一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽及其制備方法，屬于食品制備領(lǐng)域。該方法是以堅(jiān)果分離蛋白為原料，采用分步酶催化的方法，首先將蛋白溶液預(yù)熱，冷卻后調(diào)節(jié)pH值及溫度，加入堿性蛋白酶Alcalase2.4L水解，水解后滅酶，冷卻處理，然后加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，離心取上清，濃縮，冷凍干燥，即得抗氧化肽。本發(fā)明操作方便，反應(yīng)效率高，所得產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性和較好穩(wěn)定性，可以將其應(yīng)用于食品添加劑、保健品、藥物載體等領(lǐng)域，產(chǎn)品具有工業(yè)化的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】 一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品制備領(lǐng)域，具體涉及一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]天然抗氧化肽具有極強(qiáng)的抗癌、抗誘導(dǎo)及抗衰老等生物活性，其抗氧化活性往往強(qiáng)于蛋白質(zhì)和氨基酸，此外，與人工合成的食品抗氧化劑相比更加安全可靠，生物體內(nèi)的天然抗氧化肽主要為肌肽和谷胱甘肽，但含量很低，運(yùn)用酶法、發(fā)酵法等手段從天然動(dòng)植物蛋白質(zhì)中可得到抗氧化肽，它們具有較強(qiáng)抑制生物大分子過(guò)氧化和清除體內(nèi)自由基的功能。外源抗氧化肽有望開(kāi)發(fā)為新型功能性食品。
[0003]目前，食物蛋白改性的研究重點(diǎn)就是利用酶法改性，從分子水平上來(lái)講，酶法改性的原理就是對(duì)蛋白質(zhì)分子的主鏈進(jìn)行打斷處理或者修飾蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈，從而能夠引發(fā)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的改變。堅(jiān)果蛋白本身就具有一定的抗氧化作用，而大量研究表明經(jīng)過(guò)水解以后的堅(jiān)果蛋白肽抗氧化效果得到了一些提升，如何能夠進(jìn)一步提高堅(jiān)果蛋白肽的抗氧化活性，成為人們的重點(diǎn)研究方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽及其制備方法，以解決目前單純水解堅(jiān)果蛋白時(shí)存在的氧化肽活性不高的問(wèn)題。
[0005]本發(fā)明采取的技術(shù)方案包括下列步驟:
(1)配濃度為2?10%的堅(jiān)果分離蛋白溶液，在溫度90°C下處理7?20min，冷卻至室
溫；
(2)調(diào)節(jié)上述堅(jiān)果分離蛋白溶液pH值7.0?10，水浴溫度40?60°C，按1000?9000U/g比例加入Alcalase 2.4L,酶解I?6h,結(jié)束后迅速升溫至90°C并保持15min進(jìn)行滅酶處理，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)水解液pH至7.0 ;
(3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分離蛋白與蔗糖的質(zhì)量比為1:1?5，淀粉蔗糖酶加入量100U-300U/g，35°C處理 I ?IOh ;
(4)冷卻至室溫,5000r/min離心10 min,取上清液,濃縮,冷凍干燥，即得產(chǎn)物。
[0006]本發(fā)明步驟(I)中加入的堅(jiān)果分離蛋白為核桃分離蛋白、松子分離蛋白和榛子分離蛋白。
[0007]本發(fā)明步驟(I)中，堅(jiān)果分離蛋白濃度4.6%，90°C處理15min。
[0008]本發(fā)明步驟(2)中，所述堅(jiān)果分離蛋白溶液pH值7.6，溫度50°C，加酶量4510U/g，酶解時(shí)間4h。
[0009]本發(fā)明(3)步驟中，分離蛋白與蔗糖的質(zhì)量比為1:3，淀粉蔗糖酶加入量100U/g，反應(yīng)時(shí)間為8h。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:各參數(shù)是經(jīng)過(guò)單因素結(jié)合響應(yīng)面分析優(yōu)化而來(lái)，本發(fā)明以堅(jiān)果分離蛋白為原料，采用兩步酶催化法生產(chǎn)高活性抗氧化肽，即在用酶法得到堅(jiān)果肽的基礎(chǔ)上再添加另一種酶進(jìn)行酶法改性，所采用的淀粉蔗糖酶在催化反應(yīng)時(shí)僅僅利用了蔗糖裂解時(shí)所釋放的能量而不需要添加ADP或UDP，并且得到更高活性的抗氧化產(chǎn)品。
