, I個循環(huán)。
6.一種如權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌菌株在生產(chǎn)β -丙氨酸中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組大腸桿菌菌株的用途，其特征在于:重組大腸桿菌菌株發(fā)酵催化L-天冬氨酸生成β -丙氨酸。
【文檔編號】C12R1/19GK103898035SQ201310722755
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】郭恒華, 劉潔, 張冬竹, 唐思青, 劉洋 申請人:安徽華恒生物科技股份有限公司