醇脫氫酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種醇脫氫酶突變體，為野生型醇脫氫酶的氨基酸發(fā)生如下任意一種情況的突變：野生型醇脫氫酶的序列中第35位絲氨酸突變?yōu)樘於彼?；野生型醇脫氫酶的序列中?5位絲氨酸突變?yōu)樘於彼幔业?6位精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?；野生型醇脫氫酶的序列中?4位丙氨酸、纈氨酸、或半胱氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔业?5位絲氨酸突變?yōu)樘於彼?，且?6位精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔灰吧痛济摎涿傅男蛄兄械?3位絲氨酸突變?yōu)楸彼?，且?4位丙氨酸、纈氨酸、或半胱氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，且?5位絲氨酸突變?yōu)樘於彼幔业?6位精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?；所述的野生型醇脫氫酶的序列如SEQ?ID?NO：2、4、6或8中的任意一項(xiàng)所示。
【專利說明】醇脫氫酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種可用作手性醇合成催化劑的醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase, ADH)突變體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]手性醇(Chiral Alcohols)在手性藥物、農(nóng)用化學(xué)品以及多種類型的手性材料制備中有廣泛應(yīng)用。以(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯[(S)-CHBE]為例，(S)-CHBE可用于很多活性藥物的合成，它是對映體選擇性合成Slagenins B和C以及他汀類藥物一羥甲基戊二酰CoA (HMG-CoA)還原酶抑制劑的關(guān)鍵手性中間體，而且(S)-CHBE還可以轉(zhuǎn)化生成1，4-二氫吡啶類(6-阻滯劑[I]。
[0003]羰酰還原酶生物催化法不對稱還原COBE制備(S) -CHBE法因其高效率、高立體選擇性、反應(yīng)條件溫和以及經(jīng)濟(jì)和社會效益好等優(yōu)點(diǎn)受到普遍關(guān)注[2]。然而，該反應(yīng)的進(jìn)行需要消耗一定量的輔酶一NAD (P)H。這類還原態(tài)輔酶往往價(jià)格昂貴且穩(wěn)定性低，從技術(shù)經(jīng)濟(jì)角度考慮，生產(chǎn)中投加大量輔酶是不可行的，因此輔酶的高效原位再生成為了發(fā)展應(yīng)用氧化還原酶工業(yè)生物催化技術(shù)的瓶頸問題。
[0004]為了解決輔酶再生的問題，已經(jīng)提出了酶法、光化學(xué)法、電化學(xué)法等一系列的方法
[3]，其中酶法再生系統(tǒng)因其具有反應(yīng)速率快、選擇性高、再生體系與合成體系兼容性好、過程易于監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛重視，迄今已報(bào)道了多種脫氫酶、氧化酶、氫化酶參與實(shí)現(xiàn)的輔酶再生系統(tǒng)，其中甲酸脫氫酶(Formate dehydrogenase, FDH)是公認(rèn)的煙酰胺型還原態(tài)輔酶再生系統(tǒng)的首選用酶[4-5]。甲酸脫氫酶催化甲酸生成CO2和H2O,伴隨一分子的NAD+還原為NADH。該反應(yīng)的底物甲酸廉價(jià)易得，且對合成體系的酶影響較小，而生成產(chǎn)物CO2易于分離，使反應(yīng)接近不可逆過程，有利于提高酶轉(zhuǎn)化效率，此外研究表明FDH適宜pH范圍廣泛，易于實(shí)現(xiàn)再生系統(tǒng)與合成系統(tǒng)的有效耦聯(lián)。然而由于該體系只能實(shí)現(xiàn)NADH的再生，而短鏈脫氫酶家族中不少酶都是NADPH依賴型。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組學(xué)研究的日益發(fā)展，采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改變酶的輔酶依賴型，從而很好地與甲酸脫氫酶偶聯(lián)應(yīng)用于輔酶再生體系，是近年來該領(lǐng)域的主要研究方向。
