一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶及其制備方法，屬于酶制劑制備【技術(shù)領(lǐng)域】。所述生長豬專用酶由黑曲霉培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、中草藥提取物、保護(hù)劑、激活劑科學(xué)復(fù)配而成，其中黑曲霉培養(yǎng)物中黑曲霉菌體在生長和發(fā)酵過程中能夠抑制致病性大腸桿菌的生長；抑制黃曲霉生長和繁殖、分解黃曲霉毒素；促進(jìn)動物生長、調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡、提高整體免疫力，并且黑曲霉培養(yǎng)物發(fā)酵液粗酶液中含有蛋白酶、甘露聚糖酶、α-半乳糖酶、果膠酶多種酶活力，特別適合生長豬飼料的添加。
【專利說明】一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶制劑制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在飼料中添加酶制劑主要由以下4個理由:1.降解在動物飼料中存在的抗?fàn)I養(yǎng)因子。這些物質(zhì)不能被動物內(nèi)源酶降解，從而干擾動物的正常代謝，導(dǎo)致動物消化不良，生產(chǎn)性能下降。2.提高淀粉、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)的利用率。這些物質(zhì)或者被富含纖維的細(xì)胞壁包圍，或者以某些不能被動物消化的結(jié)構(gòu)形式存在(例如在植物飼料原料中，大量的磷以植酸磷的形式存在。)。3.在原料中降解某些特定的化學(xué)鍵。這些化學(xué)鍵不能被動物自身的酶所降解，加入外源酶以后可以釋放更多的營養(yǎng)物。4.由于幼齡動物自身消化系統(tǒng)還不成熟，內(nèi)源酶不足添加外源酶可以提高飼料消化率，防止出現(xiàn)消化不良癥狀。除了可以提高日糧的利用率以外，加酶還可以減少飼料原料之間的差異，提高飼料配方的精確性，同時還可以提高動物生長的整齊性，減少管理成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。使用酶制劑還可以保護(hù)環(huán)境。由于飼料的利用率提高了，相應(yīng)的糞便排放量下降了。在效果比較明顯的情況下，糞便的排放量可以減少20%左右，豬糞中氮的排放下降15%左右，雞糞中氮的排放下降20%。對于植酸磷，可以大幅度減少磷對環(huán)境的污染。
[0003]目前在飼料工業(yè)中應(yīng)用的酶制劑主要有4大類:分別用來降解纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉和植酸。
[0004]纖維降解酶:對于單胃動物來說，消化的最大阻力是不能產(chǎn)生降解纖維的酶，在含有小麥、大麥、燕麥等組分的日糧中，很大一部分纖維是阿拉伯木聚糖和β—葡聚糖。水溶性的纖維能提高小腸內(nèi)容物的粘度，阻礙養(yǎng)分的吸收，從而降低動物的生長性能。同時這種狀況還和一些由于消化不良引起的疾病有關(guān)。如豬的性欲減退、禽的黑趾癥和小豬拉稀。由于品種、生長地點(diǎn)和氣候條件等因素的影響，大麥和小麥中纖維含量的變化很大，導(dǎo)致含有這些組分的日糧的營養(yǎng)價值差異很大。纖維降解酶、木聚糖酶和β—葡聚糖可以減少這些差異，提高動物的生長性能和整齊度。同時還可以減少某些消化不良的疾病。
[0005]蛋白降解酶:在動物日糧中蛋白質(zhì)來自各種詞料原料，它們最終通過降解的氣基酸存積在瘦肉中。在單胃動物日糧中，添加蛋白酶(不同飼料原料蛋白質(zhì)和品質(zhì)和可利用性)除了能充分降解大部分儲蛋白質(zhì)或儲藏蛋白質(zhì)或?yàn)閯游锟衫玫男》肿与耐?，還能夠通過降解抗?fàn)I養(yǎng)因素而改善飼料營養(yǎng)價值。存積的效率差異很大。在植物蛋白源，如豆餅粉中存在著一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，如幾鞣質(zhì)和胰蛋白酶抑制因子，可能會對小腸吸收表面造成損害，影響營養(yǎng)物的吸收。另外，幼齡動物不完善的消化體系是得植物蛋白(如豆餅粉)中的蛋白質(zhì)不能得到很好的利用。
[0006]淀粉降解酶:許多營養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為玉米是飼料原料的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。絕大數(shù)營養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為玉米不存在消化不良性，消化率超過95%，但是最近Noy和Sklan研究表明(1994年)在理想狀態(tài)下，4一 12日齡的·肉雞日糧中，淀粉的消化率很少超過85%，添加淀粉酶可以使淀粉在小腸得到更多更快的降解。在仔豬斷奶期，由于營養(yǎng)、環(huán)境和免疫系統(tǒng)的變化，體重會下降。在日糧中添加淀粉酶和其他一些酶，可以增加動物內(nèi)源消化酶分泌，進(jìn)而改進(jìn)營養(yǎng)的消化吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化率和動物生長率。
[0007]植酸降解酶:對于所有的動物來說，磷對于骨骼的礦化、免疫、繁殖、生長都是至關(guān)重要的。豬和家禽單胃動物只能里利用植物飼料中30— 40%的磷，其余60— 70%的植酸磷事故無法利用的。在許多情況下，飼料日糧中必須補(bǔ)充無機(jī)磷來滿足動物生長的需要。飼料中一半以上的磷隨著糞便排放到環(huán)境中，污染環(huán)境。添加植酸酶可以降解植酸，釋放植酸分子中的磷。這樣可以產(chǎn)生2個益處:1.減少了飼料中磷的添加量。2.減少了畜禽糞便對環(huán)境的磷污染。
[0008]顯而易見:作為飼料酶種的四大主角，他們的作用機(jī)理和模式在很大程度決定或推動了動物飼料產(chǎn)業(yè)對于酶制劑技術(shù)的吸收運(yùn)用。目前在肉雞料中添加酶的產(chǎn)出投入比例超過2:1。相對而言，在養(yǎng)豬業(yè)領(lǐng)域，酶制劑的使用情況就比較復(fù)雜，顯得不明朗。集約化程度低，涉及環(huán)節(jié)比較多，酶制劑的使用效果很難進(jìn)行商業(yè)計(jì)算。盡管在20世紀(jì)50年代已經(jīng)有了使用酶制劑的設(shè)想，但是直到20世紀(jì)80年代才開始懂得如何在飼料工業(yè)中發(fā)揮酶的力量。飼料谷物，如小麥和大麥都含有比較高的單胃動物不能利用的纖維。如果纖維能夠被降解，動物就能更好地利用營養(yǎng)物。在歐洲，大麥比較便宜，禽類營養(yǎng)學(xué)家和酶學(xué)家投入了大量精力研究了在含有大麥的肉雞日糧中添加β—葡聚糖酶以減少其負(fù)面影響的可能性。其結(jié)果被證明是成功的，并得到了一個黃金定律:大麥+β—葡聚糖酶=小麥。受到上述成功的鼓舞，小麥?zhǔn)堑诙€的研究對象。理論假設(shè)是:小麥+木聚糖酶=玉米。這一步的研究也獲得了成功。在20世紀(jì)90年代中期，酶在飼料工業(yè)得到了普遍認(rèn)可?？梢院敛豢鋸埖卣f:1996年，在歐洲80%的肉雞料(粘性谷物為能量來源)中含有纖維降解酶。由此強(qiáng)化和加快飼料產(chǎn)業(yè)對新技術(shù)的應(yīng)用。從全球范圍來看，大約65%的含有能產(chǎn)生粘性谷物的家禽飼料添加了 纖維降解酶。而在豬飼料中的應(yīng)用比例要低得多，接近10%。其主要原因是市場的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，市場呈多元化，甚至無法測算。從地理分布來看，使用纖維素降解酶的地區(qū)主要集中在粘性谷物作為主要能量飼料的產(chǎn)區(qū)，例如:歐洲、加拿大、澳大利亞和新西蘭。另外，在美國、南美和亞太地區(qū)，使用情況取決于玉米和小麥之間的比價。從這個意義上講，歐洲是使用降解纖維素酶的核心細(xì)分市場。為了獲得全球的認(rèn)可，飼用酶廠家必須大舉進(jìn)軍以玉米一豆柏型日糧為主的北美和亞太地區(qū)。玉米一豆柏型日糧歷來被看作是“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，盡管許多營養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為這些原料的變動性要比原來設(shè)想的變動性要大得多?，F(xiàn)在，越來越多的證據(jù)表明這種黃金日糧也可以通過酶而改善其生產(chǎn)性能，盡管這類日糧與粗纖維或粘度相關(guān)的問題不嚴(yán)重。過去10年在研發(fā)玉米-豆柏第一代飼料酶上耗費(fèi)很多，并于1996年開始成功應(yīng)用，初期應(yīng)用結(jié)果五花八門，但業(yè)界正開始變得越來越明白如何才能得心應(yīng)手，加酶技術(shù)獲得最大經(jīng)濟(jì)回報(bào)。據(jù)估算，該部分飼料酶市場份額為2千萬美元，實(shí)際在使用玉米-豆柏日糧的肉雞飼料只有5%為加酶飼料。1999/2000年一降低粘度和粗纖維為日糧的飼料酶市場價值超過I億美元。目前，植酸酶已經(jīng)得到了全球的承認(rèn)和應(yīng)用。植酸酶的市場份額大約是每年5000萬美元，在全球約有8.0%左右的豬禽飼料添加植酸酶。除了經(jīng)濟(jì)利益的原因外，還有一個因素是減少了糞中植酸磷的含量有利于保護(hù)環(huán)境。
