嵌合啟動子及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種嵌合啟動子及其用途，所述嵌合啟動子包括至少一個花葉病毒啟動子的順式元件，所述花葉病毒啟動子的順式元件有效連接至少一個Tsf1啟動子的順式元件。本發(fā)明嵌合啟動子有利于除草劑耐性蛋白質(zhì)的表達(dá)，尤其是草甘膦耐性蛋白質(zhì)，且顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因大豆植物對除草劑的耐受性。
【專利說明】嵌合啟動子及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種嵌合啟動子及其用途，特別是涉及一種花葉病毒啟動子的順式元件有效連接Tsfl啟動子的順式元件的嵌合啟動子及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]植物遺傳工程的最新進(jìn)展為改善植物性狀的工程打開了新的大門，如植物抗病性、昆蟲抗性、除草劑耐受性、提高產(chǎn)量、改善植物可食用部分的營養(yǎng)質(zhì)量和增強(qiáng)從植物中獲得的終端消費(fèi)產(chǎn)品的保質(zhì)期或穩(wěn)定性。因此，具有分子功能的目的基因可以被適當(dāng)?shù)恼先胫参锏幕蚪M以傳遞不同或者改善性狀或質(zhì)量。新整合基因的編碼序列在植物細(xì)胞中表達(dá)以顯示目標(biāo)新性狀。 重要的是適當(dāng)?shù)恼{(diào)控信號必須以合適的結(jié)構(gòu)存在才能在植物細(xì)胞中獲得新插入基因的編碼序列的表達(dá)。這些調(diào)控信號典型地包括啟動子區(qū)域、5’非翻譯引導(dǎo)序列和3’轉(zhuǎn)錄終止子/聚腺苷酸化序列。
[0003]為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，將包括異源基因序列的構(gòu)建體引入植物細(xì)胞，所述異源基因序列當(dāng)在植物中表達(dá)時賦予所需表型。所述構(gòu)建體還包括有效連接所述異源基因序列的植物啟動子，該植物啟動子通常在一般情況下不與所述異源基因連接。將所述構(gòu)建體引入植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，然后將所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生為轉(zhuǎn)基因植物。所述啟動子控制該啟動子有效連接的所引入DNA序列的表達(dá)，并因此影響所述DNA序列所賦予的所需特性。
[0004]利用多種啟動子定制基因表達(dá)可能是有利的，以便一個基因或多個基因在植物生長和發(fā)育的恰當(dāng)時間、在所述植物中的最佳位點(diǎn)并且以產(chǎn)生所需效應(yīng)所需的量有效轉(zhuǎn)錄。例如，基因產(chǎn)物的組成型表達(dá)在植物的一個位點(diǎn)可能是有利的，但在該植物的另一部分就不是那么有利了。在其他情況下，在植物某個發(fā)育階段或在應(yīng)答某些環(huán)境或化學(xué)刺激時產(chǎn)生基因產(chǎn)物可能是有利的。遺傳改良種質(zhì)的商業(yè)化發(fā)展也已經(jīng)前進(jìn)到將多種性狀引入作物的階段，該方法常常被稱為基因堆積方法。在該方法中，可以將賦予不同目的性狀的多種基因引入植物。當(dāng)將多種基因引入植物時，重要的是調(diào)整或控制每個基因以獲得最佳表達(dá)，并且使得調(diào)控元件多樣化，以降低基因沉默的可能性?？紤]上述原因，在植物生物工程技術(shù)中基因表達(dá)的最佳控制和調(diào)控元件多樣化顯然是重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種嵌合啟動子及其用途，即花葉病毒啟動子的順式元件有效連接Tsfl啟動子的順式元件的嵌合啟動子，有利于除草劑耐性蛋白質(zhì)的表達(dá)，尤其是草甘膦耐性蛋白質(zhì)，顯著地增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因大豆植物對除草劑的耐受性。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種嵌合啟動子，包括至少一個花葉病毒啟動子的順式元件,所述花葉病毒啟動子的順式元件有效連接至少一個Tsfl啟動子的順式元件。
[0007]進(jìn)一步地,所述花葉病毒啟動子為花椰菜花葉病毒啟動子、玄參花葉病毒啟動子、花生萎黃病條紋花葉病毒啟動子、木薯葉脈花葉病毒啟動子或紫茉莉花葉病毒啟動子。。
[0008]更進(jìn)一步地，所述花葉病毒啟動子的順式元件為花葉病毒啟動子的順式增強(qiáng)子元件。
[0009]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述Tsfl啟動子為擬南芥Tsfl啟動子或油菜Tsfl啟動子。
[0010]優(yōu)選地,所述擬南芥Tsfl啟動子的序列如SEQ ID NO:1所示,所述油菜Tsf I啟動子的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0011]所述嵌合啟動子為FMViBrTsfU MMViAtTsfU PCISV:AtTsfl、CsVMV:AtTsfl 或CaMViBrTsfl0
[0012]優(yōu)選地， 所述嵌合啟動子的序列如SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5或SEQID NO:6 所示。
[0013]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，包括所述嵌合啟動子和結(jié)構(gòu)DNA序列，所述結(jié)構(gòu)DNA序列有效連接所述嵌合啟動子。
[0014]進(jìn)一步地，所述結(jié)構(gòu)DNA序列編碼除草劑耐性蛋白質(zhì)或昆蟲抗性蛋白質(zhì)。
[0015]更進(jìn)一步地，所述結(jié)構(gòu)DNA序列編碼草甘膦耐性蛋白質(zhì)。
[0016]優(yōu)選地，所述草甘膦耐性蛋白質(zhì)為5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶。
[0017]所述結(jié)構(gòu)DNA序列編碼賦予植物除草劑耐性蛋白質(zhì)，所述除草劑耐性蛋白質(zhì)包括但不限于草甘膦耐性蛋白質(zhì)，如單獨(dú)的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，或者其與一種或多種草甘膦降解蛋白質(zhì)的組合。
[0018]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述草甘膦耐性蛋白質(zhì)與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽有效連接。
[0019]所述草甘膦耐性蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄終止子有效連接。
[0020]優(yōu)選地，所述表達(dá)盒包括與EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列有效連接的FMV = BrTsf 1，所述EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列與擬南芥屬葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽CTP2和E9終止子有效連接。
