人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞三維培養(yǎng)分化成神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)三維培養(yǎng)后分化成神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法，包括以下步驟：將三維材料在37℃聚膠30分鐘；再加入人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，于37℃，5%CO2培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液；所述聚膠溶液為I型膠原溶液、聚乳酸溶液或絲素蛋白溶液。本發(fā)明利用三維培養(yǎng)技術(shù)為神經(jīng)分化提供一種體內(nèi)樣的三維立體生長環(huán)境，促進(jìn)了細(xì)胞之間的聯(lián)系，使細(xì)胞形成多層生長，同時可以更好地維持干細(xì)胞的自我更新和多向分化特性；無化學(xué)誘導(dǎo)因子的作用，分化后神經(jīng)樣干細(xì)胞可直接用于后續(xù)臨床試驗(yàn)，更安全。
【專利說明】人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞三維培養(yǎng)分化成神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法，具體涉及一種無化學(xué)誘導(dǎo)因子的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)三維培養(yǎng)后分化為神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)樣干細(xì)胞(neural stem cell,NSCs)是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細(xì)胞，它可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞。長期以來，人們一直認(rèn)為成年哺乳動物腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞不具備更新能力，一旦受損乃至死亡不能再生。這種觀點(diǎn)使人們對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療受到了很大限制。雖然傳統(tǒng)的藥物、手術(shù)及康復(fù)治療取得了一定的進(jìn)展，但是仍不能達(dá)到滿意的效果。神經(jīng)樣干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，解決傳統(tǒng)藥物治療固有的缺點(diǎn)，神經(jīng)樣干細(xì)胞治療是把健康的干細(xì)胞移植到病人或自己體內(nèi)，以達(dá)到修復(fù)病變細(xì)胞或重建功能正常的細(xì)胞和組織的目的。該療法就像給機(jī)體注入新的活力，是從根本上治療許多疾病的有效方法。
[0003]三維培養(yǎng)指在一定的環(huán)境條件下，將細(xì)胞種植在三維支架中，構(gòu)建出具有特定形態(tài)和功能細(xì)胞的方法。三維球狀形態(tài)(或者克隆形態(tài))與干細(xì)胞特性密切相關(guān)，如胚胎干細(xì)胞在滋養(yǎng)層上以克隆形態(tài)生長，神經(jīng)樣干細(xì)胞以神經(jīng)球的形態(tài)生長；克隆形成實(shí)驗(yàn)是鑒定干細(xì)胞的重要手段，干細(xì)胞分化后失去克隆樣形態(tài)；多項(xiàng)研究也表明三維培養(yǎng)可以更好地維持干細(xì)胞的自我更新和多向分化特性。
[0004]目前，三維培養(yǎng)在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞或肝樣細(xì)胞等分化中有報道。但是，還沒有利用三維培養(yǎng)誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣干細(xì)胞的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種無化學(xué)誘導(dǎo)因子的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)三維培養(yǎng)后分化成神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目`的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。
[0006]人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)三維培養(yǎng)后分化成神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法，包括以下步驟:將三維材料在37°C聚膠30分鐘；再加入人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，于37°C，5%C02培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液；所述三維材料為I型膠原溶液、聚乳酸溶液或絲素蛋白溶液。所述三維材料25微升/孔，所述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞5 X IO5個細(xì)胞/孔。
[0007]優(yōu)選地，所述I型膠原溶液的濃度為3mg/mL。
[0008]優(yōu)選地，所述聚乳酸溶液的濃度為2.5mg/mL。
[0009]優(yōu)選地，所述絲素蛋白溶液的濃度為5mg/mL。
[0010]優(yōu)選地，培養(yǎng)時間為14天。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果顯著。