[0009]綜上所述，生長豬專用酶的應(yīng)用有著其廣闊的市場空間和巨大的經(jīng)濟(jì)價值，但生長豬專用酶的熱穩(wěn)定性、安全性、復(fù)配全面性及作用效果的充分發(fā)揮仍是酶制劑生產(chǎn)廠家和廣大養(yǎng)殖戶共同關(guān)注的一個重要問題，制備更安全，更全面，酶作用效果更好的生長豬專用酶是本行業(yè)技術(shù)人員的共同責(zé)任和追求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是以含強(qiáng)熱穩(wěn)定性和PH穩(wěn)定性的飼用復(fù)合酶的黑曲霉培養(yǎng)物為基礎(chǔ)，并科學(xué)復(fù)配中草藥提取物、保護(hù)劑、激活劑和其它食品級飼料酶，制得的飼料復(fù)合酶不但為飼養(yǎng)畜禽提供了安全、全面的消化酶，減輕消化負(fù)擔(dān)，提高原料利用率和生長率，有效保護(hù)環(huán)境，同時適量的激活劑可在同等條件下充分發(fā)揮酶制劑的效力，物盡其用，節(jié)約酶制劑添加量，中草藥提取物的科學(xué)復(fù)配既可延長復(fù)合酶制劑的保質(zhì)期，又可提高飼養(yǎng)畜禽的免疫力，從而達(dá)到一酶多用的效果。
[0011]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0012]一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶，由以下重量份數(shù)的原料組成:
[0013]黑曲霉培養(yǎng)物30-50份，酸性木聚糖酶30-50份，植酸酶20-30份，β -葡聚糖酶15-20份，纖維素酶15-20份，淀粉酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，中草藥提取物10-15份，保護(hù)劑10-15份，激活劑10-15份。
[0014]所述酸性木聚糖酶、植酸酶、β -葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均為食品級酶制劑；
[0015]所述黑曲霉培養(yǎng)物中主要包括飼用酶和黑曲霉菌體。
[0016]所述黑曲霉培養(yǎng)物發(fā)酵液粗酶液中含有多種飼用酶，其中，蛋白酶活力6500-6700U/ml、甘露聚糖酶活力1500_1700U/ml、α -半乳糖酶活力1200_1300U/ml、果膠酶活力1000-1200U/ml。對發(fā)酵液粗酶`液進(jìn)行酶的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)和pH穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明:在30-75°C，pH值2-7時各酶均有較高的酶活力，達(dá)到80%以上。
[0017]所述黑曲霉菌體在生長和發(fā)酵過程中能夠抑制致病性大腸桿菌的生長；抑制黃曲霉生長和繁殖、分解黃曲霉毒素；促進(jìn)動物生長、調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡、提高整體免疫力。
[0018]所述黑曲霉培養(yǎng)物的制備方法如下:將保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌種經(jīng)菌種活化和一級、二級、三級及種子罐液體種子逐級擴(kuò)大培養(yǎng)得到液體種子，以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度28-30°C，攪拌速度200-700r/m，通風(fēng)量(V/V)l:l-3，培養(yǎng)時間10_15h ；然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-33°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經(jīng)離心分離得到黑曲霉?jié)窬w和離心液，離心液于10-20°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量20-40%濃縮液，濃縮液與黑曲霉?jié)窬w以質(zhì)量比1-10:1均勻混合，然后經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得黑曲霉培養(yǎng)物。
[0019]所述斜面培養(yǎng)基組成為:干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.Sg，硫酸亞鐵0.02g，葡萄糖20g，瓊脂20g,中草藥粉劑5-20g,蒸餾水lOOOmL，pH值5.8，121°C滅菌 20min。
[0020]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0021]稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0022]所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1-1.5。
[0023]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基組成為:磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀
0.8g,硫酸亞鐵0.02g,葡萄糖20g,中草藥粉劑15-25g,海藻糖10_30g,蒸懼水1000mL, pH值 5.5，121°C 滅菌 20min。
[0024]所述種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麩皮10_15g，魚粉10-15g，氯化鈣6-10g，氯化銨l_3g，磷酸氫二鈉l_2g，中草藥粉劑15_20g，海藻糖10_30g，純凈水 lOOOmL，pH 值 5-7，121°C滅菌 20min。
[0025]所述種子罐發(fā)酵液孢子濃度為?.0x108-8.0xlO8個/ml ；
[0026]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麩皮10_15g，魚粉10_15g，氯化鈣6-10g，氯化銨l_3g，磷酸氫二鈉l-2g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖10_30g，純凈水1000mL, pH 值 5-7,121°C滅菌 20min。
[0027]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15_25%，魚粉
1.0-1.5%，氯化鈣0.6-1.0%，氯化銨0.1-0.3%，磷酸氫二鈉0.1-0.2%，中草藥粉劑5-10%,不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值5-7，121-123°C滅菌30_40min。
[0028]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然后降溫至45-60°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5.5-6.8，酶解2_4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物。
[0029]所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘20-30份，決明子20-30份，枸杞10_15份，山藥10-15份，北沙參5-10份，黃荊子5-10份，玉竹3-5份，薏米3_5份，大麥芽3_5份，桂花3-5份，黃芪3-5份；
[0030]混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；
[0031]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β-葡聚糖酶10-20份，外β-葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；
[0032]所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4)2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份。
[0033]所述激活劑是由如下質(zhì)量份數(shù)的無機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅30-40份，氯化鈣10-20份，硫酸鈉10-20份，氯化鎂5-10份。
[0034]本發(fā)明生長豬專用酶的制備方法:
[0035]將所述保護(hù)劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小于所述酸性木聚糖酶及其它原料，然后與黑曲霉培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、植酸酶、β_葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均勻混合，最后加入激活劑，混合均勻后密封包裝即得成品生長豬專用酶。