[0005]目前已有不少文獻(xiàn)報(bào)道了通過定點(diǎn)突變手段實(shí)現(xiàn)酶的輔酶特異性的改變。早期的文獻(xiàn)報(bào)道大多采用序列比對等較為經(jīng)驗(yàn)性的方式獲得突變位點(diǎn)，Katzberg等以酵母還原酶Gre2p為研究對象，將其序列與赭色擲孢酵母羰基還原酶SSCR的序列進(jìn)行比對，選擇Asn9作為突變位點(diǎn)，采用定點(diǎn)突變技術(shù)，獲得突變體N9E，研究該突變酶的輔酶特異性發(fā)現(xiàn)，NADH/NADPH的值為0.9，而其野生型的值僅為0.007 [6]。采用類似的位點(diǎn)選擇方法的報(bào)道還有Zhang等2008年對來自近平滑念珠菌的羰基還原酶SCR所作的研究，選擇了輔酶結(jié)合位點(diǎn)附近的Ser67，His68, Pro69作為突變位點(diǎn)。結(jié)果顯示，雙位點(diǎn)突變酶S67D/H68D在保留了酶的穩(wěn)定性與立體選擇性的基礎(chǔ)上，其輔酶依賴型由NADPH依賴型變?yōu)楦鼉A向于依賴NADH[7]。隨著生物信息學(xué)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)等領(lǐng)域的快速發(fā)展，對輔酶結(jié)合域的研究越發(fā)理性化，越來越多的報(bào)道采用計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)改造。大連科技大學(xué)2010年就研究發(fā)表了有關(guān)通過理性設(shè)計(jì)改變輔酶特異性的報(bào)道。文獻(xiàn)報(bào)道了經(jīng)通過自由能計(jì)算判斷酶與輔酶的結(jié)合情況的方式，并釆用丙氨酸篩選突變以確定影響輔酶特異性的關(guān)鍵位點(diǎn)。在充分的理論分析與理性設(shè)計(jì)后，獲得Asp41Gly，Asp41Ala兩個(gè)突變體，結(jié)果顯示突變酶的輔酶特異性均發(fā)生顯著改變。從結(jié)構(gòu)上分析該現(xiàn)象的結(jié)構(gòu)性原理顯示突變后削弱了 Asp41與磷酸基團(tuán)之間的酯化作用[8]。同樣的Morikawa等通過計(jì)算機(jī)輔助手段對來自木蘭假絲酵母的SI進(jìn)行研究，經(jīng)虛擬篩選等理性設(shè)計(jì)最終獲得的突變酶徹底失去了原本利用NADPH的能力，但其催化活性卻只保留了野生型的14%[9]。
[0006]綜上所述，現(xiàn)有的關(guān)于輔酶特異性改造的研究已得到進(jìn)一步的發(fā)展，但就現(xiàn)有的研究成果而言，釆用理性設(shè)計(jì)的研究并不多，改造后酶的活性大多出現(xiàn)不同程度的損失，輔酶特異性發(fā)生一定的改變卻不能徹底改變等，這些方面都有較大的發(fā)展空間。
[0007]參考文獻(xiàn):[0008][I] Lee SHj Park 0J.Uses and production of chiral3-hydroxy- Y-butyrolactones andstructurally related chemicals[J].Appl MicrobiolBiotechnol，2009，84:817 ~828.[0009][2] Yasohara Y, Kizaki N, Hasegawa J，Takahashi S，Wada M，Kataoka M, ShimizuS.Synthesis of optically activie ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate by microbialreduction[J].Appl Microbiolo Biotechnol，1999，51:847 ~851.[0010][3]Bergel, A.，Comtat，M.，Electroenzymatic reactors with coenzymeregeneration:Atheoretical approach[J].Biotechnol Bioeng，1986,28 (5):728-735.[0011][4]Van der Donk W.A., Zhao H., Recent developments in pyridine nucleotideregeneration[J].Curr Opin Biotechnol, 2003，14(4):421-426.[0012][5]Wichmann R.,Vasic-Racki D., Cofactor regeneration at the labscale[J].Adv BiochemEng Biotechnol，2005，92:225-260.[0013][6] Katzberg M.，Skorupa-Parachin N.，Gorwa-Grauslund M.F.，BertauM.