一種篩選人組成型雄烷受體激活劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種篩選人組成型雄烷受體激活劑的方法，尤其是以納米二氧化鈰顆粒增敏劑快速篩選人組成型雄烷受體激活劑的方法。以納米二氧化鈰為增敏劑，將納米二氧化鈰顆粒摻入鼠尾膠原溶液包被細(xì)胞培養(yǎng)板，將人肝癌細(xì)胞系HepG2接種于包被的培養(yǎng)板上，采用常規(guī)報告基因試驗(yàn)，即可篩選出人組成型雄烷受體激活劑，該方法簡單、快速，具有很高的特異性，可以用于工業(yè)原料化學(xué)品、小分子化學(xué)藥、農(nóng)藥等化學(xué)物是否人組成型雄烷受體激活劑的快速篩選，有很高的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種篩選人組成型雄院受體激活劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種篩選人組成型雄烷受體激活劑的方法，尤其是以納米二氧化鈰顆粒增敏劑快速篩選人組成型雄烷受體激活劑的方法，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】[0002]組成型雄燒受體(Constitutive Androstane Receptor, CAR)是屬于核受體超家族的一種受體蛋白，按核受體系統(tǒng)命名為NR1I3，是機(jī)體對環(huán)境外源性化學(xué)物的感受器。人組成型雄烷受體(hCAR)基因鑒定于1994年，其后不久，由于發(fā)現(xiàn)CAR在細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)2B誘導(dǎo)表達(dá)中起關(guān)鍵作用，受到研究者的重視。CAR在各器官廣泛表達(dá)，尤其在肝臟、腸組織中高表達(dá)。目前已知的CAR生物效應(yīng)包括:調(diào)節(jié)代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)水平；能量代謝調(diào)節(jié)；內(nèi)源代謝物及內(nèi)分泌激素表達(dá)水平調(diào)節(jié)；化學(xué)致癌作用等?；谏鲜鲋匾饔茫?007年美國國家研究委員會(NRC)發(fā)表的《二十一世紀(jì)毒性測試:策略及展望》中，CAR活化作用被列為體外測試毒性途徑之一。在藥物研發(fā)、化學(xué)品毒性檢測中，需要對化學(xué)物是否為CAR激活劑進(jìn)行篩選。
[0003]由于CAR具有許多特異的活化特性，使其激活劑的鑒別特別困難。首先，目前已鑒定的CAR激活劑絕大多數(shù)并不以配體方式結(jié)合，常用的受體結(jié)合試驗(yàn)不適用于CAR激活劑篩選；其次，CAR的基礎(chǔ)活性高，應(yīng)用常規(guī)報告基因試驗(yàn)，CAR激活劑作用后其報告基因水平也難以檢測到顯著變化。因此，建立一種能夠快速篩選人組成型雄烷受體激活劑的方法顯
得至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是提供一種操作簡單、特異性好的細(xì)胞試驗(yàn)方法篩選人組成型雄烷受體激活劑。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明應(yīng)用一種納米材料作為細(xì)胞試驗(yàn)增敏劑，建立一種可快速篩選人組成型雄烷受體激活劑的方法，該方法包括如下步驟:
[0006]I)使用濃度為130 μ g/mL的N-環(huán)己基-N ' _(2_嗎啉乙基)氨基氰甲代對甲苯橫酸鹽(N-Cyclohexyl-N ' -(2-morpholinoethyl)carbodiimidemetho-p-toluenesulfonate)水溶液稀釋 I 型鼠尾膠原至 100 μ g/mL ；
[0007]2)向配制好的鼠尾膠原溶液中摻入一定濃度的納米二氧化鈰顆粒作為增敏劑，然后加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 °C，5% 二氧化碳濃度中放置3~4h，使用滅菌水和磷酸鹽緩沖液漂洗，備用；
[0008]3)將人肝癌細(xì)胞!fepG2接種于包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上；12h后進(jìn)行多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染24h后，加入環(huán)境污染化學(xué)物進(jìn)行檢測篩選。
[0009]所述步驟2)中納米二氧化鈰顆粒濃度為10~40 μ g/mL。
[0010]所述步驟2)中納米二氧化鋪顆粒濃度優(yōu)選20 μ g/mL。
[0011]所述步驟3)中多質(zhì)粒為hCAR表達(dá)質(zhì)粒、螢火蟲螢光素酶報告基因質(zhì)粒和內(nèi)參比海腎螢光素酶質(zhì)粒。