[0036]所述生長豬專 用酶適用于飼料加工廠和養(yǎng)殖場自配飼料，使用時應(yīng)與飼料中的其它原料混合均勻，可事先將本發(fā)明與少量飼料混合均勻，再混合到大批飼料中，直接飼喂。建議每噸全價料添加量為:100-150g。
[0037]本發(fā)明的高產(chǎn)飼用復(fù)合酶的黑曲霉菌株具體為黑曲霉(Aspergillus niger)DM-18，是從湖南省津市市洋由鄉(xiāng)腐質(zhì)土、稻草混合樣分離得到的野生菌HYX0022經(jīng)經(jīng)紫外誘變、紫外亞硝酸誘變、紫外線亞硝基胍復(fù)合誘變，然后對突變株逐級篩選淘汰，最后對優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測試篩選得到產(chǎn)飼用復(fù)合酶的黑曲霉DM-18。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院郵編:430072)，保藏號為CCTCC NO:M2013541，分類命名為黑曲霉(Aspergillus niger) DM-18。[0038]本發(fā)明提供的高產(chǎn)飼用復(fù)合酶的黑曲霉DM-18具有以下微生物學(xué)特征:
[0039]1、形態(tài)學(xué)特征:
[0040]黑曲霉DM-18，生物學(xué)形態(tài)為包括分生孢子、胞梗、頂囊、產(chǎn)胞結(jié)構(gòu)等幾部分。分生孢子頭球形至福射形，直徑150-450 μ m,分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)。胞梗莖1000-3000(長度)X 12-20 (直徑)μ m，黃色或黃褐色，壁平滑；頂囊球形或近似球形，直徑35-50 μ m,表面全面可育；產(chǎn)胞結(jié)構(gòu)雙層，梗基15-20(長度)X3-4.0(直徑)μπι，瓶梗6-8(長度)X 2-4 (直徑)μ m，分生孢子球形或近球形，較小，直徑3.5-5.0 μ m，褐色，壁粗糙。
[0041]2、培養(yǎng)學(xué)特征:
[0042]黑曲霉DM-18在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長迅速，280C 4天直徑65mm ;質(zhì)地絲絨狀或稍帶絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，褐黑色，有少量滲出液；菌落反面略帶黃色。
[0043]3、生理生化特征:
[0044]黑曲霉DM-18可在馬鈴薯、玉米粉、可溶性淀粉，糖蜜等上生長，最適PH值4.6，最適生長溫度28-34°C，最適產(chǎn)酶溫度28-30°C。
[0045]黑曲霉DM-18的篩選技術(shù)路線為:原始菌株分離、篩選與鑒定一出發(fā)菌株一斜面培養(yǎng)一孢子懸液的制備一誘變處理一平板分離一初篩一復(fù)篩一再復(fù)篩一擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)(發(fā)酵性能測定)。
[0046]有益效果:
[0047]1.本發(fā)明黑曲霉培養(yǎng)物中黑曲霉菌體在生長和發(fā)酵過程中能夠抑制致病性大腸桿菌的生長；抑制黃曲霉生長和繁殖、分解黃曲霉毒素；促進(jìn)動物生長、調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡、提高整體免疫力，特別適合生長豬飼料的添加。
[0048]2.本發(fā)明中的黑曲霉培養(yǎng)物以高產(chǎn)飼用復(fù)合酶的菌株黑曲霉DM-18為出發(fā)菌株，并進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝改進(jìn)，采用梯度降溫和梯度升溫的發(fā)酵工藝，同時予以追加接種和適時補(bǔ)料，尤其是梯度降溫和梯度升溫的發(fā)酵工藝顯著提高了出發(fā)菌株的抗應(yīng)激能力，致使菌種的產(chǎn)酶能力最大限度地顯現(xiàn)。并且本發(fā)明對培養(yǎng)基組成實(shí)施全程優(yōu)化，添加了具有抗熱應(yīng)激原作用的黃芩、柴胡，添加了具有調(diào)整和修復(fù)機(jī)體功能、增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能、具有微生態(tài)調(diào)節(jié)功能的黃芪、黨參等，進(jìn)一步增強(qiáng)了微生物在同一發(fā)酵環(huán)境下的機(jī)體功能性、傳代適應(yīng)性和共同協(xié)作性，進(jìn)而增強(qiáng)了微生物的代謝功能，使得本發(fā)明所產(chǎn)飼用復(fù)配酶活力高、耐受溫度較高、穩(wěn)定性強(qiáng)、適于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0049]3.本發(fā)明黑曲霉培養(yǎng)物發(fā)酵液粗酶液中含有多種酶活力，其中，蛋白酶活力6500-6700U/ml、甘露聚糖酶活力1500_1700U/ml、α -半乳糖酶活力1200_1300U/ml、果膠酶活力1000-1200U/ml。對發(fā)酵液粗酶液進(jìn)行酶的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)和pH穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明:在30-75°C，pH值2-7時各酶均有較高的酶活力，達(dá)到80%以上。本發(fā)明飼用復(fù)合酶熱穩(wěn)定性和PH穩(wěn)定性強(qiáng)，更加適合飼料工業(yè)加工工藝需求，加工后的飼料酶活損失低。[0050]4.本發(fā)明生長豬專用酶中的保護(hù)劑采用多糖、無機(jī)鹽和氨基酸科學(xué)復(fù)配，有效減緩了復(fù)配原料的回潮；同時可增強(qiáng)復(fù)配酶的耐凍、耐熱性能，保持相同的酶活力，其耐熱溫度可提高20-30°C，耐冷凍溫度可降低10-15°C，有效防止了復(fù)配酶在運(yùn)輸、保存和使用過程中酶活力的損失，延長了復(fù)配酶的保質(zhì)期，達(dá)到同樣的酶活力，同類產(chǎn)品保質(zhì)期可延長
2-3 年。
[0051]5.本發(fā)明生長豬專用酶添加無機(jī)鹽作為激活劑，創(chuàng)造了酶催化作用的最佳條件，充分發(fā)揮了復(fù)配酶各酶組份的活力，徹底有效的分解了飼料中淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、植酸等大分子物質(zhì)，大大減輕了畜禽動物的消化負(fù)擔(dān)，提高了原料利用率和畜禽的生長率，同時有效防止了畜禽糞便造成的環(huán)境污染，保護(hù)了飼養(yǎng)環(huán)境。
[0052]6.本發(fā)明生長豬專用酶添加的中草藥提取物既可延長復(fù)配原料的保質(zhì)期，又可提高飼養(yǎng)畜禽的免疫力，有效防止畜禽流行性疾病的發(fā)生。
[0053]7.本發(fā)明生長豬專用酶中保護(hù)劑與酶制劑、激活劑與酶制劑、中草藥提取物與酶制劑的共同協(xié)同作用，使得復(fù)配酶的酶活力和效力最大限度的發(fā)揮，并相應(yīng)的提高了飼料的利用率和動物的生長率，增強(qiáng)了動物的食欲和抗病能力，延長了復(fù)配酶的保質(zhì)期和保護(hù)了環(huán)境。
【具體實(shí)施方式】
[0054]下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0055]實(shí)施例1
[0056]一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶，由以下重量份數(shù)的原料組成:
[0057]黑曲霉培養(yǎng)物40份，酸性木聚糖酶40份，植酸酶25份，β -葡聚糖酶17份，纖維素酶17份，淀粉酶12份，酸性蛋白酶12份，中草藥提取物12份，保護(hù)劑13份，激活劑12份。
[0058]所述酸性木聚糖酶、植酸酶、β -葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均為食品級酶制劑；
[0059]所述黑曲霉培養(yǎng)物制備方法包括如下步驟:
[0060](I)菌種活化
[0061]將保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)36h進(jìn)行菌種活化，如此活化2次；
[0062]所述斜面培養(yǎng)基組成為:干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.Sg，硫酸亞鐵0.02g，葡萄糖20g，瓊脂20g,中草藥粉劑5g,蒸餾水1000mL, pH值5.8，121°C滅菌20min ；[0063]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0064]稱取黃芪20份；黨參10份；柴胡10份；黃芩10份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C保持3h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0065]所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1。
