一種含有nadh激酶基因的工程菌及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含有NADH激酶基因的工程菌及其用途。本發(fā)明提供的一種構(gòu)建重組菌的方法，為將NADH激酶編碼基因pos5和PHB合成基因phbCAB導(dǎo)入目的菌中，得到重組菌。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，重組菌中NADH激酶基因能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)還原型輔酶NADH向NADPH的轉(zhuǎn)化，從而提高了NADPH依賴的聚-3-羥基丁酸酯的合成，該工程菌與以前的菌株相比具有更高的PHB生產(chǎn)效率。
【專利說明】—種含有NADH激酶基因的工程菌及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種含有NADH激酶基因的工程菌及其用途。【背景技術(shù)】
[0002]NAD (H)和NADP (H)是生物體內(nèi)的重要輔酶，它們主要作為電子載體參與各種氧化還原反應(yīng)。輔酶涉及的反應(yīng)非常廣泛，其濃度的改變會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝的變化，從而影響許多代謝產(chǎn)物的合成。通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)的輔酶濃度和氧化還原態(tài)比率等進(jìn)行調(diào)控以期提高生物合成的效率受到越來越多的關(guān)注。NADH激酶能夠利用ATP等作為磷酸基團(tuán)的供體，催化NADH的磷酸化形成NADPH，在生物體內(nèi)的輔酶代謝中起到了非常關(guān)鍵的作用。釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中的NADH激酶基因有三個(gè)，分別為UTR1、YEF1和P0S5(Genomic characterization of P0S5, the Saccharomyces cerevisiae mitochondrialNADH kinase, Mitochondrion, 2006, 6 (2): 94-101),其中位于線粒體內(nèi)的 Pos5 所催化的反應(yīng)被認(rèn)為是線粒體內(nèi)還原型輔酶NADPH的主要來源，在抗氧化等多個(gè)生理功能中起到重要的作用(Mitochondrial NADH kinase, Pos5p, is required for efficient iron-sulfurcluster biogenesis in Saccharomyces cerevisiae, Journal of Biological Chemistry，2010，285(50):39409-39424)。
[0003]目前被研究確定的NADH激酶還有Podospora anserina中的Ndkl (Deletionof the mitochondrial NADH kinase increases mitochondrial DNA stability andlife span in the filamentous fungus Podospora anserine, Experimental Gerontology，2010, 45(7-8): 543-549)和 Entamoeba histolytica 中的 Nadhk (Biochemical andfunctional characterization of novel NADH kinase in the enteric protozoanparasite Entamoeba histolytica, Biochimie, 2013，95 (2): 309-319)等。
[0004]聚-3-羥基丁酸酯(poly-3-hydroxybutyrates,簡(jiǎn)稱PHB)是許多微生物在特定的生長(zhǎng)條件下在細(xì)胞內(nèi)積累的一種高分子聚合物，主要用來作為碳源和能量的貯藏物質(zhì)，在營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)重新分解利用，賦予細(xì)胞多樣的生理潛能。PHB具有與類似塑料(聚乙烯、聚丙烯等)的材料學(xué)性質(zhì)，與石油來源的塑料材料不同的是，PHB可以由可再生物質(zhì)資源(淀粉、纖維素、脂肪酸等)通過微生物轉(zhuǎn)化的方法獲得，廢棄在自然環(huán)境中以后，PHB可以由微生物較快的完全降解為二氧化碳和水，具有生物可再生、生物可降解等特性，可以作為傳統(tǒng)的不可降解的石油來源塑料材料的補(bǔ)充，因而受到了廣泛關(guān)注(Increased diversificationof polyhydroxyalkanoates by modification reactions for industrial and medicalapplications,Applied Microbiology and Biotechnology, 2007，74(I): 1-12)。在大多數(shù)微生物中，PHB是由糖類`等物質(zhì)降解產(chǎn)生的乙酰輔酶A為前體來合成的，在phaA基因編碼的β -酮基硫解酶的作用下，兩個(gè)乙酰輔酶A分子縮合生成乙酰乙酰輔酶A，接下來phaB基因編碼的NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶催化乙酰乙酰輔酶A還原為(R) -3-羥基丁酰輔酶A(3HB-CoA)，最后由PHA聚合酶催化聚合成PHB。還原型輔酶NADPH參與了 PHB的合成反應(yīng)，胞內(nèi)可利用的還原力水平是被認(rèn)為是影響PHB合成的重要因素。目前制約PHB大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵問題是其相對(duì)石油來源塑料材料高的多的生產(chǎn)成本。對(duì)微生物中PHB的生物合成過程進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究，對(duì)生產(chǎn)菌種進(jìn)行有針對(duì)性的基因改造，提高PHB合成的效率，將有助于降低生產(chǎn)成本，推進(jìn)PHB的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建重組菌的方法。