[0021]所述表達(dá)盒包括與EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列有效連接的MMV = AtTsf 1，所述EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列與擬南芥屬葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽CTP2和E9終止子有效連接。
[0022]所述表達(dá)盒包括與EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列有效連接的PCISV = AtTsf 1，所述EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列與擬南芥屬葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽CTP2和E9終止子有效連接。
[0023]所述表達(dá)盒包括與EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列有效連接的CsVMV = AtTsf I，所述EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列與擬南芥屬葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽CTP2和E9終止子有效連接。
[0024]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種DNA構(gòu)建體，包括至少一個所述表達(dá)盒。
[0025]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種在植物中表達(dá)結(jié)構(gòu)DNA序列的方法，包括將所述DNA構(gòu)建體引入植物細(xì)胞。
[0026]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制雜草的方法，包括將所述DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物，施用足量草甘膦以控制雜草而不損害所述植物。
[0027]進(jìn)一步地，所述足量草甘膦為不高于每公頃10080克的草甘膦。
[0028]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種所述嵌合啟動子或所述DNA構(gòu)建體在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物中的用途。
[0029]本發(fā)明中術(shù)語“核酸(序列)”或“多核苷酸(序列)”指基因組來源或合成來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA，即分別是從5’(上游)端讀到3’(下游)端的脫氧核糖核苷酸堿基或核糖核苷酸堿基的聚合物。核酸可以代表有義鏈或互補(bǔ)(反義)鏈。
[0030]“天然的”指天然出現(xiàn)的(“野生型”)核酸序列。[0031]“異源的”序列指源自外來來源或物種的序列，或者當(dāng)來自同一來源時指由其原始形式受到修飾的序列。
[0032]“分離的”核酸序列是與所述核酸天然出現(xiàn)的生物細(xì)胞中其通常結(jié)合的其它核酸序列(即其它染色體DNA或染色體外DNA)基本分離或純化出來的。該術(shù)語包括經(jīng)過生物化學(xué)純化以便基本去除污染的核酸和其它細(xì)胞成份的核酸。該術(shù)語還包括重組核酸和化學(xué)合成的核酸。
[0033]“基本純化的” 指與其天然狀態(tài)通常結(jié)合的其它分子分離開來的分子。更優(yōu)選基本純化的分子是在制備物中主要存在的種類?；炯兓姆肿涌梢圆缓刑烊换旌衔镏写嬖诘?0%、優(yōu)選75%、更優(yōu)選90%其它分子(不包括溶劑)。術(shù)語“基本純化的”并不包括以天然狀態(tài)存在的分子。
[0034]假如兩種核酸序列的布置使得第一種核酸序列影響第二種核酸序列的功能，那么所述第一種核酸序列就與所述第二種核酸序列“有效連接”。優(yōu)選這兩種序列是單一連續(xù)核酸分子的組成部分，或者更優(yōu)選是臨近的。例如，假如一種啟動子調(diào)節(jié)或介導(dǎo)一種基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，那么所述啟動子就與所述基因有效連接。
[0035]“重組”核酸是通過人工組合兩種在其它情況下是分離的序列區(qū)段而獲得的，例如通過化學(xué)合成或通過遺傳工程技術(shù)操作分離的核酸區(qū)段。進(jìn)行核酸操作的技術(shù)是眾所周知的。
[0036]“轉(zhuǎn)基因”指已經(jīng)引入外源核酸(如重組構(gòu)建體)的細(xì)胞、組織、器官或生物。所引入的核酸最好整合入受體細(xì)胞、組織、器官或生物的基因組DNA，以便所引入的核酸通過隨后的后代遺傳?！稗D(zhuǎn)基因”細(xì)胞或生物還包括所述細(xì)胞或生物的后代，以及由使用所述“轉(zhuǎn)基因”植物作為雜交親本的育種程序產(chǎn)生、并表現(xiàn)由于重組構(gòu)建體或構(gòu)建體的存在而引起的表型改變的后代。
[0037]本發(fā)明中術(shù)語“基因”指染色體DNA、質(zhì)粒DNA、cDNA、合成DNA或其它編碼肽、多肽、蛋白或RNA分子的DNA、以及在編碼序列兩側(cè)參與表達(dá)調(diào)節(jié)的區(qū)。一些基因可以轉(zhuǎn)錄成為mRNA并翻譯成為多肽(結(jié)構(gòu)基因);而其它基因可以轉(zhuǎn)錄成為mRNA (如rRNA、tRNA);其它類型基因作為表達(dá)調(diào)節(jié)物起作用(調(diào)芐基因)。
[0038]基因“表達(dá)”指基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生對應(yīng)mRNA并且該mRNA翻譯產(chǎn)生對應(yīng)基因產(chǎn)物，即肽、多肽或蛋白。調(diào)節(jié)元件控制或調(diào)整基因表達(dá)，所述調(diào)節(jié)元件包括5’調(diào)節(jié)元件如啟動子。
[0039]本發(fā)明中術(shù)語“重組DNA構(gòu)建體”、“DNA構(gòu)建體”、“重組構(gòu)建體”、“表達(dá)構(gòu)建體”或“表達(dá)盒”指來自任何來源、能夠整合入基因組或自主復(fù)制的任何因子如質(zhì)粒、粘粒、病毒、BAC(細(xì)菌人工染色體)、自主復(fù)制型序列、噬菌體、或者線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA核苷酸序列，包括其中一種或多種DNA序列使用眾所周知的重組DNA技術(shù)以功能性可操作方式連接的DNA分子。
[0040]“同源性”指核酸序列或氨基酸序列分別按照核苷酸或氨基酸位置同一性百分率而言的相似性水平(即序列相似性或同一性)。同源性也指在不同核酸或蛋白之間相似功能特性的概念。