[0066](2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0067]①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的宇佐美曲霉斜面菌種以無菌水洗下孢子，接入500毫升搖瓶中，液體種子培養(yǎng)基裝量100毫升，28°C、80rpm搖床培養(yǎng)36h ；
[0068]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0069]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以8%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，液體培養(yǎng)基裝量1000毫升，28°C、80rpm搖床培養(yǎng)36h ；
[0070]④種子罐培養(yǎng):將三級種子以8%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐，種子罐培養(yǎng)基裝量100L，控制pH值為5，培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度200rpm，通風(fēng)量(V/V)l: 0.8，培養(yǎng)時間36h，溶解氧10% ；
[0071]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基組成為:磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀
0.8g,硫酸亞鐵0.02g,葡萄糖20g,中草藥粉劑15g,海藻糖IOg,蒸懼水lOOOmL, pH值5.5,121°C 滅菌 20min。
[0072]所述種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麩皮10_15g，魚粉10g，氯化鈣6g,氯化銨Ig,磷酸氫二鈉Ig,中草藥粉劑15g,海藻糖IOg,純凈水lOOOmL, pH值5,121°C 滅菌 20min。
[0073]所述種子罐發(fā)酵液孢子濃度為7.0xlO8個/ml ；
[0074](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0075]將步驟(2)中種子罐液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度200r/m，通風(fēng)量(V/V)l:l，培養(yǎng)時間IOh ;然后以1°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h降溫速率緩慢降溫至2°C，此時，將步驟(2)中種子罐液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20h ;最后以1°C /h升溫速率緩慢升溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恒溫培養(yǎng)15h ；
[0076]溶解氧控制:通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量，控制溶解氧15% ；
[0077]pH控制:通過補(bǔ)氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在5 ；
[0078]補(bǔ)料控制:當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時,開始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0079]放罐標(biāo)準(zhǔn):60%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0080]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉50g，豆粉15g，麩皮10g，魚粉10g，氯化鈣6g，氯化銨lg，磷酸氫二鈉Ig,中草藥粉劑30g，海藻糖10g，純凈水lOOOmL, pH值5，121°C滅菌20mino
[0081]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，魚粉1.0%，氯化鈣0.6%，氯化銨0.1%，磷·酸氫二鈉0.1%，中草藥粉劑5%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值5，121°C 滅菌 30min。
[0082](4)發(fā)酵液經(jīng)離心分離得到黑曲霉?jié)窬w和離心液，離心液于15°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量30%濃縮液，濃縮液與黑曲霉?jié)窬w以質(zhì)量比5:1均勻混合，然后經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得黑曲霉培養(yǎng)物。
[0083]上述制備方法中發(fā)酵液粗酶液中含有多種酶活力，其中，蛋白酶活力6500U/ml、甘露聚糖酶活力1500U/ml、α-半乳糖酶活力1200U/ml、果膠酶活力1000U/ml。
[0084]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至53°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)PH值為6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至69°C保持4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物。
[0085]所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘25份，決明子25份，枸杞17份，山藥13份，北沙參8份，黃荊子7份，玉竹4份，薏米4份，大麥芽4份，桂花4份，黃芪4份；
[0086]混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；
[0087]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶15份,外β -葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶13份，木聚糖酶13份，戊聚糖酶13份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份，中性蛋白酶13份，酸性蛋白酶13份，超氧化物歧化酶7份，葡萄糖氧化酶7份，酸性磷酸酶7份；
[0088]所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖25份，NaC125份，(NH4) 2S0413份，半胱氨酸12份。
[0089]所述激活劑是由如下質(zhì)量份數(shù)的無機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅35份，氯化鈣15份，硫酸鈉15份，氯化鎂7份。`
[0090]本發(fā)明生長豬專用酶的制備方法:
[0091]將所述保護(hù)劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小于所述酸性木聚糖酶及其它原料，然后與黑曲霉培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、植酸酶、β_葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均勻混合，最后加入激活劑，混合均勻后密封包裝即得成品生長豬專用酶。
[0092]實(shí)施例2
[0093]一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶，由以下重量份數(shù)的原料組成:
[0094]飼用復(fù)合酶30份，酸性木聚糖酶30份，植酸酶20份，β -葡聚糖酶15份，纖維素酶15份，淀粉酶10份，酸性蛋白酶10份，中草藥提取物10份，保護(hù)劑10份，激活劑10份。
[0095]所述酸性木聚糖酶、植酸酶、β -葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均為食品級酶制劑；
[0096]所述黑曲霉培養(yǎng)物制備方法包括如下步驟:
[0097](I)菌種活化
[0098]將保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，34°C培養(yǎng)48h進(jìn)行菌種活化，如此活化4次；
[0099]所述斜面培養(yǎng)基組成為:干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.Sg，硫酸亞鐵0.02g，葡萄糖20g，瓊脂20g，中草藥粉劑20g，蒸餾水lOOOmL，pH值5.8，121 °C滅菌20mino[0100]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0101]稱取黃芪30份；黨參18份；柴胡15份；黃芩15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加6倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至78°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0102]所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1.5。
