源于廣西巴馬長(zhǎng)壽村的益生菌鼠李糖乳桿菌hsryfm1301及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種源于廣西巴馬長(zhǎng)壽村的益生菌鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus?rhamnosus）hsryfm1301及其應(yīng)用，該菌具有分解膽固醇及甘油三酯能力，其保藏號(hào)是CGMCC?NO.8545。所述鼠李糖乳桿菌hsryfm1301的分離、篩選及鑒定，包括以下步驟：從廣西巴馬長(zhǎng)壽人群腸道中分離乳酸菌，通過(guò)體外試驗(yàn)篩選出分解膽固醇及甘油三酯能力較強(qiáng)的菌株；在比較耐酸及耐膽鹽特性，抑菌特性，對(duì)抗生素具敏感性綜合比較基礎(chǔ)上，獲得1株益生性能最為優(yōu)異的益生菌菌株hsryfm1301；經(jīng)生理生化試驗(yàn)、API試劑條及16s?rDNA測(cè)序分析，將篩選出的菌株鑒定為鼠李糖乳桿菌。
【專利說(shuō)明】源于廣西巴馬長(zhǎng)壽村的益生菌鼠李糖乳桿菌hsryfm1301及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種源于廣西巴馬長(zhǎng)壽村的益生菌鼠李糖乳桿菌hsryfml301及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]血清膽固醇水平過(guò)高是心血管疾病的主要原因，藥物是當(dāng)前治療心血管疾病的主要方式，但是藥物治療的成本較高且有較大的副作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，降低血清中膽固醇水平能夠顯著降低心血管病的死亡率。大量動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)表明，乳酸菌能夠降低血清中的膽固醇水平。乳酸菌代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)能抑制腸道內(nèi)致病菌的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)平衡；胃腸道中的細(xì)菌通過(guò)抗生素抗性基因的水平轉(zhuǎn)移，給臨床醫(yī)學(xué)帶來(lái)了嚴(yán)重難題；因此篩選分解膽固醇及甘油三酯，并具有抑菌能力及耐藥性較低的益生菌有著重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供具有分解膽固醇及甘油三酯能力的益生菌菌株及其應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明提供了一株鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus) hsryfml301,該菌具有分解膽固醇及甘油三酯能力，已于2013年12月6日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)是CGMCC N0.8545。
[0005]經(jīng)試驗(yàn)證明，該菌株具有分解膽固醇及甘油三酯的能力，并耐人工胃液及膽鹽，同時(shí)具有較強(qiáng)的抑菌能力，且耐藥性較低；通過(guò)生理生化、API試劑條和16S rDNA序列比對(duì)分析，將該菌株鑒定為鼠李糖乳桿菌。
[0006]本發(fā)明還提供了鼠李糖乳桿菌hsryfml301在制備具有分解膽固醇及甘油三酯能力的發(fā)酵乳、發(fā)酵乳飲料及活菌制劑中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌hsryfml301具有分解膽固醇及甘油三酯的能力，并耐人工胃液及膽鹽，同時(shí)具有較強(qiáng)的抑菌能力且耐藥性較低，將其用于制備發(fā)酵乳、發(fā)酵乳飲料及活菌制劑，具有很好的前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1為本發(fā)明菌株的形態(tài)圖。
[0009]圖2為本發(fā)明菌株API試劑條鑒定圖。
[0010]圖3為本發(fā)明菌株API鑒定結(jié)果。
[0011]圖4為 本發(fā)明菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；泳道M:100+2+3Kb DNA maker ；泳道I為:hsryfml30116S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】[0012]本研究采用傳統(tǒng)涂布平板分離法從廣西巴馬長(zhǎng)壽村采集的樣品中分離乳酸菌，通過(guò)體外試驗(yàn)篩選出分解膽固醇及甘油三酯能力較強(qiáng)的乳酸菌菌株，然后通過(guò)模擬人體胃腸道環(huán)境篩選出耐酸耐膽鹽能力較強(qiáng)的菌株，并研究其抑菌性及耐藥性，通過(guò)綜合比較，獲得益生性能最為優(yōu)異的益生菌菌株。
[0013]相關(guān)培養(yǎng)基及試劑配方
[0014](I)MRS-THIO培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g,三水醋酸鈉3.0g，牛肉膏8.0g,檸檬酸三銨