[0006]本發(fā)明提供的方法，為將NADH激酶編碼基因pos5和合成聚_3_羥基丁酸酯的基因phbCAB導(dǎo)入目的菌中，得到重組菌。
[0007]上述方法中，所述NADH激酶編碼基因pos5和合成聚-3-羥基丁酸酯的基因phbCAB通過重組載體導(dǎo)入目的菌中；
[0008]所述重組載體為將NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)盒插入含有合成聚_3_羥基丁酸酯的基因phbCAB的表達(dá)載體中，得到的重組載體。
[0009]上述方法中，所述NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)盒包括驅(qū)動(dòng)NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)的丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子、NADH激酶編碼基因pos5和終止子。
[0010]上述方法中，所述NADH激酶編碼基因pos5來源于釀酒酵母Saccharomycescerevisiae s288c ;所述NADH激酶的氨基酸序列為序列表中的序列3。 [0011]上述方法中，所述含有合成聚-3-羥基丁酸酯的基因PhbCAB的表達(dá)載體為PBHR68 ；
[0012]所述NADH激酶編碼基因pos5的核苷酸序列為序列表中的序列2自5’末端第223-1416位核苷酸；
[0013]所述合成聚-3-羥基丁酸酯的基因phbCAB的核苷酸序列為序列表中的序列4 ；
[0014]所述NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)盒的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；
[0015]所述出發(fā)菌為大腸桿菌，可以為大腸桿菌野生型或其常見菌株，可為K12、BW25113、MG1655、JM109、DH5a ,XLl-Blue等。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述大腸桿菌具體為E.coli JM109。
[0016]在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述重組載體為將序列2所示的POS5基因表達(dá)盒插入表達(dá)載體pBHR68的AvrII和NheI酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0017]由上述的方法構(gòu)建的重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0018]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)聚-3-羥基丁酸酯的方法。
[0019]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:發(fā)酵上述的重組菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到聚-3-羥基丁酸酯。
[0020]上述方法中，所述發(fā)酵溫度為30°C -40°C;所述發(fā)酵時(shí)間為40_50h ;所述發(fā)酵溫度具體為37°C ;所述發(fā)酵時(shí)間具體為48h。
[0021]本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種制備聚-3-羥基丁酸酯的重組載體。
[0022]本發(fā)明提供的重組載體，為將NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)盒插入含有合成聚-3-羥基丁酸酯的基因phbCAB的表達(dá)載體中，得到的重組載體；
[0023]所述NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)盒具體包括驅(qū)動(dòng)NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)的丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子、NADH激酶編碼基因pos5和終止子；
[0024]所述NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)盒的核苷酸序列具體為序列表中的序列2 ；[0025]所述含有合成聚-3-羥基丁酸酯的基因phbCAB的表達(dá)載體具體為pBHR68。
[0026]上述的重組菌或上述的重組載體在提高聚-3-羥基丁酸酯產(chǎn)量中的應(yīng)用也在本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。
[0027]在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述重組載體為將序列2所示的pos5基因表達(dá)盒插入表達(dá)載體pBHR68的AvrII和NheI酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0028]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明構(gòu)建的重組菌為將NADH激酶基因和合成聚_3_羥基丁酸酯的基因均導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌，該重組菌中NADH激酶基因能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)還原型輔酶NADH向NADPH的轉(zhuǎn)化，從而提高了 NADPH依賴的聚_3_羥基丁酸酯的合成，該工程菌與以前的菌株相比具有更高的PHB生產(chǎn)效率。