[0103](2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0104]①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的斜面菌種以無菌水洗下孢子，接入500毫升搖瓶中，液體種子培養(yǎng)基裝量100毫升，34°c、120rpm搖床培養(yǎng)48h ；
[0105]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0106]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以8%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，液體培養(yǎng)基裝量1000毫升，340C、120rpm搖床培養(yǎng)48h ；
[0107]④種子罐培養(yǎng):將三級種子以8%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐，種子罐培養(yǎng)基裝量100L，控制pH值為5-7，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度400rpm，通風(fēng)量(V/V) 1:1.2,培養(yǎng)時間48h，溶解氧20%;
[0108]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基組成為:磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀
0.8g,硫酸亞鐵0.02g,葡萄糖20g,中草藥粉劑25g,海藻糖30g,蒸懼水lOOOmL, pH值5.5,121°C 滅菌 20min。
[0109]所述種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉60g，豆粉25g，麩皮15g，魚粉15g，氯化鈣10g，氯化銨3g，磷酸氫二鈉2g，中草藥粉劑20g，海藻糖30g，純凈水lOOOmL，pH值7，121°C滅菌20mino
[0110]所述種子罐發(fā)酵液孢子濃度為8.0xlO8個/ml ；
[0111](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0112]將步驟(2)中種子罐液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度700r/m，通風(fēng)量(V/V)l:3，培養(yǎng)時間15h ;然后以2V /h降溫速率緩慢降溫至15°C，恒溫培養(yǎng)20h ;繼續(xù)以2°C /h降溫速率緩慢降溫至5°C，此時，將步驟(2)中種子罐液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)30h ;最后以2V /h升溫速率緩慢升溫至15°C，恒溫培養(yǎng)20h ;繼續(xù)以2V /h升溫速率緩慢升溫至34°C，恒溫培養(yǎng)20h ；
[0113]溶解氧控制:通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量，控制溶解氧30% ；
[0114]pH控制:通過補(bǔ)氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在6 ；
[0115]補(bǔ)料控制:當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時，開始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0116]放罐標(biāo)準(zhǔn):80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0117]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉60g，豆粉25g，麩皮15g，魚粉15g，氯化鈣10g，氯化銨3g，磷酸氫二鈉2g，中草藥粉劑50g，海藻糖30g，純凈水lOOOmL，pH值7，121°C滅菌20mino
[0118]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精30%，玉米粉20%，豆粉25%，魚粉1.5%，氯化鈣1.0%，氯化銨0.3%，磷酸氫二鈉0.2%，中草藥粉10%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7，123°C滅菌40min。
[0119](4)發(fā)酵液經(jīng)離心分離得到黑曲霉?jié)窬w和離心液，離心液于10°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量20%濃縮液，濃縮液與黑曲霉?jié)窬w以質(zhì)量比1:1均勻混合，然后經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得黑曲霉培養(yǎng)物。
[0120]上述制備方法中發(fā)酵液粗酶液中含有多種酶活力，其中，蛋白酶活力6600U/ml、甘露聚糖酶活力1600U/ml、α-半乳糖酶活力1240U/ml、果膠酶活力1080U/ml。
[0121]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，然后降溫至45°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C保持3h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物。
[0122]所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘20份，決明子20份，枸杞10份，山藥10份，北沙參5份，黃荊子5份，玉竹3份，薏米3份，大麥芽3份，桂花3份，黃芪3份；
[0123]混合酶添加量為混合物料總重量的5% ；
[0124]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)葡聚糖酶10份，外β-葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普魯蘭酶20份，β -淀粉酶10份，中性蛋白酶10份,酸性蛋白酶10份,超氧化物歧化酶5份,葡萄糖氧化酶5份,酸性磷酸酶5份；
[0125]所述保護(hù)劑由 以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖20份，NaC120份，(NH4) 2S0410份，半胱氨酸10份。
[0126]所述激活劑是由如下質(zhì)量份數(shù)的無機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅30份，氯化鈣10份，硫酸鈉10份，氯化鎂5份。
[0127]本發(fā)明生長豬專用酶的制備方法如實(shí)施例1。
[0128]實(shí)施例3
[0129]一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶，由以下重量份數(shù)的原料組成:
[0130]飼用復(fù)合酶50份，酸性木聚糖酶50份，植酸酶30份，β -葡聚糖酶20份，纖維素酶20份，淀粉酶15份，酸性蛋白酶15份，中草藥提取物15份，保護(hù)劑15份，激活劑15份。
[0131]所述酸性木聚糖酶、植酸酶、β -葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均為食品級酶制劑；
[0132]所述黑曲霉培養(yǎng)物制備方法包括如下步驟:
[0133](I)菌種活化
[0134]將保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)42h進(jìn)行菌種活化，如此活化3次；
[0135]所述斜面培養(yǎng)基組成為:干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.Sg，硫酸亞鐵0.02g，葡萄糖20g，瓊脂20g,中草藥粉劑12g,蒸餾水lOOOmL，pH值5.8，121°C滅菌20mino
[0136]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0137]稱取黃芪25份；黨參15份；柴胡12份；黃芩12份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至70°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0138]所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1.2。