[0041]本發(fā)明中術(shù)語“啟動子”是指DNA調(diào)節(jié)區(qū)，通常含有能夠引導(dǎo)RNA聚合酶II在特定編碼序列的適合轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)啟動RNA合成的TATA盒。啟動子可另外含有其它的識別序列，一般位于TATA盒的上游或5’端，稱作上游啟動子元件，它們影響轉(zhuǎn)錄起始速率?！爸参飭幼印笔窃谥参锛?xì)胞中有功能的天然或非天然啟動子。當(dāng)所述啟動子與異源DNA序列融合時，所述啟動子通常引起所融合的序列以類似于所述啟動子正常連接的基因序列的轉(zhuǎn)錄方式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄?？梢约尤氚ㄕ{(diào)節(jié)序列的啟動子片段(例如融合到具有其自身的部分或完全調(diào)節(jié)序列的活性啟動子的5’端，或插入其中)。
[0042]啟動子通常包含多個獨(dú)立的“順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件”或簡稱“順式元件”，每個順式元件賦予對基因表達(dá)總體控制的不同方面?！绊樖皆苯Y(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的反式作用蛋白因子。一些順式元件結(jié)合不止一種因子，而反式作用轉(zhuǎn)錄因子可以與不止一個順式元件以不同親和性相互作用。 本發(fā)明的啟動子序列可以包含賦予或調(diào)芐基因表達(dá)的“順式元件”。
[0043]植物啟動子也可以包括通過操作已知啟動子以獲得合成、嵌合或雜種啟動子而產(chǎn)生的啟動子。這樣的啟動子也可以結(jié)合來自一個或多個啟動子的順式元件，例如通過在具有其自身部分或完全調(diào)節(jié)序列的活性啟動子上添加異源調(diào)節(jié)序列；也可以通過在無活性的截短啟動子的5’上游區(qū)添加異源調(diào)節(jié)序列，發(fā)展出嵌合啟動子，所述無活性的截短啟動子即僅包括核心TATA并任選包括CCAAT元件的啟動子。
[0044]依照本發(fā)明的嵌合或雜種啟動子可以包括至少一種已知的順式元件，如由各種環(huán)境因子如光、熱或脅迫調(diào)節(jié)的元件；由病原體或化學(xué)藥品等調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)的元件。根據(jù)所述條件，這類元件可以或者正調(diào)節(jié)或者負(fù)調(diào)芐基因的表達(dá)。順式元件的例子包括但不限于氧效應(yīng)元件、光調(diào)節(jié)元件、響應(yīng)茉莉酮酸甲酯處理的順式元件、水楊酸效應(yīng)元件、熱激反應(yīng)元件、響應(yīng)創(chuàng)傷和非生物性脅迫的元件、冷效應(yīng)元件以及干旱效應(yīng)元件。本發(fā)明中所公開序列的順式元件可以賦予特定的特異性，例如賦予有效連接的DNA序列在某些組織中的增強(qiáng)表達(dá)。
[0045]啟動子元件可以加性作用或協(xié)同作用影響啟動子活性?？梢源?lián)排列來自不同5’調(diào)節(jié)區(qū)的啟動子元件，獲得具有不同活性范圍或不同表達(dá)分布型的啟動子。因此，來自異源來源的啟動子元件組合或者相似元件或相同元件的重復(fù)可能賦予有效連接的可轉(zhuǎn)錄序列的更高水平表達(dá)。例如，可以形成一種啟動子元件的多聚體，以增加由該啟動子元件所實(shí)現(xiàn)模式的特異性表達(dá)的水平。
[0046]對于許多農(nóng)學(xué)性狀，需要在多種組織中轉(zhuǎn)錄一個或多個目的基因以賦予所需的特征。需要獲得調(diào)節(jié)有效連接的基因在選定靶組織中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子，因?yàn)榭赡懿幌Ｍ谒薪M織中表達(dá)基因，而是僅在某些組織中表達(dá)基因。例如，假如人們希望選擇性表達(dá)靶基因以表達(dá)除草劑耐性基因，人們可能希望在營養(yǎng)性組織和生殖組織中表達(dá)所述除草劑耐性基因。本發(fā)明的啟動子序列可以用于在多種組織中調(diào)芐基因表達(dá)，所述組織包括但不限于快速生長的分生組織、雄性生殖組織(如花粉、花藥和花絲)、雌性生殖組織(如柱頭、花柱和子房)、葉、萼片和花瓣。因此，本發(fā)明的啟動子可用于表達(dá)除草劑耐性基因，例如當(dāng)在植物發(fā)育的多種組織和階段需要耐性時表達(dá)。本發(fā)明的啟動子序列可用于調(diào)節(jié)任何靶基因的轉(zhuǎn)錄，所述靶基因包括但不限于控制下列性狀的基因:育性、產(chǎn)量、抗蟲性、真菌耐性、除草劑耐性或任何所需性狀，尤其優(yōu)選的基因包括除草劑耐性基因或抗蟲性基因。
[0047]當(dāng)需要在多種組織中表達(dá)除草劑耐性基因時，本發(fā)明的啟動子尤其可用于調(diào)節(jié)除草劑耐性基因的表達(dá)。例如所述除草劑耐性基因可以賦予對除草劑草甘膦的耐性。合適的草甘膦耐性基因的例子包括但不限于草甘膦抗性EPSPS基因或降解草甘膦的基因產(chǎn)物如草甘膦氧化還原酶和膦酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。對于任何植物生物工程策略而言，獲得5’調(diào)節(jié)元件的廣泛選擇是重要的，以便獲得對于所需的表達(dá)分布型最為有效的合適調(diào)節(jié)元件。
[0048]在雜交技術(shù)中，己知核苷酸序列的全部或部分被用作探針，與來自被選生物體的克隆基因組DNA片段或cDNA片段(如基因組文庫或cDNA文庫)群體中存在的其它對應(yīng)核苷酸序列選擇性地雜交。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可以被可探測的基團(tuán)如32P或其它任何可探測標(biāo)記物標(biāo)記。因此，例如，通過標(biāo)記根據(jù)本發(fā)明序列的合成寡核苷酸可以制備雜交探針。
[0049]序列的雜交可在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。所述“嚴(yán)格條件”是指探針將與其靶序列雜交至可探測程度超過與其它序列雜交(如至少2倍于背景)的條件。嚴(yán)格條件具有序列依賴性，且因環(huán)境的不同而不同。 通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源探測)?？蛇x擇地，可以調(diào)節(jié)嚴(yán)格條件以允許一些序列錯配，使得探測到較低程度的相似性(異源探測)。通常，探針長度短于大約1000個核苷酸，優(yōu)選地短于500個核苷酸。
[0050]典型地，嚴(yán)格條件是在pH7.0至8.3下鹽濃度低于大約1.5M Na離子，典型地大約0.01至1.0M Na離子濃度(或其它鹽類)，溫度對短探針(如10至50個核苷酸)至少大約30°C，對長探針(如超過50個核苷酸)至少大約60°C。通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺也可獲得嚴(yán)格條件。低度嚴(yán)格條件，例如，包括在30-35%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS (十二烷基磺酸鈉)的緩沖溶液中37°C雜交，在IX至2XSSC (20XSSC=3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中50-55°C洗滌。中度嚴(yán)格條件，例如，包括在40-45%甲酰胺、1.0M NaCl、1%SDS的緩沖溶液中37°C雜交，在0.5X至1X55(:中55-601:洗滌。高度嚴(yán)格條件，例如，包括在50%甲酰胺、IMNaCl、l%SDS的緩沖溶液中37°C雜交，在0.1XSSC中60_65°C洗滌。非必要地，洗滌緩沖液可含有大約0.1%至1%的SDS。雜交時間一般少于大約24小時，通常大約4至12小時。