2.0g,酵母浸膏4.0g,七水硫酸鎂0.2g，葡萄糖10.0g, 一水硫酸錳0.04g,吐溫-801.0mL,磷酸氫二鉀2.0g，硫乙醇酸鈉2.0g，調(diào)pH至6.4，121°C滅菌15min，冷卻備用。
[0015](3)膽固 醇培養(yǎng)基:膽固醇0.10g、吐溫-801.0mL、鹿糖酯0.10g、冰乙酸5.0mL,冰浴超聲破碎備用。將上述制備的膽固醇膠束溶液加入到MRS液體培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中膽固醇的終濃度為0.10mg/mL。并調(diào)pH至6.50±0.20，121°C滅菌15min，冷卻備用。
[0016](4)甘油三酯培養(yǎng)基:將2%的聚乙烯醇水溶液與植物油按3:1的比例混合，用高速組織搗碎機(jī)處理后作為甘油三酯的來(lái)源。將上述制備的植物油乳化液加入到MRS液體培養(yǎng)基中，調(diào)pH至6.50±0.20，121。。滅菌15min，冷卻備用。
[0017](5)人工胃液的配制:準(zhǔn)確量取20.0mLImoI/L的HC1，用去離子水將pH分別調(diào)至
2.0,3.0，加入NaCl使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.2%，每100.0mL溶液中加入1.0g胃蛋白酶，充分溶解后，用0.22μπι微孔濾膜在無(wú)菌操作臺(tái)中過(guò)濾除菌，于無(wú)菌試劑瓶中低溫保藏備用。
[0018](6)硫酸鐵銨顯色劑:稱取4.46g硫酸鐵銨溶解于100.0mL85%磷酸中，取10.0mL溶液用濃硫酸定容至100.0mL，放入硅膠干燥皿中備用。
[0019]具體步驟:
[0020]I樣品采集
[0021]采集廣西巴馬長(zhǎng)壽村中長(zhǎng)壽人群及其家族人群樣品，加入ImL滅菌液體石蠟油密封后，迅速置于冰盒內(nèi)，分離樣品中的乳酸菌。
[0022]2乳酸菌的分離
[0023]將采集的樣品經(jīng)梯度稀釋后，分別接種于MRS固體培養(yǎng)基、LBS固體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)48h，挑取平板上的典型菌落，劃線分離得到純菌落。挑取各平板上的純菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h后，4°C冰箱冷藏備用或凍干保藏。
[0024]3乳酸菌的生理生化試驗(yàn)
[0025]對(duì)分離到的乳酸菌進(jìn)行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，并進(jìn)行接觸酶、運(yùn)動(dòng)性、硝酸鹽還原及吲哚等生理生化試驗(yàn)。
[0026]結(jié)果表明，從采集的15份樣品中分離獲得217株菌株，通過(guò)生理生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)156株菌革蘭氏染色為陽(yáng)性，形狀為桿狀、短桿狀或球狀，在15°C及45°C環(huán)境下均能生長(zhǎng)，接觸酶、運(yùn)動(dòng)性、硝酸鹽還原、吲哚、產(chǎn)H2S及明膠液化試驗(yàn)均為陰性，所以將156株分離細(xì)菌初步鑒定為乳酸菌。
[0027]4乳酸菌分解膽固醇及甘油三酯能力的測(cè)定
[0028]將活化好的乳酸菌按3%的接種量接種至MRS-THIO膽固醇培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h后,取培養(yǎng)液0.2mL,加入1.0mL無(wú)水乙醇振蕩混勻Imin,再加入3.8mL無(wú)水乙醇振蕩混勻Imin,靜置5min后再次振蕩混勻,4000r/min離心IOmin,取2.0mL上清液用于膽固醇的測(cè)定，以未接菌的膽固醇培養(yǎng)基作為對(duì)照。膽固醇的測(cè)定采用硫酸鐵銨比色法，參照GB/T5009.128-2003食品中膽固醇的測(cè)定方法，測(cè)定其0D560nm值，膽固醇的分解率按下式計(jì)算:
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種源于廣西巴馬長(zhǎng)壽村的益生菌鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)hsryfml301,其特征在于該菌具有分解膽固醇及甘油三酯能力，其保藏號(hào)是CGMCCN0.8545。
2.權(quán)利要求1所述鼠李糖乳桿菌hsryfml301在制備具有分解膽固醇及甘油三酯能力的發(fā)酵乳中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述鼠李糖乳桿菌hsryfml301在制備具有分解膽固醇及甘油三酯能力的發(fā)酵乳飲料中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述鼠李糖乳桿菌hsryfml301在制備具有分解膽固醇及甘油三酯能力的活菌制劑中的應(yīng)用。`
【文檔編號(hào)】A23C9/123GK103710290SQ201310751034
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】顧瑞霞, 陳大衛(wèi), 伍云, 黃嘉棣, 謝秉鏘, 孫寧, 鄒東昊, 蔣欣榮 申請(qǐng)人:廣西皇氏甲天下乳業(yè)股份有限公司