[0139](2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0140]①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的斜面菌種以無菌水洗下孢子，接入500毫升搖瓶中，液體種子培養(yǎng)基裝量100毫升，30°c、IOOrpm搖床培養(yǎng)42h ；
[0141]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0142]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以8%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，液體培養(yǎng)基裝量1000毫升，300C、IOOrpm搖床培養(yǎng)42h ；
[0143]④種子罐培養(yǎng):將三級種子以8%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐，種子罐培養(yǎng)基裝量100L，控制pH值為6，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度300rpm，通風(fēng)量(V/V)l:1,培養(yǎng)時間42h，溶解氧20%;
[0144]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基組成為:磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀
0.8g,硫酸亞鐵0.02g,葡萄糖20g,中草藥粉劑20g,海藻糖20g,蒸懼水lOOOmL, pH值5.5,121°C 滅菌 20min。
[0145]所述種子罐培養(yǎng) 基組成為:玉米粉55g，豆粉20g，麩皮12g，魚粉12g，氯化鈣Sg，氯化銨2g，磷酸氫二鈉2g，中草藥粉劑18g，海藻糖20g，純凈水lOOOmL，pH值6，121°C滅菌20mino
[0146]所述種子罐發(fā)酵液孢子濃度為7.5xl08個/ml ；
[0147](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0148]將步驟(2)中種子罐液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度350r/m，通風(fēng)量(V/V)l:2，培養(yǎng)時間12h ;然后以2V /h降溫速率緩慢降溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2°C /h降溫速率緩慢降溫至4°C，此時，將步驟(2)中種子罐液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)25h ;最后以2V /h升溫速率緩慢升溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2V /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恒溫培養(yǎng)18h ；
[0149]溶解氧控制:通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量，控制溶解氧20% ；
[0150]pH控制:通過補(bǔ)氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在5.2 ；
[0151]補(bǔ)料控制:當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時，開始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0152]放罐標(biāo)準(zhǔn):70%菌體衰老自溶,酶活力增長緩慢。
[0153]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉55g，豆粉20g，麩皮12g，魚粉12g，氯化鈣Sg，氯化銨2g，磷酸氫二鈉2g，中草藥粉劑40g，海藻糖20g，純凈水lOOOmL，pH值6，121°C滅菌20mino
[0154]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉18%，魚粉1.2%，氯化鈣0.8%，氯化銨0.2%，磷酸氫二鈉0.2%，中草藥粉劑8%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值6，123°C滅菌 40min。
[0155](4)發(fā)酵液經(jīng)離心分離得到黑曲霉?jié)窬w和離心液，離心液于20°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量40%濃縮液，濃縮液與黑曲霉?jié)窬w以質(zhì)量比10:1均勻混合，然后經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得黑曲霉培養(yǎng)物。
[0156]上述制備方法中發(fā)酵液粗酶液中含有多種酶活力，其中，蛋白酶活力6700U/ml、甘露聚糖酶活力1700U/ml、α-半乳糖酶活力1300U/ml、果膠酶活力1200U/ml。
[0157]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加6倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，然后降溫至60°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至78°C保持4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物。
[0158]所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘30份，決明子30份，枸杞15份，山藥15份，北沙參10份，黃荊子10份，玉竹5份，薏米5份，大麥芽5份，桂花5份，黃芪5份；
[0159]混合酶添加量為混合物料總重量的10%;
[0160]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普魯蘭酶30份，β -淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份；
[0161]所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖30份，NaC130份，(NH4) 2S0415份，半胱氨酸15份。
[0162]所述激活劑是由如下質(zhì)量份數(shù)的無機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅40份，氯化鈣20份，硫酸鈉20份，氯化鎂10份。
[0163]本發(fā)明生長豬專用酶的制備方法如實(shí)施例1。
[0164]實(shí)施例4飼用復(fù)合酶的熱穩(wěn)定性分析
[0165]對飼用復(fù)合酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，將實(shí)施例3發(fā)酵液粗酶液分別置于30°C、40°C、45 °C、50°C、55 °C、60°C、65 °C、70°C、75 °C下，每隔IO分鐘取樣測定飼用復(fù)合酶中各組成酶的酶活。30°C、40 V、45°C、50°C下，60分鐘各組成酶酶活沒有下降。55°C、60°C與65°C下，30分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的95%，60分鐘各組成酶酶活降到85%。70°C下，30分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的90%，60分鐘各組成酶酶活降到85%。75°C下，30分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的85%，60分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的80%，與現(xiàn)有技術(shù)相比，同樣條件下達(dá)到同樣酶活耐受溫度平均提高了 5-10°C。
[0166]實(shí)施例5飼用復(fù)合酶的pH穩(wěn)定性分析
[0167]對飼用復(fù)合酶酶的pH穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，將實(shí)施例3發(fā)酵液粗酶液分別置于pH值2.0,2.5,3.5,4.5,5.5,6.0,6.5,7.0下，每隔10分鐘取樣測定飼用復(fù)合酶中各組成酶的酶活。粗酶液PH值5.5,6.0,6.5、7.0下，60分鐘各組成酶酶活沒有下降。pH值4.5、3.5下，30分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的95%，60分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的85%。pH值2.5下，30分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的90%，60分鐘降到原有酶活的85%。pH值
2.0下，30分鐘各組成酶酶活降到原有酶活的85%，60分鐘降到原有酶活的80%，與現(xiàn)有技術(shù)相比，同樣條件下達(dá)到同樣酶活耐PH值較寬泛。