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0030]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0031]下述實(shí)施例中涉及分子生物學(xué)操作所用的酶,均購(gòu)于MBI Fermentas公司，相應(yīng)的操作步驟完全按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行；質(zhì)粒提取、DNA片段回收所用的試劑盒購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)公司，相應(yīng)的操作完全按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行；實(shí)施例中涉及的DNA合成和測(cè)序工作由北京博邁德生物技術(shù)公司完成。
[0032]下述實(shí)施例中涉及的細(xì)菌培養(yǎng)基如下，如無特殊指明，培養(yǎng)基的滅菌條件均為121°C，20 分鐘:
[0033]LB-Amp液體培養(yǎng)`基:每升培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/LNaCl和100yg/mL氨芐青霉素，其余為水。
[0034]LB-Amp固體培養(yǎng)基:每升培養(yǎng)基含有15g/L瓊脂、5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl和100 μ g/mL氨節(jié)青霉素,其余為水。
[0035]MSG-Amp培養(yǎng)基:每升培養(yǎng)基含酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L、(NH4) 2S042g/L,MgSO40.4g/L,Na2HPO4.12H209.65g/L、KH2PO41.5g/L、微量元素溶液 I10mL/L、微量元素溶液IIlmL/L和100 μ g/mL氨節(jié)青霉素，其余為水；
[0036]每升微量元素溶液I 含:Fe(III)-NH4-Citrate5g/L 和 CaCl2.2H202g/L，其余為
0.5M HCl ；
[0037]每升微量元素溶液II 含:ZnS04.7H20100mg/L、MnCl2.4H2030mg/L、H3B03300mg/L、CoCl2.6H20200mg/L、CuSO4.5H2010mg/L、NiCl2.6H2020mg/L、NaMoO4.2H2030mg/L，其余為
0.5M HCl。
[0038]實(shí)施例1、重組菌 E.coli JM109 (pBHR68pos5)的構(gòu)建
[0039]一、重組表達(dá)載體pBHR68pos5的構(gòu)建
[0040]1、表達(dá)載體pl9pdc的獲得
[0041]人工合成一段雙鏈DNA，其核苷酸序列為序列表中的序列1，其中序列表中序列I自5’末端第28-208位核苷酸為丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子、序列I自5’末端第213-248位核苷酸為多克隆位點(diǎn)，序列I自5’末端第249-334位核苷酸為轉(zhuǎn)錄終止子。
[0042]將上述人工合成的序列I所示的雙鏈DNA片段通過TA克隆的方法連接到T載體pMD19-T Simple (購(gòu)自于日本Takara公司)中，得到表達(dá)載體pl9pdc。[0043]2、NADH激酶基因pos5的獲得
[0044]以釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae s288c (ATCC204508)的基因組 DNA 為模板，以Kl和K2為上下游引物擴(kuò)增。
[0045]引物如下:
[0046]Kl:GAAAAGGATCCAAGGAGATATACCATGAGTACGTTGGATTCACATTCCCTA (BamHI)
[0047]K2:GAAAAGGTACCTTAATCATTATCAGTCTGTCTCTTGGT (KpnI)0
[0048]得到1232bp大小的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列2自5’末端第223-1416位所示的核苷酸，即為NADH激酶基因pos5，其編碼的NADH激酶的氨基酸序列為序列表中的序列3。
[0049]3、重組載體pl9pos5的獲得
[0050]1)用BamHI和KpnI雙酶切步驟I中得到的表達(dá)載體pl9pdc，回收大小約為3.0kb的載體大片段；
[0051]2)用BamHI和KpnI雙酶切步驟2中得到的1232bp大小的PCR產(chǎn)物，回收約為1220bp的酶切產(chǎn)物；
[0052]3)將步驟1)得到的載體大片段與步驟2)得到的1220bp的酶切產(chǎn)物連接，得到連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方 法導(dǎo)入到E.coli JM109中，并涂布于LB-Amp固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h，得到轉(zhuǎn)化子。
[0053]提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用BamHI和KpnI雙酶切，酶切產(chǎn)物大小約為3.0kb和1.2kb的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒，命名為pl9pos5,為重組表達(dá)載體。
[0054]將重組表達(dá)載體pl9pos5送去測(cè)序，結(jié)果該載體為將序列表中序列2自5’末端第223-1416位核苷酸所示的基因pos5插入表達(dá)載體pl9pdc得到的載體。
[0055]4、構(gòu)建重組表達(dá)載體pBHR68pos5