[0012]所述螢火蟲螢光素酶報告基因質(zhì)粒為pGL3-CYP2B6-2.2k報告基因質(zhì)粒。
[0013]所述內(nèi)參比海腎螢光素酶質(zhì)粒為pRL-TK質(zhì)粒。
[0014]然后加入受試化學(xué)物作用24小時后進(jìn)行檢測。
[0015]進(jìn)一步，收集細(xì)胞進(jìn)行雙報告基因檢測(Promega公司雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒):
[0016]I)裂解細(xì)胞；
[0017]2)每個檢測管加入100 μ L LARII試劑；
[0018]3)將待測樣品20 μ L加入到檢測管中，檢測螢火蟲螢光素酶活性；
[0019]4)向檢測管中加入100μ L終止試劑(Stop&Glo)，檢測海腎螢光素酶活性。
[0020]進(jìn)一步，計算每個樣品的螢火蟲/海腎螢光素酶活性比值。
[0021]進(jìn)一步，計算每個受試物處理與溶劑對照相比報告基因表達(dá)水平的倍數(shù)。
[0022]本發(fā)明的有益效果在于:納米二氧化鈰顆粒摻入鼠尾膠原溶液包被細(xì)胞培養(yǎng)板，將人肝癌細(xì)胞系H印G2接種于包被的培養(yǎng)板上，采用常規(guī)報告基因試驗(yàn)，即可篩選出人組成型雄烷受體激活劑，人組成型雄烷受體激活劑作用后報告基因表達(dá)水平均為溶劑對照作用的2倍以上，已知非人組成型雄`烷受體激活劑作用后報告基因表達(dá)水平均不超過溶劑對照作用的2倍，此種篩選方法的特異度為100%，因此，該方法簡單、快速，具有很高的特異性。所以，可以用于工業(yè)原料化學(xué)品、小分子化學(xué)藥、農(nóng)藥等化學(xué)物是否人組成型雄烷受體激活劑的快速篩選，有很高的應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為不同濃度二氧化鈰的細(xì)胞毒性圖；
[0024]圖2為不同濃度二氧化鈰的報告基因表達(dá)水平圖；
[0025]圖3為試驗(yàn)方法特異度評價結(jié)果圖；
[0026]圖4a為應(yīng)用本發(fā)明方法對12種環(huán)境污染化學(xué)物篩選結(jié)果圖；
[0027]圖4b為應(yīng)用常規(guī)鼠尾膠原包被培養(yǎng)板對12種環(huán)境污染化學(xué)物篩選結(jié)果圖；
[0028]圖4c為應(yīng)用不包被培養(yǎng)板對12種環(huán)境污染化學(xué)物篩選結(jié)果圖；
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明建立了基于納米材料增敏的人組成型雄烷受體激活劑篩選細(xì)胞試驗(yàn)方法，并對該方法進(jìn)行了優(yōu)化。在進(jìn)行納米增敏劑濃度的優(yōu)化時，本發(fā)明以產(chǎn)生最小細(xì)胞毒性、報告基因表達(dá)水平不低于對照2倍的改變?yōu)橐罁?jù)。所用的報告基因試驗(yàn)為常規(guī)方法，因此本發(fā)明未對報告基因試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行探討。
[0030]具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下:
[0031]1.將納米二氧化鈰顆粒摻入鼠尾膠原溶液包被24孔細(xì)胞培養(yǎng)板
[0032]I)配制鼠尾膠原溶液
[0033]配制130 μ g/mL N-環(huán)己基-N' _(2_嗎啉乙基)氨基氰甲代對甲苯磺酸鹽水溶液(2-8°C保存6個月)，用來稀釋I型鼠尾膠原至100 μ g/mL。
[0034]2)摻入納米二氧化鈰顆粒[0035]向配制好的鼠尾膠原溶液中摻入I~200 μ g/mL直徑為20~30納米的二氧化鈰顆粒。
[0036]3)包被24孔細(xì)胞培養(yǎng)板
[0037]以每孔0.5mL加入至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C 5% 二氧化碳環(huán)境中放置3~4h。以滅菌水和磷酸鹽緩沖液漂洗，備用。包被后2個月內(nèi)使用。
[0038]2.納米二氧化鈰濃度的優(yōu)化
[0039]I)以細(xì)胞毒性為依據(jù)的優(yōu)化
[0040]人肝癌細(xì)胞!fepG2按每孔L OX IO5個接種于包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。24h后每孔加入40 μ L細(xì)胞活性染料噻唑藍(lán)(10mg/mL), 37°C 5% 二氧化碳環(huán)境中孵育4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入300 μ L 二甲基亞砜，置微孔板振蕩儀上lh，使用酶標(biāo)儀570nm波長下測定吸光度值，計算細(xì)胞毒性。