[0051]特別典型地是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對于 DNA-DNA 雜交體,T111 可以從 Meinkoth 和 Wahl (1984)Anal.Biochem.138:267-284 的方程估算:1=81.5°C+16.6 (1gM) +0.41 (%GC) -0.61 (%form)-500/L ;其中 M 是單價陽離子的摩爾濃度，%GC是鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在雜交溶液中的百分比，L是雜交體在堿基對中的長度。Tm是50%互補(bǔ)靶序列與完全配對探針雜交的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下)。每1%的錯配需Tm降低大約廣匕因此，、雜交和/或洗滌條件可被調(diào)節(jié)以與所需同一性的序列雜交。例如，如果探尋的序列具有> 90%的同一性，^可以降低10°C。一般地，選擇的嚴(yán)格條件是低于特定序列的熱解鏈溫度(Tm)大約5°C，且其在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下互補(bǔ)。但是，高度嚴(yán)格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm) 1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；中度嚴(yán)格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm) 6、7、8、9或I (TC的雜交和/或洗滌；低度嚴(yán)格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm)IU 12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌。應(yīng)用此方程、雜交和洗滌組合物和所需的Tm，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會理解雜交和/或洗滌溶液的條件隨嚴(yán)格程度的變化而變化。如果所需的錯配程度使Tm低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，優(yōu)選增加SSC濃度以能夠使用較高的溫度。核酸雜交的指南見于Tijssen (1993)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-用核酸探針雜交，第I部分，第2章(Elsevier, New York);和Ausubel等人編輯(1995)分子生物學(xué)現(xiàn)代方法第
2章(Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York)。見 Sambrook 等人(1989)分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NewYork)。
[0052]表達(dá)盒可另外含有可選擇的標(biāo)記基因。一般地，表達(dá)盒將包含用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。所述選擇性標(biāo)記基因用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。所述選擇性標(biāo)記基因包括但不限于，編碼抗生素抗性的基因(如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II (NPT))和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因，以及賦予除草劑抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮類和2，
4-二氯苯氧乙酸酯(2，4-D)。
[0053]在表達(dá)盒制備中，可以操控不同的DNA片段以提供適當(dāng)方向的DNA序列，并在適合的時候提供適當(dāng)?shù)拈喿x框。所以，可應(yīng)用接受子或連接子結(jié)合DNA片段，或可進(jìn)行其它操控以提供方便的限制性位點(diǎn)、去除多余的DNA、去除限制性位點(diǎn)等。為此目的，可能涉及體外誘變、引物修復(fù)、限制、退火、再取代，如轉(zhuǎn)變和轉(zhuǎn)換。
[0054]本領(lǐng)域公知的，另外的序列修飾可提高細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)水平。這些包括但不限于，去除編碼假性聚腺苷信號、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號、轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表達(dá)的序列。序列的G-C含量可調(diào)節(jié)到指定宿主細(xì)胞的平均水平，引用宿主細(xì)胞中己知的基因表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算?？赡艿?，修飾序列以避免預(yù)測的發(fā)夾式mRNA 二級結(jié)構(gòu)。
[0055]在表達(dá)盒或DNA構(gòu)建體中，表達(dá)盒可另外含有5 ’前導(dǎo)序列。所述前導(dǎo)序列可以起改進(jìn)轉(zhuǎn)錄效率的作用。所述前導(dǎo)序列為本領(lǐng)域已知的，包括但不限于，細(xì)小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5’非編碼區(qū))；馬鈴薯病毒組前導(dǎo)序列，例如煙草蝕刻病毒(TEV)前導(dǎo)序列、玉米矮小花葉病毒(MDMV)前導(dǎo)序列和人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP);來自紫花苜?；ㄈ~病毒包被蛋白mRNA (AMV RNA4)的非翻譯前導(dǎo)序列；煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列；和玉米萎黃病斑點(diǎn)病毒(MCMV)前導(dǎo)序列。還可以使用其它己知的改進(jìn)轉(zhuǎn)錄效率的元件，例如內(nèi)含子等。
[0056]轉(zhuǎn)化方案以及將核苷酸序列導(dǎo)入植物的方案依定向轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞類型而異，即單子葉植物或雙子葉植物。將核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞并隨后插入植物基因組中的適合方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。
[0057]已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可按照常規(guī)的方式生長成植物。這些植物被培育，用相同的轉(zhuǎn)化株或不同的轉(zhuǎn)化株授粉，得到的雜交體表達(dá)所需的被鑒定的表現(xiàn)型特征?？膳嘤蚨啻员ＷC穩(wěn)定地保持和遺傳所需表現(xiàn)型特征的表達(dá)，然后收獲可保證得到所需表現(xiàn)型特征表達(dá)的種子。