，Engineeringcofactor preference of ketone reducing biocatalysts: amutagenesis study on a Y-diketonereductase from the Yeast saccharomycescerevisiae serving as an example[J].1nt J Mol Sci，2010，11 (4):1735-1758.[0014][7] Zhang R.，Xu Y.，Sun Y.，Zhang W., Xiao R., Ser67Asp and His68Aspsubstitutions inCandida parapsilosis carbonyl reductase alter the coenzymespecificity and enantioselectivityof ketone reduction[J].Appl EnvironMicrobiol,2009，75:2176-2183.[0015][8]Ma C., Zhang L., Dai J., Xiu Z., Relaxing the coenzyme specificityofI, 3-propanedioloxidoreductase from Klebsiella pneumoniae by rationaldesign[J].J Biotechnol,2010，146:173-178.[0016][9]Morikawa S., Nakai T., Yasohara Y., Nanba H.，Kizaki N., HasegawaJ., Highly activemutants of carbonyl reductase Slwith inverted coenzymespecificity and production ofoptically active alcohols[J].Biosci BiotechnolBiochem，2005，69 (3): 544-552.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明的所要解決的技術(shù)問題是提供一種醇脫氫酶突變體，其輔酶依賴型由野生型的NADPH依賴型變?yōu)镹ADH依賴型。
[0018]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0019]醇脫氫酶突變體，為野生型醇脫氫酶的氨基酸發(fā)生如下任意一種以上情況的突變:
[0020](I)野生型醇脫氫酶的氨基酸序列中第35位絲氨酸突變?yōu)樘於彼幔?br> [0021](2)野生型醇脫氫酶的氨基酸序列中第35位絲氨酸突變?yōu)樘於彼幔业?6位精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?br> [0022](3)野生型醇脫氫酶的氨基酸序列中第34位丙氨酸、纈氨酸、或半胱氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，且?5位絲氨酸突變?yōu)樘於彼?，且?6位精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?br> [0023](4)野生型醇脫氫酶的氨基酸序列中第13位絲氨酸突變?yōu)楸彼幔业?4位丙氨酸、纈氨酸、或半胱氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，且?5位絲氨酸突變?yōu)樘於彼幔业?6位精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?br> [0024]其中，所述的野生型醇脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4、6或8中的任意一項(xiàng)所示。所述的野生型醇脫氫酶的氨基酸序列優(yōu)選如SEQ ID N0:2所示。
[0025]一種重組質(zhì)粒，它是含有編碼權(quán)利要求1所述的醇脫氫酶突變體的基因序列的質(zhì)粒。其中，所述的質(zhì)粒為pET24a(+)。
[0026]一種重組菌，它是`含有權(quán)利要求2所述重組質(zhì)粒的菌株。其中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌 E.coli BL21(DE3)。
[0027]上述醇脫氫酶突變體在催化前手性羰基化合物進(jìn)行不對稱還原反應(yīng)形成手性醇中的應(yīng)用。
[0028]其中，所述的前手性羰基化合物為4-氯乙酰乙酸乙酯。
[0029]其中，所述的手性醇為(S)-4_氯-3羥基丁酸乙酯。
[0030]其中，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以醇脫氫酶突變體為催化劑，不對稱還原反應(yīng)制備得到(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯；具體反應(yīng)條件為:3U/mL的醇脫氫酶突變體與IOOmM甲酸鈉、50g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、6U/mL的甲酸脫氫酶和0.5mM的NAD+，在pH6.5、30°C、200rpm條件下反應(yīng)12h，得到(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。