[0041]結(jié)果表明，50 μ g/mL及以上濃度的納米二氧化鈰對人肝癌細(xì)胞H印G2具有明顯細(xì)胞毒性(細(xì)胞活率低于90%)(圖1 )，所以選擇納米二氧化鈰濃度10~40 μ g/mL繼續(xù)進(jìn)行下一步優(yōu)化。
[0042]2)以報告基因表達(dá)水平為依據(jù)的優(yōu)化
[0043]包被液中納米二氧化鈰的濃度分別取I μ g/mL~40μ g/mL5個濃度(1、10、20、30、40 μ g/mL),每個濃度做6個孔平行樣。將!fepG2細(xì)胞按每孔1.0X IO5個接種于包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，12h后按表1配制轉(zhuǎn)染混合物(每孔加入量)，應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑(Fugene6)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h后，每個濃度的6個孔中，3孔加入人組成型雄烷受體激活劑6-(4-氯苯基)咪唑并[2，1-b] [1,3]噻唑-5-甲醛O-(3，4-二氯苯基)肟(簡稱CTIC0)，另外3孔加入溶劑二甲基亞砜。24h后收集細(xì)胞進(jìn)行雙報告基因檢測(Promega公司雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒):
[0044]裂解細(xì)胞；
[0045]每個檢測管加入100 μ L LARII試劑；
[0046]將待測樣品20 μ L加入到檢測管中，檢測螢火蟲螢光素酶活性；
[0047]向檢測管中加入100 μ L終止試劑(Stop&Glo)，檢測海腎螢光素酶活性；
[0048]計算每個樣品的螢火蟲/海腎螢光素酶活性比值；
[0049]計算CTICO處理與溶劑對照相比報告基因表達(dá)水平的倍數(shù):
[0050] 相對報告基因表達(dá)水平=CITCO處理細(xì)胞螢火蟲/海腎螢光素酶活性比值/溶劑二甲基亞砜處理細(xì)胞螢火蟲/海腎螢光素酶活性比值。
[0051]結(jié)果表明，20 μ g/mL及以上濃度，人組成型雄烷受體激活劑CTICO作用后，報告基因表達(dá)水平為溶劑對照作用的2倍以上(圖2)。因此，選擇納米二氧化鈰濃度為20 μ g/mL。
[0052]表1轉(zhuǎn)染混合物的配制
【權(quán)利要求】
1.一種篩選人組成型雄烷受體激活劑的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)使用濃度為130yg/mL的N-環(huán)己基-N'_(2_嗎啉乙基)氨基氰甲代對甲苯磺酸鹽水溶液稀釋I型鼠尾膠原至100 μ g/mL ； 2)向配制好的鼠尾膠原溶液中摻入一定濃度的納米二氧化鈰顆粒作為增敏劑，然后加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C，5% 二氧化碳濃度中放置3~4h，使用滅菌水和磷酸鹽緩沖液漂洗，備用； 3)將人肝癌細(xì)胞H印G2接種于包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上；12h后進(jìn)行多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染24h后，加入環(huán)境污染化學(xué)物，作用24h后進(jìn)行檢測篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中納米二氧化鈰顆粒濃度為10 ~40 μ g/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟2)中納米二氧化鈰顆粒濃度優(yōu)選 20 μ g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟3)中多質(zhì)粒為hCAR表達(dá)質(zhì)粒、螢火蟲螢光素酶報告基因質(zhì)粒和內(nèi)參比海腎螢光素酶質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述螢火蟲螢光素酶報告基因質(zhì)粒為PGL3-CYP2B6-2.2k報告基因質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述內(nèi)參比海腎螢光素酶質(zhì)粒為pRL-TK質(zhì)粒。
【文檔編號】C12Q1/66GK103710449SQ201310723638
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】李海山, 韓輝, 艾文超, 謝文平, 魏長壘, 歷冬, 陳會明 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院