[0058]分析轉(zhuǎn)化植物中目的基因的存在以及本發(fā)明啟動子序列賦予的表達(dá)水平和/或分布型。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員知道可用于分析轉(zhuǎn)化植物的多種方法。使用多種方法評價基因表達(dá)，并確定所引入的基因是否整合、是否正常起作用以及是否如所預(yù)期地遺傳。對于本發(fā)明，可以通過測定啟動子有效連接的基因的表達(dá)水平評價所述啟動子。使用報(bào)告基因、通過瞬時測定方法可以獲得更確定性的啟動子評價。植物分析方法包括但不限于DNA印跡分析或RNA印跡分析、基于PCR的方法、生物化學(xué)分析、表型篩選方法、田間評價和免疫診斷學(xué)測定。
[0059]本發(fā)明的方法包括但不限于PCR技術(shù)、分離基因組DNA、構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建體、瞬時測定和植物轉(zhuǎn)化方法，這些方法 是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或其修改形式執(zhí)行。
[0060]本發(fā)明提供了一種嵌合啟動子及其用途，本發(fā)明嵌合啟動子采用eFMViprBrTsfl、eMMV:prAtTsf1、ePCISV:prAtTsfI 和 eCsVMV:prAtTsfI,有利于除草劑耐性蛋白質(zhì)的表達(dá)，尤其是草甘膦耐性蛋白質(zhì)；且具有影響結(jié)構(gòu)DNA序列(EPSPS基因)在植物中表達(dá)水平的效果，特別是顯著地增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因大豆植物對除草劑的耐受性。
[0061]下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0062]圖1為本發(fā)明嵌合啟動子及其用途的重組表達(dá)載體DBN100040示意圖；
[0063]圖2為本發(fā)明嵌合啟動子及其用途的重組表達(dá)載體DBN100052示意圖；
[0064]圖3為本發(fā)明嵌合啟動子及其用途的重組表達(dá)載體DBN100051示意圖；
[0065]圖4為本發(fā)明嵌合啟動子及其用途的重組表達(dá)載體DBN100039示意圖；
[0066]圖5為本發(fā)明嵌合啟動子及其用途的重組表達(dá)載體DBN100036示意圖；
[0067]圖6為本發(fā)明嵌合啟動子及其用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株除草劑抗性效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0068]下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明嵌合啟動子及其用途的技術(shù)方案。
[0069]第一實(shí)施例、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0070]1、構(gòu)建含有嵌合啟動子的重組表達(dá)載體
[0071]利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，重組表達(dá)載體DBN100040 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供))如圖1所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；eFMV:玄參花葉病毒的34S增強(qiáng)子；prBrTsfl:油菜真核延長因子基因la (Tsfl)啟動子(SEQ ID NO: 2 ；eFMV:prBrTsf I (SEQ ID NO: 3));CTP2:擬南芥屬 EPSPS的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SEQ ID N0:8) ;EPSPS:5_烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ IDN0:9)；E9:豌豆RbcS基因的終止子(SEQ ID NO: 10);prCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ ID Ν0:11);ΡΑΤ:草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(SEQ ID NO: 12)；tCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID N0:13) ;LB:左邊界)。
[0072]按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100040的方法，構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100052 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供))如圖2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；eMMV:紫茉莉花葉病毒的增強(qiáng)子；prAtTsfl:擬南芥真核延長因子基因I a (Tsfl)啟動子(SEQ ID NO:1 ；eMMV:prAtTsfl (SEQ ID NO:4)) ;CTP2:擬南芥屬 EPSPS 的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SEQ ID N0:8) ;EPSPS:5_烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ ID N0:9) ;E9:豌豆RbcS基因的終止子(SEQ ID N0:10) ;prCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ IDN0:11);PAT:草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(SEQ ID NO: 12);tCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID NO: 13) ；LB:左邊界)。
[0073]按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100040的方法，構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100051 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供))如圖3所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；ePCISV:花生萎黃病條紋花葉病毒的增強(qiáng)子；prBrTsfl:油菜真核延長因子基因I α(Tsfl)啟動子(SEQ ID NO:2 ；ePCISV:prAtTsfI (SEQ ID NO:5)) ;CTP2:擬南芥屬 EPSPS的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SEQ ID N0:8) ;EPSPS:5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ IDN0:9)；E9:豌豆RbcS基因的終止子(SEQ ID NO: 10);prCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ ID ΝΟ:11);ΡΑΤ:草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(SEQ ID NO: 12)；tCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID NO:13) ;LB:左邊界)。