[0031]上述醇脫氫酶突變體，在催化羰基化合物生成羥基產(chǎn)物的反應(yīng)中，與野生型的醇還原酶相比，輔酶依賴型發(fā)生徹底的改變，變?yōu)镹ADH依賴型，并且具有更高的催化活性和催化效率。
[0032]以SEQ ID NO:2為例說明本發(fā)明的主要原理:通過體外定點(diǎn)突變(site-directedmutagenesis)技術(shù)對醇脫氫酶進(jìn)行修飾，作為模板的醇脫氫酶，其Genebank登錄號為ABB91667，由241個(gè)氨基酸組成，序列如SEQ ID NO:2所示；其編碼DNA序列包括726bp，序列如SEQ ID NO:1所示；通過上述定體外點(diǎn)突變的方法獲得的基因片段與pET24a(+)表達(dá)載體連接，并在大腸桿菌中過量表達(dá)。經(jīng)過過量表達(dá)的醇脫氫酶突變體在SDS-PAGE上呈現(xiàn)的分子量約為25kD。所述體外定點(diǎn)突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是改造/優(yōu)化基因的常用手段，其原理是設(shè)計(jì)兩對引物，采用定點(diǎn)突變的方法在基因中定點(diǎn)特異性的引入其他氨基酸。[0033]本發(fā)明的有益效果是:
[0034]本發(fā)明所述醇脫氫酶突變體，可以有效的說明該醇脫氫酶中參與輔酶結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸；并且本發(fā)明所得突變體蛋白 S35D，S35D/R36I, A34I/S35D/R36I, S13A/S35D/R36I,S13A/A34I/S35D/R36I,其輔酶依賴型均發(fā)生改變，其中突變體S3OT/R36I，A34I/S35D/R36I，S13A/S35D/R36I, S13A/A34I/S35D/R36I的輔酶依賴型發(fā)生徹底改變，即嚴(yán)格依賴于NADH ;同時(shí)突變體S13A/S35D/R36I，S13A/A34I/S35D/R36I的催化活性達(dá)到野生型酶的3倍，與甲酸脫氫酶偶聯(lián)應(yīng)用于NADH輔酶再生體系，能有效的用于羰基類化合物的催化還原反應(yīng)，例如:催化4-氯乙酰乙酸乙酯生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，與野生型醇還原酶相比具有更高的轉(zhuǎn)化效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是實(shí)施例3中醇還原酶及其突變體表達(dá)并純化結(jié)果的SDS-PAGE分析；
[0036]圖2是實(shí)施例6中突變酶S13A/A34I/S3OT/R36I與甲酸脫氫酶偶聯(lián)制備(S) -CHBE的催化效率的結(jié)果分析。
【具體實(shí)施方式】:
[0037]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0038]實(shí)施例1~5是描述醇脫氫酶(SEQ ID No:2)的突變體的獲得與酶的性能的測定。
[0039]實(shí)施例1:醇脫氫酶基因的構(gòu)建。
[0040]1、醇脫氫酶基因的獲取:
[0041]木蘭假絲酵母(Candidamagnoliae ATCC12573),培養(yǎng)基 YPD (g* L1):酵母提取物IOg,蛋白胨20g,葡萄糖20g,補(bǔ)蒸懼水至1L。
[0042]將木蘭假絲酵母(Candida magnoliae ATCC12573)接種于5mL YTO液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用基因組DNA提取試劑盒(北京天為生物工程有限公司酵母基因組提取試劑盒，⑶2415Yeast gDNA Kit)提取基因組。
[0043]構(gòu)建表達(dá)載體所用的引物加設(shè)酶切位點(diǎn)引物序列如下:
[0044]上游引物為(NdeIsite is underlined):
[0045]5’-GGAATTCCATATGACGACTACTTCAAATGCGCTCGTCAC-3’
[0046]下游引物為(EcoRIsite is underlined):
[0047]5’-CCGGAATTCCTAAGCAATCAAGCCATTGTCGACCAC-3’
[0048]所有引物均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。