[0012]1、本發(fā)明無化學(xué)誘導(dǎo)因子的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)三維培養(yǎng)后分化成神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法，不依賴基因、RNA及蛋白的導(dǎo)入，更易于誘導(dǎo)分化成熟；無化學(xué)誘導(dǎo)因子的作用，分化后神經(jīng)樣干細(xì)胞可直接用于后續(xù)臨床試驗(yàn)，更安全；[0013]2、利用三維培養(yǎng)技術(shù)為神經(jīng)分化提供一種體內(nèi)樣的三維立體生長環(huán)境，促進(jìn)了細(xì)胞之間的聯(lián)系，使細(xì)胞形成多層生長，同時可以更好地維持干細(xì)胞的自我更新和多向分化特性；
[0014]3、脂肪來源的干細(xì)胞可跨胚層分化為神經(jīng)樣干細(xì)胞，無任何倫理問題，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)樣干細(xì)胞形態(tài)圖。左圖為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖，中圖為誘導(dǎo)分化7天后神經(jīng)樣干細(xì)胞形態(tài)圖，右圖為誘導(dǎo)分化14后神經(jīng)樣干細(xì)胞形態(tài)圖。
[0016]圖2為熒光定量PCR檢測基因相對表達(dá)水平圖。左側(cè)柱形圖表示對照人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)水平，中間柱形圖表示誘導(dǎo)分化7天后神經(jīng)樣干細(xì)胞的相對表達(dá)水平，右側(cè)柱形圖表示誘導(dǎo)分化14后神經(jīng)樣干細(xì)胞的相對表達(dá)水平。
【具體實(shí)施方式】
[0017]為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】做進(jìn)一步說明。本領(lǐng)域的公知常識、常用的物質(zhì)檢測、鑒定方法等，因是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，本發(fā)明未一一贅述。本發(fā)明中使用的各種試劑都是市售試劑。
[0018]實(shí)施例1
[0019](I)獲得離體人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0020]取5g脂肪組織，先用無菌的手術(shù)剪刀或者小刀剪碎，長度要求不大于3毫米，然后收集于15毫升離心管，加入等體積的磷酸鹽緩沖液，劇烈震蕩后室溫靜至5分鐘，等分為兩層后小心收集上層部分(包含有間充質(zhì)干`細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、磷酸鹽緩沖液及紅細(xì)胞)，去掉下層的油脂/脂質(zhì)，收集的上層部分采用磷酸鹽緩沖液洗滌3遍；加入等體積的0.075%的膠原酶I，37°C水浴30分鐘；加入等體積的含10%胎牛血清的DMEM終止消化，充分混均后室溫靜至10分鐘分層；去掉上層(脂質(zhì)/碎片)，200C，280g離心5min收集下層部分(基質(zhì)血管部分、干細(xì)胞、紅細(xì)胞)；紅細(xì)胞裂解，采用160mM NH4C1重懸3分鐘，40微米濾膜過濾到含5mL DMEM，10%FBS的管中；20°C，280g離心5min收集細(xì)胞，并于1%青霉素/鏈霉素、10%FBS的DMEM中培養(yǎng)，即獲得人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0021](2)誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣干細(xì)胞的分化。
[0022]I型膠原溶液的配制(3mg/mL):量取30mg的I型膠原，溶于無菌預(yù)冷的8mL，0.1MNaOH溶液，于冰上混勻，最后以無菌預(yù)冷的dH20定容為10mL。
[0023]三維材料的聚膠:將制備好的3mg/mL I型膠原加入到12孔培養(yǎng)板中，25微升/孔，37°C培養(yǎng)箱中聚膠30分鐘，即可得到多孔的已聚膠的I型膠原三維支架。
[0024]在已聚膠的I型膠原三維支架上加入混勻的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，使細(xì)胞密度為5 X IO5個細(xì)胞/孔。加入人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液(L-DMEM+10%FBS+100u/L青霉素+100u/L鏈霉素)，置于培養(yǎng)箱中37°C，5%C02進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液。
[0025](3)獲得神經(jīng)樣干細(xì)胞。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，結(jié)果見圖1。左圖人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞呈纖維狀，中圖為誘導(dǎo)分化7天后細(xì)胞形態(tài)圖，細(xì)胞變圓；右圖為誘導(dǎo)分化14后細(xì)胞形態(tài)圖，細(xì)胞呈典型的神經(jīng)樣干細(xì)胞形態(tài)。
[0026]實(shí)施例2
[0027](I)獲得離體人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞:同實(shí)施例1。
[0028](2)誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣干細(xì)胞的分化。
[0029]三維支架的聚膠:將2.5mg/mL聚乳酸溶液加入到12孔培養(yǎng)板中，25微升/孔，37°C培養(yǎng)箱中聚膠30分鐘，即可得到多孔的已聚膠的三維支架。