[0011]本發(fā)明中反應(yīng)溫度為35°C，PH7.0，此條件是淀粉蔗糖酶的最適反應(yīng)條件，反應(yīng)條件溫和，而傳統(tǒng)美拉德反應(yīng)處理溫度需達(dá)到90°C以上，且中間產(chǎn)物復(fù)雜，副產(chǎn)物也較多，不利于后續(xù)分離，本發(fā)明可以保護(hù)抗氧化肽活性，極大降低能耗和生產(chǎn)成本。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，所得產(chǎn)物抗氧化活性高，穩(wěn)定性好，可以將其應(yīng)用于食品添加劑、保健品、藥物載體等領(lǐng)域。
【具體實(shí)施方式】
[0012]以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明作任何限定。
[0013]實(shí)施例中材料來(lái)源:
采用的堅(jiān)果分離蛋白為核桃分離蛋白、松子分離蛋白或榛子分離蛋白。
[0014]Alcalase 2.4L:諾維信水解蛋白酶2.4L購(gòu)自北京高瑞森科技有限公司；測(cè)定酶活 36229.37U/ml ；
淀粉鹿糖酶:將Neisseria polysaccharea(ATCC43768購(gòu)自美國(guó)典型微生物保藏中心)中淀粉蔗糖酶基因在E.coli BL21中異源表達(dá)，利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)重組菌空間進(jìn)行改造，成功構(gòu)建突變株F191M，測(cè)定比酶活202 U/mg。(詳見(jiàn)《多糖奈瑟球菌(Neisseriapolysacchare)淀粉蔗糖酶突變株F191M的構(gòu)建及酶學(xué)性質(zhì)表征》作者張磊，劉春雷，閔偉紅，孫琳琳，方麗)
實(shí)施例1
(1)配濃度為2%的堅(jiān)果分離蛋白溶液，在溫度90°C下處理7min，冷卻至室溫；
(2)調(diào)節(jié)上述堅(jiān)果分離蛋白溶液pH值7.0，水浴溫度40°C，按1000U/g比例加入Alcalase 2.4L,酶解Ih,結(jié)束后迅速升溫至90°C并保持15min進(jìn)行滅酶處理,冷卻至室溫，調(diào)節(jié)水解液pH至7.0 ;
(3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分離蛋白與蔗糖的質(zhì)量比為1:1，淀粉蔗糖酶加入量100U/g，35°C處理 Ih ；
(4)冷卻至室溫,5000r/min離心10 min,取上清液,濃縮,冷凍干燥，即得產(chǎn)物。
[0015]實(shí)施例2
(1)配濃度為6%的堅(jiān)果分離蛋白溶液，在溫度90°C下處理13min，冷卻至室溫；
(2)調(diào)節(jié)上述堅(jiān)果分離蛋白溶液pH值8.5，水浴溫度50°C，按5000U/g比例加入Alcalase 2.4L，酶解3.5h，結(jié)束后迅速升溫至90°C并保持15min進(jìn)行滅酶處理，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)水解液pH至7.0 ;
(3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分離蛋白與蔗糖的質(zhì)量比為1:3，淀粉蔗糖酶加入量200U/g，35°C 處理 5.5h ；
(4)冷卻至室溫,5000r/min離心10 min,取上清液,濃縮,冷凍干燥，即得產(chǎn)物。
[0016]實(shí)施例3
(1)配濃度為10%的堅(jiān)果分離蛋白溶液，在溫度90°C下處理20min，冷卻至室溫；
(2)調(diào)節(jié)上述堅(jiān)果分離蛋白溶液pH值10，水浴溫度60°C，按9000U/g比例加入Alcalase 2.4L,酶解6h,結(jié)束后迅速升溫至90°C并保持15min進(jìn)行滅酶處理,冷卻至室溫，調(diào)節(jié)水解液pH至7.0 ;
(3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分離蛋白與蔗糖的質(zhì)量比為1:5，淀粉蔗糖酶加入量300U/g，35°C處理 IOh ；
(4)冷卻至室溫,5000r/min離心10 min,取上清液,濃縮,冷凍干燥，即得產(chǎn)物。
[0017]實(shí)施例4
(1)配濃度為4.6%的核桃分離蛋白溶液，在溫度90°C下處理15min，冷卻至室溫；
(2)調(diào)節(jié)上述核桃分離蛋白溶液pH值7.6，水浴溫度50°C，按4510U/g比例加入Alcalase 2.4L,酶解4h,結(jié)束后迅速升溫至90°C并保持15min進(jìn)行滅酶處理,冷卻至室溫，調(diào)節(jié)水解液pH至7.0，水解度達(dá)到17.56% ；
(3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分離蛋白與蔗糖的質(zhì)量比為1:3，淀粉蔗糖酶加入量100U/g，35°C 處理 8h ；
(4)冷卻至室溫,5000r/min離心10 min,取上清液,濃縮,冷凍干燥，即得產(chǎn)物。
[0018]實(shí)驗(yàn)例1:對(duì)本發(fā)明制得的產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化指標(biāo)的測(cè)定