[0049]基因的PCR條件:
[0050]94°C變性7min，按如下參數(shù)循環(huán)35次:94°C變性lmin，55°C退火30s，72°C延伸60s。最后 72°C延伸 IOmin0
[0051]PCR 體系:Pfu 酶(2.5U/ml) Iul,模板(5_50ng) lul, dNTP4ul, IOXreactionbuffer5ul, primer 各 lul, ddH20 補(bǔ)足 50ul。
[0052]2、表達(dá)載體的構(gòu)建:[0053]用Nde I及EcoR I分別酶切pET_24a (+)(購于Novagen默克中國)及所擴(kuò)增含有兩個(gè)酶切位點(diǎn)的目的基因，分別膠回收已雙酶切的目的片段和表達(dá)載體，將已雙酶切的表達(dá)載體pET-24a (+)與目的基因用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接過夜，得到重組載體pET_24a_ADH ；將10uL的連接產(chǎn)物pET-24a-ADH加入100u L的E.coli BL21 (DE3)(實(shí)驗(yàn)室保藏)感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min，42°C熱激90s。冰上放置2min。加入預(yù)熱的0.45mL SOC培養(yǎng)基。220rpm37°C 1h。將200 u L菌液加入含有30 u g/mL的卡那霉素的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)12 ~16h，得到重組菌 E.coli BL21 (含 pET_24a_ADH)。
[0054]實(shí)施例2:醇脫氫酶突變體基因的構(gòu)建。
[0055]1、定點(diǎn)突變
[0056]采用Stratagene公司的快速轉(zhuǎn)換定點(diǎn)突變試劑盒對位于Serl3, Ala34, Ser35, Arg36位點(diǎn)的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變。其引物設(shè)計(jì)如下(均按5’ -3’方向描述，下劃線代表突變位點(diǎn)):
[0057]Ser35Asp (pET24a_ADH 重組質(zhì)粒作為模板)
[0058]S35D-1:CAGTGTTACGCTGGCCGACCGCAGTGTTG
[0059]S35D-2:CAACACTGCGGTCGGCCAGCGTAACACTG
[0060]Ser35Asp/Arg36Ile (突變體 Ser35Asp 作為模板)
[0061 ] S35D/R361-1:CAGTGTTACGCTGGCCGACATCAGTGTTG
[0062]S35D/R361-2:CAACACTGATGTCGGCCAGCGTAACACTG
[0063]Ala34Ile/Ser35Asp/Arg36Ile (突變體 Ser35Asp/Arg36Ile 作為模板)
[0064]A34I/S35D/R361-1:CAGTGTTACGCTGATCGACCGCAGTGTTG
[0065]A34I/S35D/R361-2:CAACACTGCGGTCGATCAGCGTAACACTG
[0066]Serl3Ala/Ser35Asp/Arg36Ile (突變體 Ser35Asp/Arg36Ile 作為模板)
[0067]S13A/S35D/R361-1:GCTCGTCACTGGAGGCGCCCGCGGCATTGGCGCTG
[0068]S13A/S35D/R361-2:
[0069]CAGCGCCAATGCCGCGGGCGCCTCCAGTGACGAGC
[0070]Serl3Ala/Ala34Ile/Ser35Asp/Arg36Ile
[0071](突變體Ala34Ile/Ser35Asp/Arg36Ile 作為模板)
[0072]S13A/A34I/S35D/R361-1:GCTCGTCACTGGAGGCGCCCGCGGCATTGGCGCTG
[0073]S13A/A34I/S35D/R361-2:CAGCGCCAATGCCGCGGGCGCCTCCAGTGACGAGC
[0074]PCR反應(yīng)條件如下:
[0075]95°C變性120s，按如下參數(shù)循環(huán)18次:95°C變性30s，55 °C退火60s，68 °C延伸360s。最后 68°C延伸 5min。
[0076]PCR 體系:Pfu 酶(2.5U/ml) lul,模板(5_50ng) lul, dNTP4ul, IOXreactionbuffer5ul, primer 各 lul, ddH20 補(bǔ)足 50ul。
[0077]PCR反應(yīng)結(jié)束后，加入DpnI消化酶于反應(yīng)混合物中并置于37°C孵育lh，轉(zhuǎn)化到試劑盒提供的E.coli XLlO-Gold超級感受態(tài)細(xì)胞中。