[0074]按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100040的方法，構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100039 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供))如圖4所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；eCsVMV:木薯葉脈花葉病毒的增強(qiáng)子；prAtTsfl:擬南芥真核延長因子基因I a (Tsfl)啟動子(SEQ ID NO:1 ； eCsVMV:prAtTsfl (SEQ ID NO:6));CTP2:擬南芥屬 EPSPS 的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SEQ ID N0:8);EPSPS:5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ ID N0:9)；E9:豌豆RbcS基因的終止子(SEQ ID NO: 10);prCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ IDN0:11);PAT:草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(SEQ ID NO: 12)；tCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID N0:13) ;LB:左邊界)。
[0075]2、構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100036 (正對照)
[0076]按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100040的方法，構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100036 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供))如圖5所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；eFMV:玄參花葉病毒的34S增強(qiáng)子；prAtTsfl:擬南芥真核延長因子基因I a (Tsfl)啟動子(SEQ ID NO:1 ；eFMV:prAtTsfl (SEQ ID NO:7));CTP2:擬南芥屬 EPSPS 的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SEQ ID N0:8) ;EPSPS:5_烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ ID N0:9) ;E9:豌豆RbcS基因的終止子(SEQ ID N0:10) ;prCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ IDN0:11);PAT:草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(SEQ ID NO: 12);tCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID NO: 13) ；LB:左邊界)。
[0077]3、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0078]對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN100040、DBN100052、DBN10005U DBN100039和DBN100036用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHAlOl中，其轉(zhuǎn)化條件為:100 μ L農(nóng)桿菌EHA101、3 μ L質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體);置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌EHAlOl接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100040、DBN100052, DBN10005U DBN100039 和 DBN100036 結(jié)構(gòu)完全正確。
[0079]第二實(shí)施例、轉(zhuǎn)基因大豆植株的獲得及驗(yàn)證
[0080]1、獲得轉(zhuǎn)基因大豆植株
[0081]按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的大豆品種中黃13的子葉節(jié)組織與第一實(shí)施例中3所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第一實(shí)施例中I和2構(gòu)建的重組表達(dá)載體 DBN100040、DBN100052、DBN100051、DBN100039 和 DBN100036 中的 T-DNA (包括eFMV:prBrTsf I核苷酸序列、eMMV:prAtTsf I核苷酸序列、ePCISV:prAtTsf I核苷酸序列、eCsVMV:prAtTsfl核苷酸序列、eFMV:prAtTsf I核苷酸序列、CTP2核苷酸序列、EPSPS基因、E9終止子序列、prCaMV35S啟動子序列、PAT基因和tCaMV35S終止子序列)轉(zhuǎn)入到大豆染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入eFMV:prBrTsfl核苷酸序列的大豆植株、轉(zhuǎn)入eMMV:prAtTsf I核苷酸序列的大豆植株、轉(zhuǎn)入ePCISV:prAtTsf I核苷酸序列的大豆植株、轉(zhuǎn)入eCsVMV:prAtTsf I核苷酸序列的大豆植株和轉(zhuǎn)入eFMV:prAtTSfl核苷酸序列的大豆植株；同時以野生型大豆植株作為對照。