[0056]I)用 XbaI 酶切質(zhì)粒 pBHR68 (Spiekermann P, Rehm BHA, Kalscheuer R, et al.Asensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screeningof bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storagecompounds.Arch Microbiol, 1999，171:73-80 ;公眾可從北京化工大學(xué)獲得；瓊脂糖凝膠電泳回收得到大小約為8.1kb的載體骨架，其中含有PHB合成基因phbCAB (其核苷酸序列為序列4)及其啟動(dòng)子序列、pBluescript II SK(-)來源的Amp抗性基因及復(fù)制子。
[0057]2)用AvrII和NheI酶切上述3得到的重組載體pl9pOS5，瓊脂糖凝膠電泳回收得到大小約為1.5kb的DNA片段。
[0058]經(jīng)過測(cè)序，該大小約為1.5kb的DNA片段的核苷酸序列為序列2，序列2所示的為pos5基因表達(dá)盒，pos5基因表達(dá)盒包括驅(qū)動(dòng)pos5基因表達(dá)的丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子、pos5基因和終止子；
[0059]丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子的核苷酸序列為序列表中序列2自5’末端第16-196位核苷酸；
[0060]pos5基因的核苷酸序列為序列表中序列2自5’末端第223-1416位核苷酸；
[0061]終止子的核苷酸序列為序列表中序列2自5’末端第1429-1514位核苷酸。
[0062]3)使用T4DNA連接酶連接步驟I)和步驟2)中回收的片段，得到連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coli JM109中，并涂布于LB-Amp固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h0
[0063]提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物大小約為3.4kb和6.3kb的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒，命名為pBHR68pos5，為重組表達(dá)載體。
[0064]將重組表達(dá)載體pBHR68pos5送去測(cè)序，結(jié)果該載體為將序列2所示的pos5基因表達(dá)盒插入表達(dá)載體PBHR68的AvrII和NheI酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0065]二、重組菌 E.coli JM109 (pBHR68pos5)的構(gòu)建
[0066]將上述一的4得到的重組質(zhì)粒pBHR68pos5通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，得到重組菌。
[0067]提取重組菌的質(zhì)粒，送去測(cè)序，為重組質(zhì)粒pBHR68pos5，含有該重組質(zhì)粒的重組菌命名為重組菌 E.coli JM109 (pBHR68pos5)。
[0068]將對(duì)照質(zhì)粒pBHR68通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109，構(gòu)建對(duì)照重組菌E.coli JM109 (pBHR68)。
[0069]實(shí)施例2、重組菌E.coli JM109 (pBHR68pos5)在制備PHB中的應(yīng)用
[0070]1、發(fā)酵培養(yǎng)
[0071]種子液的獲得:將 由實(shí)施例1的二制備的重組菌E.coli JM109 (pBHR68pos5)在LB-Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14h (37°C搖床，200rpm)作為種子液；
[0072]發(fā)酵:按體積比4%的接種量將種子液接種到MSG-Amp液體培養(yǎng)基中，37°C搖床，200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)48h，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到PHB。
[0073]將對(duì)照重組菌E.coli JM109(pBHR68)按照上述方法發(fā)酵培養(yǎng)，收集對(duì)照發(fā)酵產(chǎn)物。
[0074]2、檢測(cè)PHB含量
[0075]氣相色譜法(Gas chromatography, GC)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定量檢測(cè),測(cè)定細(xì)胞的生物量和胞內(nèi)PHB的含量。
[0076]具體檢測(cè)方法如下:
[0077]氣相色譜分析使用HP6890型氣相色譜儀，色譜柱為HP_5毛細(xì)管柱，柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑320 μ m,固定相為25nm厚的苯基甲基聚硅氧烷；檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器(Flameionization detector, FID);用高純氮?dú)庾鳛檩d氣,氫氣作為燃?xì)?，空氣為助燃?xì)狻?br> [0078]氣相色譜分析的條件如下:
[0079]柱溫:
[0080]80。(:開始，停留 1.5min ；
[0081]30°C /min 的速率升溫到 140°C，停留 Omin ；
[0082]400C /min 的速率升溫到 220°C，停留 Imin。
[0083]總計(jì)時(shí)間為6.5min。
[0084]柱壓:
[0085]IOpsi 開始，停留 1.5min ；
[0086]2.5psi/min 的速率升壓到 20psi,停留 0.5min。
[0087](psi為壓力單位，即磅/平方英寸，Ipsi = 6.89476kPa)
[0088]進(jìn)樣口:溫度為200°C，使用分流模式，分流比為30。
[0089]檢測(cè)器:溫度為220°C，氫氣流量30mL/min，空氣流量400mL/min。[0090]檢測(cè)步驟如下:
[0091]I)將上述I得到的發(fā)酵產(chǎn)物，離心(10000g，10min)收集菌體，然后用蒸餾水洗滌后再次離心；將細(xì)胞冰凍干燥，測(cè)定細(xì)胞干重(Cell dry weight, CDff)；
[0092]2)取50mg干細(xì)胞于酯化管中，加入2mL酯化液(按體積百分含量為3%將濃硫酸溶于甲醇中，得到硫酸溶液，再按終濃度為lg/L將苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)加入硫酸溶液中，得到酯化液)、2mL氯仿，加蓋密閉，100°C烘箱中酯化4h ;冷卻至室溫后，加入ImL蒸餾水，充分振蕩，靜置分層；待氯仿相與水相完全分離后，取氯仿相，即為PHB，將氯仿相進(jìn)行氣相色譜分析；
[0093]3)使用安捷倫公司的微量進(jìn)樣器，進(jìn)樣量為I μ L，采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)PHB進(jìn)行定量分析，根據(jù)峰面積定量。
[0094]PHB含量定義為PHB對(duì)細(xì)胞干重的比值，PHB產(chǎn)量=PHB含量X細(xì)胞干重。
[0095]采用相同的方法將對(duì)照發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。菌體內(nèi)積累PHB的含量及細(xì)胞干重結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明，Ε.coli JM109 (pBHR68pos5)在上述培養(yǎng)條件比不含有NADH激酶的對(duì)照菌株E.coli JM109 (pBHR68)具有較好的PHB生產(chǎn)能力，提高PHB的產(chǎn)量。
[0096]表1含有不同表達(dá)載體的大腸桿菌中PHB的合成
[0097]
【權(quán)利要求】
1.一種構(gòu)建重組菌的方法，為將NADH激酶編碼基因P0S5和合成聚_3_羥基丁酸酯的基因phbCAB導(dǎo)入目的菌中，得到重組菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述NADH激酶編碼基因pos5和合成聚-3-羥基丁酸酯的基因phbCAB通過重組載體導(dǎo)入目的菌中； 所述重組載體為將NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)盒插入含有合成聚-3-羥基丁酸酯的基因phbCAB的表達(dá)載體中，得到的重組載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)盒包括驅(qū)動(dòng)NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)的丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子、NADH激酶編碼基因pos5和終止子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:
所述NADH激酶編碼基因pos5來源于釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae s288c ； 所述NADH激酶的氨基酸序列為序列表中的序列3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于: 所述含有合成聚-3-羥基丁酸酯的基因phbCAB的表達(dá)載體為PBHR68 ； 所述NADH激酶編碼基因pos5的核苷酸序列為序列表中的序列2自5’末端第223-1416位核苷酸； 所述合成聚-3-羥基丁酸酯的基因phbCAB的核苷酸序列為序列表中的序列4 ； 所述NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)盒的核苷酸序列為序列表中的序列2 ； 所述出發(fā)菌為大腸桿菌，所述大腸桿菌具體為E.coli JMlOQ0
6.由權(quán)利要求1-5中任一所述的方法構(gòu)建的重組菌。
7.—種生產(chǎn)聚-3-羥基丁酸酯的方法，包括如下步驟:發(fā)酵權(quán)利要求6所述的重組菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到聚-3-羥基丁酸酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于: 所述發(fā)酵溫度為30°C -40°C ;所述發(fā)酵時(shí)間為40-50h ； 所述發(fā)酵溫度具體為37°C ;所述發(fā)酵時(shí)間具體為48h。
9.一種制備聚-3-羥基丁酸酯的重組載體，為將NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)盒插入含有合成聚-3-羥基丁酸酯的基因phbCAB的表達(dá)載體中，得到的重組載體； 所述NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)盒具體包括驅(qū)動(dòng)NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)的丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子、NADH激酶編碼基因pos5和終止子； 所述NADH激酶編碼基因pos5表達(dá)盒的核苷酸序列具體為序列表中的序列2 ； 所述含有合成聚-3-羥基丁酸酯的基因phbCAB的表達(dá)載體具體為pBHR68。
10.權(quán)利要求6所述的重組菌或權(quán)利要求9所述的重組載體在提高聚-3-羥基丁酸酯產(chǎn)量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103740630SQ201310750790
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】李正軍, 陳國(guó)強(qiáng), 吳瓊, 張潔 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)