[0078]2、醇脫氫酶及其突變酶的表達(dá)
[0079]挑取重組菌E.coli BL21 (含醇脫氫酶及其突變酶基因的重組質(zhì)粒)及出發(fā)大腸桿菌BL21 (DE3)至含30u g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。然后按2%接種量分別接種到新鮮含30 u g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD_約為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度0.8mmol ? I71，30°C，200rpm，誘導(dǎo)表達(dá)12h后，離心(4°C,5000rpm，15min)，菌泥用IOOmM磷酸鉀緩沖(pH6.2)重懸待用。
[0080]實(shí)施例3:醇脫氫酶及其突變酶的純化。
[0081]1、粗酶液的制備:取誘導(dǎo)后的LB培養(yǎng)液8000r ? min_l，離心15min收集菌體，用無菌水洗滌兩次后，將菌體重懸于pH6.220mmol -L-1磷酸緩沖液中，冰浴中超聲破碎細(xì)胞。將超聲破碎后的樣品12，OOOr ? min-l，4°C離心IOmin取上清即為粗酶液。
[0082]2、硫酸銨沉淀:將粗酶液置于冰浴中，在磁力攪拌下向其中緩慢滴加飽和硫酸銨溶液，至硫酸銨終濃度為30%，于4度下攪拌過夜。離心，取上清。同樣在冰浴條件下于上清中緩慢滴加飽和硫酸銨溶液至終濃度為60%，于4度下攪拌過夜。離心，棄上清，將沉淀溶于適量pH6.2的磷酸緩沖。
[0083]3、疏水作用層析:采用美國GE公司的AKTA prime層析系統(tǒng)，Phenyl SepharoseFastFlow疏水作用層析柱進(jìn)行分離，層析柱用pH7.4，1.5M (NH4)2SO4, 20mM磷酸緩沖(緩沖A)預(yù)平衡，洗脫緩沖液為pH7.4，20mM磷酸緩沖(緩沖B)，采用0% -100%緩沖B梯度洗脫，總洗脫時(shí)間為130min，將收集的活性蛋白裝入透析袋經(jīng)PEG20000吸水濃縮后再進(jìn)行透析除鹽，4度下透析48h。每隔8h更換一次透析緩沖。透析后蛋白樣品在1000Orpm冷凍離心5min,收集上清測定蛋白濃度和活性。
[0084]4、用垂直電泳儀進(jìn)行SDS-PAGE檢測收集到的蛋白樣品。SDS-PAGE的膠濃度為12%，先用90V電壓進(jìn)行濃縮電泳，再改為150V進(jìn)行分離電泳。結(jié)果表明構(gòu)建并表達(dá)純化得到的醇脫氫 酶及其突變體蛋白為可溶性表達(dá)，且大小均在30kD左右。
[0085]參見附圖1，醇脫氫酶及其突變體蛋白純化結(jié)果的SDS-PAGE分析。12%SDS_PAGE分析醇脫氫酶及其突變體蛋白經(jīng)過量表達(dá)并純化后的結(jié)果:a)泳道1:攜有空質(zhì)粒的E.coliBL2KDE3)誘導(dǎo)表達(dá)后的總蛋白作為空對照，泳道2:醇脫氫酶的粗酶液，泳道3:硫酸銨沉淀后的醇脫氫酶蛋白，泳道4:疏水層析后回收的醇脫氫酶蛋白，泳道5:蛋白分子標(biāo)記，泳道6:疏水層析后回收的突變體S3?蛋白，泳道7:硫酸銨沉淀后的突變體S3?蛋白，泳道8:突變體S3?的粗酶液，泳道9:攜有空質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)后的總蛋白作為空對照；b)泳道1:攜有空質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)后的總蛋白作為空對照，泳道2:突變體S3OT/R36I的粗酶液，泳道3:硫酸銨沉淀后的突變體S3OT/R36I蛋白，泳道4:疏水層析后回收的突變體S3OT/R36I蛋白，泳道5:蛋白分子標(biāo)記，泳道6:攜有空質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)后的總蛋白作為空對照，泳道7:突變體A34I/S35D/R36I的粗酶液，泳道8:硫酸銨沉淀后的突變體A34I/S35D/R36I蛋白，泳道9:疏水層析后回收的突變體A34I/S35D/R36I蛋白；c)泳道1:攜有空質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)后的總蛋白作為空對照，泳道2:突變體S13A/S35D/R36I的粗酶液，泳道3:硫酸銨沉淀后的突變體S13A/S35D/R36I蛋白，泳道4:疏水層析后回收的突變體S13A/S35D/R36I蛋白，泳道5:蛋白分子標(biāo)記，泳道6:疏水層析后回收的突變體S13A/A34I/S3OT/R36I蛋白，泳道7:硫酸銨沉淀后的突變體S13A/A34I/S3OT/R36I蛋白，泳道8:突變體S13A/A34I/S3OT/R36I的粗酶液，泳道9:攜有空質(zhì)粒的E.coli BL2KDE3)誘導(dǎo)表達(dá)后的總蛋白作為空對照。