[0168]實(shí)施例6本發(fā)明實(shí)施例1生長豬專用酶的使用效果試驗(yàn)
[0169]1.飼料種類:全價國標(biāo)生長豬飼料；
[0170]2.生長豬專用酶添加量:每噸飼料添加100g ;[0171]3.生長豬專用酶試驗(yàn)組設(shè)計(jì):生長豬專用酶重量份數(shù)組成分為試驗(yàn)組、對照組1、對照組2 ;其中試驗(yàn)組為本發(fā)明實(shí)施例1制備的生長豬專用酶；對照組I為試驗(yàn)組組份中除了枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的其余組份；對照組2是市售的生長豬專用酶并且其包含的各酶種類、酶活力和酶重量份數(shù)與試驗(yàn)組和對照組I相同；各試驗(yàn)組的具體重量份數(shù)組成如表1
[0172]表1
[0173]
【權(quán)利要求】
1.一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶，由以下重量份數(shù)的原料組成:黑曲霉培養(yǎng)物30-50份，酸性木聚糖酶30-50份，植酸酶20-30份，β -葡聚糖酶15-20份，纖維素酶15-20份，淀粉酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，中草藥提取物10-15份，保護(hù)劑10-15份，激活劑10-15份； 所述黑曲霉培養(yǎng)物的制備方法如下:將保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌種經(jīng)菌種活化和一級、二級、三級及種子罐液體種子逐級擴(kuò)大培養(yǎng)得到液體種子，以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度28-30°C，攪拌速度200-700r/m，通風(fēng)量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時間10_15h ;然后以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-33°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經(jīng)離心分離得到黑曲霉?jié)窬w和離心液，離心液于10-20°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量20-40%濃縮液，濃縮液與黑曲霉?jié)窬w以質(zhì)量比1-10:1均勻混合，然后經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得黑曲霉培養(yǎng)物； 所述黑曲霉DM-18已于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2013541 ； 所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4) 2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份； 所述激活劑是由如下質(zhì)量份數(shù)的無機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅30-40份，氯化鈣10-20份，硫酸鈉10-20份，氯化鎂5-10份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶，其特征在于，所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然后降溫至45_60°C，加入混合物料總重量5-10%的混合酶制`劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5.5-6.8，酶解2_4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物； 所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘20-30份，決明子20-30份，枸杞10-15份，山藥10-15份，北沙參5-10份，黃荊子5-10份，玉竹3-5份，薏米3_5份，大麥芽3_5份，桂花3_5份，黃芪3-5份； 所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶，其特征在于，制備黑曲霉培養(yǎng)物的斜面培養(yǎng)基組成為:干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.Sg，硫酸亞鐵0.02g，葡萄糖20g，瓊脂20g,中草藥粉劑5-20g,蒸餾水1000mL，pH值5.8，121 °C滅菌20mino
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶，其特征在于，制備黑曲霉培養(yǎng)物的種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麩皮10-15g，魚粉10_15g，氯化鈣6-10g，氯化銨l_3g，磷酸氫二鈉l-2g，中草藥粉劑15-20g，海藻糖10_30g，純凈水1000mL, pH 值 5-7,121°C滅菌 20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶，其特征在于，制備黑曲霉培養(yǎng)物時種子罐發(fā)酵液孢子濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶，其特征在于，制備黑曲霉培養(yǎng)物的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麩皮10-15g，魚粉10_15g，氯化鈣6-10g，氯化銨l_3g，磷酸氫二鈉l-2g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖10_30g，純凈水1000mL, pH 值 5-7,121°C滅菌 20min。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一所述的一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶，其特征在于，所述中草藥粉劑的制備方法如下:稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇的質(zhì)量比為1:1-1.5，控制溫度至60V~78°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
8.一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶的制備方法，其特征在于，將保護(hù)劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小于所述酸性木聚糖酶及其它原料，然后與黑曲霉培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均勻混合，最后加入激活劑，混合均勻后密封包裝即得成品生長豬專用酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶的制備方法，其特征在于，所述生長豬專用酶由以下重量份數(shù)的原料組成:黑曲霉培養(yǎng)物30-50份，酸性木聚糖酶30-50份，植酸酶20-30份，β -葡聚糖酶15-20份，纖維素酶15-20份，淀粉酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，中草藥提 取物10-15份，保護(hù)劑10-15份，激活劑10-15份； 所述黑曲霉培養(yǎng)物的制備方法如下:將保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌種經(jīng)菌種活化和一級、二級、三級及種子罐液體種子逐級擴(kuò)大培養(yǎng)得到液體種子，以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度28-30°C，攪拌速度200-700r/m，通風(fēng)量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時間10_15h ;然后以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-33°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經(jīng)離心分離得到黑曲霉?jié)窬w和離心液，離心液于10-20°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量20-40%濃縮液，濃縮液與黑曲霉?jié)窬w以質(zhì)量比1-10:1均勻混合，然后經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得黑曲霉培養(yǎng)物； 所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4) 2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份； 所述激活劑是由如下質(zhì)量份數(shù)的無機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅30-40份，氯化鈣10-20份，硫酸鈉10-20份，氯化鎂5-10份。