[0030]在已聚膠的三維支架上加入混勻的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，使細(xì)胞密度為5 X 105個細(xì)胞/孔。加入人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液(L-DMEM+10%FBS+100u/L青霉素+100u/L鏈霉素)，置于培養(yǎng)箱中37°C，5%C02進(jìn)行培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液。
[0031](3)獲得神經(jīng)樣干細(xì)胞。
[0032]實(shí)施例3
[0033](I)獲得離體人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞:同實(shí)施例1。
[0034](2)誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣干細(xì)胞的分化。
[0035]三維支架的聚膠:將5mg/mL絲素蛋白溶液加入到12孔培養(yǎng)板中，25微升/孔，37°C培養(yǎng)箱中聚膠30分鐘，即可得到多孔的已聚膠的三維支架。
[0036]在已聚膠的三維支架上加入混勻的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，使細(xì)胞密度為5 X 105個細(xì)胞/孔。加入人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液(L-DMEM+10%FBS+100u/L青霉素+100u/L鏈霉素)，置于培養(yǎng)箱中37°C`，5%C02進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換培養(yǎng)液。
[0037](3)獲得神經(jīng)樣干細(xì)胞。
[0038]實(shí)施例4
[0039]熒光定量聚合酶反應(yīng)(Realtime-PCR)驗(yàn)證神經(jīng)樣干細(xì)胞特異性基因表達(dá)。未分化的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為對照組，實(shí)施例1三維培養(yǎng)誘導(dǎo)分化7天的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組1，實(shí)施例1三維培養(yǎng)誘導(dǎo)分化14天的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組2。
[0040]采用Invitrogen公司總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，使用TAKARA公司的反
轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA,使用Promega公司的GoTaq? qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行Realtime-PCR,以b-Actin作為內(nèi)參基因，檢測神經(jīng)樣干細(xì)胞特異性基因Nestin、MaP2的表達(dá)。
[0041]具體操作步驟如下:
[0042]1.總RNA的提取:按照Invitrogen公司總RNA提取試劑盒進(jìn)行。
[0043]2.cDNA合成:按照TAKARA公司cDNA合成說明書進(jìn)行操作，步驟如下:
[0044](I)反應(yīng)體系如下:
[0045]
total RNA10ng-2 u g

oligo(dT)15(50uM) IuL

random6mers (50 U M) IuL

IOmM dNTP mixIuL
無核酸酶水tol8yL[0046]
[0047](2)將反應(yīng)液在PCR儀上65-70°C條件下孵育5分鐘，然后在冰上至少放2分鐘；
[0048](3)制備cDNA合成混合物，按順序添加反應(yīng)物,體系如下:
[0049]
【權(quán)利要求】
1.人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)三維培養(yǎng)后分化成神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟:將三維材料在37°C聚膠30分鐘；再加入人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，于37°C，5%C02培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液；所述三維材料為I型膠原溶液、聚乳酸溶液或絲素蛋白溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞三維培養(yǎng)分化成神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述I型膠原溶液的濃度為3mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞三維培養(yǎng)分化成神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述聚乳酸溶液的濃度為2.5mg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞三維培養(yǎng)分化成神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述絲素蛋白溶液的濃度為5mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞三維培養(yǎng)分化成神經(jīng)樣干細(xì)胞的方法，其特征在于，培養(yǎng)時間為14天。
【文檔編號】C12N5/0797GK103805566SQ201310737266
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】馮文峰, 佘志勇, 方海慶, 陳建興 申請人:廣州愛菲科生物科技有限公司