[0082]對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化,簡要地,將成熟的大豆種子在大豆萌發(fā)培養(yǎng)基(B5鹽3.lg/L，B5維他命，蔗糖20g/L，瓊脂8g/L，pH5.6)中進(jìn)行萌發(fā)，將種子接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上，按以下條件培養(yǎng):溫度25±1°C ;光周期(光/暗)為16/8h。萌發(fā)4-6天后取鮮綠的子葉節(jié)處膨大的大豆無菌苗，在子葉節(jié)下3-4毫米處切去下胚軸，縱向切開子葉，去頂芽、側(cè)芽和種子根。用解剖刀的刀背在子葉節(jié)處進(jìn)行創(chuàng)傷，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸創(chuàng)傷過的子葉節(jié)組織，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)⑺銮逗蠁幼有蛄袀鬟f至創(chuàng)傷過的子葉節(jié)組織(步驟1:侵染步驟)在此步驟中，子葉節(jié)組織優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD66tl=0.5-0.8，侵染培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、B5維他命、 蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS) 40mg/L、2_嗎啉乙磺酸(MES) 4g/L、玉米素(ZT) 2mg/L，pH5.3)中以啟動接種。子葉節(jié)組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天)(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，子葉節(jié)組織在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽
4.3g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2_嗎啉乙磺酸(MES) 4g/L、玉米素2mg/L、瓊脂8g/L，pH5.6)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個選擇性的“恢復(fù)”步驟。在“恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(B5鹽3.lg/L、B5維他命、2-嗎啉乙磺酸(MES) lg/L、蔗糖30g/L、玉米素(ZT)2mg/L、瓊脂8g/L,頭孢霉素150mg/L,谷氨酸100mg/L,天冬氨酸100mg/L,pH5.6)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3:恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，子葉節(jié)再生的組織塊在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。接著，子葉節(jié)再生的組織塊在含選擇劑(草丁膦)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4:選擇步驟)。優(yōu)選地，子葉節(jié)再生的組織塊在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(B5鹽3.lg/L、B5維他命、2-嗎啉乙磺酸(MES)Ig/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤(6-BAP) lmg/L、瓊脂8g/L，頭孢霉素150mg/L，谷氨酸IOOmg/L，天冬氨酸100mg/L，草丁膦6mg/L，pH5.6)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長。然后，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成植物(步驟5:再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的子葉節(jié)再生的組織塊在固體培養(yǎng)基(B5分化培養(yǎng)基和B5生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。
[0083]篩選得到的抗性組織塊轉(zhuǎn)移到所述B5分化培養(yǎng)基(B5鹽3.lg/L、B5維他命、2_嗎啉乙磺酸(MES) lg/L、鹿糖30g/L、玉米素(ZT) lmg/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、谷氨酸50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素lmg/L、生長素lmg/L、草丁膦6mg/L, ρΗ5.6)上,25°C下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述B5生根培養(yǎng)基(B5鹽3.lg/L、B5維他命、2-嗎啉乙磺酸(MES) lg/L、蔗糖 30g/L、瓊脂 8g/L、頭孢霉素 150mg/L、吲哚-3-丁酸(IBA) lmg/L)，在生根培養(yǎng)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實(shí)。在溫室中，每天于26°C下培養(yǎng)16小時，再于20°C下培養(yǎng)8小時。
[0084]2、用TaqMan驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因大豆植株
[0085]分別取轉(zhuǎn)入eFMV:prBrTsfI核苷酸序列的大豆植株、轉(zhuǎn)入eMMV:prAtTsfI核苷酸序列的大豆植株、轉(zhuǎn)入ePCISV:prAtTsf I核苷酸序列的大豆植株、轉(zhuǎn)入eCsVMV:prAtTsf I核苷酸序列的大豆植株和轉(zhuǎn)入eFMV:prAtTSfl核苷酸序列的大豆植株的葉片約IOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA,通過Taqman探針突光定量PCR方法檢測EPSPS基因的拷貝數(shù)。同時以野生型大豆植株作為對照，按照上述方法進(jìn)行檢測分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。[0086]檢測EPSPS基因拷貝數(shù)的具體方法如下:
[0087]步驟11、分別取轉(zhuǎn)入eFMV:prBrTsfl核苷酸序列的大豆植株、轉(zhuǎn)入eMMV:prAtTsfl核苷酸序列的大豆植株、轉(zhuǎn)入ePCISV:prAtTsfl核苷酸序列的大豆植株、轉(zhuǎn)入eCsVMV:prAtTsfl核苷酸序列的大豆植株、轉(zhuǎn)入eFMV:prAtTsfI核苷酸序列的大豆植株和野生型大豆植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復(fù)；
[0088]步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說明書；
[0089]步驟13、 用NanoDrop2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；
[0090]步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/μ I ；
[0091]步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型大豆植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是:
[0092]以下引物和探針用來檢測EPSPS基因:
[0093]引物1:TTGGTGCTAACCTTACCGTTGAG 如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示；
[0094]引物2:GCTTACCACGACCTTCAAGACG 如序列表中 SEQ ID NO: 15 所示；
[0095]探針1:CTGATGCTGACGGTGTGCGTACCATC 如序列表中 SEQ ID NO: 16 所示；
[0096]PCR反應(yīng)體系為:
[0097]
【權(quán)利要求】
1.一種嵌合啟動子，其特征在于，包括至少一個花葉病毒啟動子的順式元件，所述花葉病毒啟動子的順式元件有效連接至少一個Tsfl啟動子的順式元件。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述嵌合啟動子，其特征在于，所述花葉病毒啟動子為花椰菜花葉病毒啟動子、玄參花葉病毒啟動子、花生萎黃病條紋花葉病毒啟動子、木薯葉脈花葉病毒啟動子或紫茉莉花葉病毒啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述嵌合啟動子，其特征在于，所述花葉病毒啟動子的順式元件為花葉病毒啟動子的順式增強(qiáng)子元件。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述嵌合啟動子，其特征在于，所述Tsfl啟動子為擬南芥Tsfl啟動子或油菜Tsfl啟動子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述嵌合啟動子，其特征在于，所述擬南芥Tsfl啟動子的序列如SEQID NO:1所示,所述油菜Tsfl啟動子的序列如SEQ ID NO: 2所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述嵌合啟動子，其特征在于，所述嵌合啟動子為FMV:BrTSfl、MMV:AtTsfl、PCISV:AtTsfl、CsVMV:AtTsfl 或 CaMV: BrTsfl。
7.根據(jù)權(quán)利要求7所述嵌合啟動子，其特征在于，所述嵌合啟動子的序列如SEQIDNO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO:6 所示。
8.—種表達(dá)盒,其特征在于,包括權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述嵌合啟動子和結(jié)構(gòu)DNA序列，所述結(jié)構(gòu)DNA序列有效連接所述嵌合啟動子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述表達(dá)盒，其特征在于，所述結(jié)構(gòu)DNA序列編碼除草劑耐性蛋白質(zhì)或昆蟲抗性蛋白質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述表達(dá)盒，其特征在于，所述結(jié)構(gòu)DNA序列編碼草甘膦耐性蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述表達(dá)盒，其特征在于，所述草甘膦耐性蛋白質(zhì)為5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述表達(dá)盒，其特征在于，所述草甘膦耐性蛋白質(zhì)與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽有效連接。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述表達(dá)盒，其特征在于，所述草甘膦耐性蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄終止子有效連接。
14.根據(jù)權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)所述表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒包括與EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列有效連接的FMV = BrTsf 1，所述EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列與擬南芥屬葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽CTP2和E9終止子有效連接。
15.根據(jù)權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)所述表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒包括與EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列有效連接的MMV = AtTsf 1，所述EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列與擬南芥屬葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽CTP2和E9終止子有效連接。
16.根據(jù)權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)所述表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒包括與EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列有效連接的PCISV = AtTsf 1，所述EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列與擬南芥屬葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽CTP2和E9終止子有效連接。
17.根據(jù)權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)所述表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒包括與EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列有效連接的CsVMV = AtTsfl，所述EPSPS的結(jié)構(gòu)DNA序列與擬南芥屬葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽CTP2和E9終止子有效連接。
18.一種DNA構(gòu)建體，其特征在于，包括至少一個權(quán)利要求8-17任一項(xiàng)所述表達(dá)盒。
19.一種在植物中表達(dá)結(jié)構(gòu)DNA序列的方法，其特征在于,包括將權(quán)利要求18所述DNA構(gòu)建體引入植物細(xì)胞。
20.—種控制雜草的方法,其特征在于,包括將權(quán)利要 求18所述DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物，施用足量草甘膦以控制雜草而不損害所述植物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述控制雜草的方法，其特征在于，所述足量草甘膦為不高于每公頃10080克的草甘膦。
22.—種權(quán)利要求1所述嵌合啟動子或權(quán)利要求18所述DNA構(gòu)建體在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物中的用途。
【文檔編號】C12N15/82GK103740715SQ201310724357
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】龐潔, 張成偉, 王登元, 劉海利, 吳業(yè)春 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心