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶的制備方法，其特征在于，所述含飼用復(fù)合酶的生長豬專用酶由以下重量份數(shù)的原料組成:黑曲霉培養(yǎng)物40份，酸性木聚糖酶40份，植酸酶25份，β -葡聚糖酶17份，纖維素酶17份，淀粉酶12份，酸性蛋白酶12份，中草藥提取物12份，保護(hù)劑13份，激活劑12份； 所述黑曲霉培養(yǎng)物制備方法包括如下步驟:(1)菌種活化 將保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)36h進(jìn)行菌種活化,如此活化2次； 所述斜面培養(yǎng)基組成為:干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.Sg,硫酸亞鐵0.02g,葡萄糖20g,瓊脂20g,中草藥粉劑5g,蒸餾水1000mL, pH值5.8，121 °C滅菌20min ； 所述中草藥粉劑的制備方法如下: 稱取黃芪20份；黨參10份；柴胡10份；黃芩10份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C保持3h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑； 所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1; (2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng) ①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的宇佐美曲霉斜面菌種以無菌水洗下孢子，接入500毫升搖瓶中，液體種子培養(yǎng)基裝量100毫升，28°C、80rpm搖床培養(yǎng)36h ； ②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同； ③三級種子培養(yǎng):將二級種子以8%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，液體培養(yǎng)基裝量1000毫升，28°C、80rpm`搖床培養(yǎng)36h ； ④種子罐培養(yǎng):將三級種子以8%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐，種子罐培養(yǎng)基裝量100L，控制pH值為5，培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度200rpm，通風(fēng)量(V/V)l: 0.8，培養(yǎng)時間36h,溶解氧10% ； 所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基組成為:磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.Sg，硫酸亞鐵0.02g,葡萄糖20g,中草藥粉劑15g,海藻糖IOg,蒸餾水1000mL, pH值5.5，121。。滅菌20min ； 所述種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麩皮10-15g，魚粉10g，氯化鈣6g，氯化銨lg，磷酸氫二鈉lg，中草藥粉劑15g，海藻糖10g，純凈水lOOOmL，pH值5，121°C滅菌20min ； 所述種子罐發(fā)酵液孢子濃度為7.0xlO8個/ml ； (3)發(fā)酵罐發(fā)酵 將步驟(2)中種子罐液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度200r/m，通風(fēng)量(V/V)l: 1，培養(yǎng)時間IOh ;然后以1°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ；繼續(xù)以1°C /h降溫速率緩慢降溫至2°C，此時，將步驟(2)中種子罐液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20h ;最后以1°C /h升溫速率緩慢升溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恒溫培養(yǎng)15h ； 溶解氧控制:通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量，控制溶解氧15% ； pH控制:通過補(bǔ)氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在5 ； 補(bǔ)料控制:當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時,開始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基,補(bǔ)料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；放罐標(biāo)準(zhǔn):60%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉50g，豆粉15g，麩皮10g，魚粉10g，氯化鈣6g，氯化銨lg，磷酸氫二鈉lg，中草藥粉劑30g，海藻糖10g，純凈水10001^，？!1值5，1211:滅菌20min ；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，魚粉1.0%，氯化鈣0.6%，氯化銨0.1%，磷酸氫二鈉0.1%，中草藥粉劑5%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值5，121°C滅菌30min ； (4)發(fā)酵液經(jīng)離心分離得到黑曲霉?jié)窬w和離心液，離心液于15°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量30%濃縮液，濃縮液與黑曲霉?jié)窬w以質(zhì)量比5:1均勻混合，然后經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得黑曲霉培養(yǎng)物； 上述制備方法中發(fā)酵液粗酶液中含有多種酶活力，其中，蛋白酶活力6500U/ml、甘露聚糖酶活力1500U/ml、α-半乳糖酶活力1200U/ml、果膠酶活力1000U/ml ； 所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至53°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)PH值為6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至69°C保持4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物； 所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘25份，決明子25份，枸杞17份，山藥13份，北沙參8份，黃荊子7份，玉竹4份，薏米4份，大麥芽4份，桂花4份，黃芪4份； 混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶15份，外β -葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶13份，木聚糖酶13份，戊聚糖酶13份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份，中性蛋白酶13份，酸性蛋白酶13份，超氧化物歧化酶7份，葡萄糖氧化酶7份，酸性磷酸酶7份；所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖25份，NaC125份，(NH4) 2S0413份，半胱氨酸12份； 所述激活劑是由如下質(zhì)量份數(shù)的無機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅35份，氯化鈣15份，硫酸鈉15份，氯化鎂7份； 本發(fā)明生長豬專用酶的制備方法: 將所述保護(hù)劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小于所述酸性木聚糖酶及其它原料，然后與黑曲霉培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、植酸酶、β_葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均勻混合，最后加入激活劑，混合均勻后密封包裝即得成品生長豬專用酶。
【文檔編號】C12N9/42GK103667222SQ201310733013
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】李海清, 胡永明, 胡波, 樊淳紅, 辜承蘭 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司