[0086]實(shí)施例4:醇脫氫酶及其突變酶的活性測定。
[0087]測定純化得到的醇脫氫酶及其突變酶的酶活。酶活測定反應(yīng)體系包括IOOmM磷酸鉀緩沖液(PH6.2)，ImM NADPH, IOmM COBE, 30°C，340nm處測定吸光值的下降。酶活定義為每分鐘內(nèi)氧化lymol NADPH所需要的酶量為一個(gè)酶活單位U。蛋白采用Brandford法進(jìn)行測定。
[0088]參見表1，對實(shí)施示例三所獲得的醇脫氫酶及其突變體純蛋白進(jìn)行活性測定。結(jié)果表明，突變體蛋白 S3?，S35D/R36I，A34I/S35D/R36I，S13A/S35D/R36I, S13A/A34I/S35D/R36I,其輔酶依賴型均發(fā)生改變，其中突變體S3OT/R36I，A34I/S35D/R36I, S13A/S35D/R36I, S13A/A34I/S35D/R36I的輔酶依賴型發(fā)生徹底改變，即嚴(yán)格依賴于NADH ;同時(shí)突變體S13A/S35D/R36I, S13A/A34I/S35D/R36I的催化活性達(dá)到野生型酶的3倍達(dá)到36U/mg。
[0089]表1醇脫氫酶及其突變體的比活力
【權(quán)利要求】
1.醇脫氫酶突變體，為野生型醇脫氫酶的氨基酸發(fā)生如下任意一種情況的突變: (1)野生型醇脫氫酶的氨基酸序列中第35位絲氨酸突變?yōu)樘於彼幔? (2)野生型醇脫氫酶的氨基酸序列中第35位絲氨酸突變?yōu)樘於彼?，且?6位精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔? (3)野生型醇脫氫酶的氨基酸序列中第34位丙氨酸、纈氨酸、或半胱氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，且?5位絲氨酸突變?yōu)樘於彼?，且?6位精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔? (4)野生型醇脫氫酶的氨基酸序列中第13位絲氨酸突變?yōu)楸彼?，且?4位丙氨酸、纈氨酸、或半胱氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔业?5位絲氨酸突變?yōu)樘於彼?，且?6位精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔? 其中，所述的野生型醇脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4、6或8中的任意一項(xiàng)所示。
2.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，它是含有編碼權(quán)利要求1所述的醇脫氫酶突變體的基因序列的質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的質(zhì)粒為pET24a(+)。
4.一種重組菌，其特征在于，它是含有權(quán)利要求2所述重組質(zhì)粒的菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于，宿主細(xì)胞為大腸桿菌E.coliBL21(DE3)。
6.權(quán)利要求1所述的醇脫氫酶突變體在催化前手性羰基化合物進(jìn)行不對稱還原反應(yīng)形成手性醇中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的前手性羰基化合物為4-氯乙酰乙酸乙酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的手性醇為(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求6~8中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以醇脫氫酶突變體為催化劑，不對稱還原反應(yīng)制備得到(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯；具體反應(yīng)條件為:3U/mL的醇脫氫酶突變體與IOOmM甲酸鈉、50g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、6U/mL的甲酸脫氫酶和0.5mM的NAD+，在pH6.5、30°C、200rpm條件下反應(yīng)12h，得到(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。
【文檔編號】C12N15/70GK103642765SQ201310727759
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】嚴(yán)明, 許琳, 邱曉鸞 申請人:南京工業(yè)大學(xué)