抗氧化活性能力以還原能力、自由基清除能力來(lái)評(píng)價(jià)。取ImL樣品(空白用ImL蒸餾水代替，其他試劑依次同下)中，加入2.5mL 1%的鐵氰化鉀溶液和2.5mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液(0.2 mo 1/L)，混勻后在50°C保溫20min，然后加入2.5mL 10%的三氯乙酸，混和后以3 000 r/m in離心IOmin,取上清液2.5mL,加入2.5mL蒸懼水和0.5mL 0.1%的FeCl3，混勻后在700 nm波長(zhǎng)下比色，記錄吸光度A值。吸光度A值與樣品的還原能力有關(guān)，A值越大則樣品的還原能力越強(qiáng)。
`[0019]按上述實(shí)施例4，比較單一酶解`制備出的抗氧化肽與添加淀粉蔗糖酶處理之后所得到的目標(biāo)物的還原能力，做三次平行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1，還原能力提高了 40%。
[0020]表1.兩種肽抗氧化能力的比較
【權(quán)利要求】
1.一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽，其特征在于是由下列方法制得的: (1)配濃度為2?10%的堅(jiān)果分離蛋白溶液，在溫度90°C下處理7?20min，冷卻至室溫； (2)調(diào)節(jié)上述堅(jiān)果分離蛋白溶液pH值7.0?10，水浴溫度40?60°C，按1000?9000U/g比例加入Alcalase 2.4L,酶解I?6h,結(jié)束后迅速升溫至90°C并保持15min進(jìn)行滅酶處理，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)水解液pH至7.0 ; (3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分離蛋白與蔗糖的質(zhì)量比為1:1?5，淀粉蔗糖酶加入量100U-300U/g，35°C處理 I ?IOh ; (4)冷卻至室溫,5000r/min離心10 min,取上清液,濃縮,冷凍干燥，即得產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽，其特征在于:步驟(I)中加入的堅(jiān)果分離蛋白為核桃分離蛋白、松子分離蛋白和榛子分離蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽，其特征在于:步驟(I)中，堅(jiān)果分離蛋白濃度4.6%，90°C處理15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽，其特征在于:步驟(2)中，所述堅(jiān)果分離蛋白溶液PH值7.6，溫度50°C，加酶量4510U/g，酶解時(shí)間4h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽，其特征在于:步驟(3)中，分離蛋白與鹿糖的質(zhì)量比為1:3，淀粉鹿糖酶加入量100U/g,反應(yīng)時(shí)間為8h。
6.如權(quán)利要求1所述的一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括下列步驟: (1)配濃度為2?10%的堅(jiān)果分離蛋白溶液，在溫度90°C下處理7?20min，冷卻至室溫； (2)調(diào)節(jié)上述堅(jiān)果分離蛋白溶液pH值7.0?10，水浴溫度40?60°C，按1000?9000U/g比例加入Alcalase 2.4L,酶解I?6h,結(jié)束后迅速升溫至90°C并保持15min進(jìn)行滅酶處理，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)水解液pH至7.0 ; (3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分離蛋白與蔗糖的質(zhì)量比為1:1?5，淀粉蔗糖酶加入量100U-300U/g，35°C處理 I ?IOh ; (4)冷卻至室溫,5000r/min離心10 min,取上清液,濃縮,冷凍干燥，即得產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽的制備方法，其特征在于:步驟(I)中加入的堅(jiān)果分離蛋白為核桃分離蛋白、松子分離蛋白和榛子分離蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽的制備方法，其特征在于:步驟(I)中，堅(jiān)果分離蛋白濃度4.6%，90°C處理15min。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，所述堅(jiān)果分離蛋白溶液pH值7.6，溫度50°C，加酶量4510U/g，酶解時(shí)間4h。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種高活性堅(jiān)果抗氧化肽的制備方法，其特征在于:步驟(3)中，分離蛋白與蔗糖的質(zhì)量比為1:3，淀粉蔗糖酶加入量100U/g，反應(yīng)時(shí)間為8h。
【文檔編號(hào)】A23J3/34GK103689215SQ201310725578
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】閔偉紅, 劉春雷, 方麗 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)