Tcr或bcr高通量測(cè)序的方法及利用標(biāo)簽序列矯正多重pcr引物偏差的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種對(duì)TCR或BCR進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，該方法根據(jù)TCR或BCR的V區(qū)基因特征設(shè)計(jì)上游引物，根據(jù)TCR或BCR的C區(qū)或J區(qū)基因特征設(shè)計(jì)下游引物，結(jié)合多重PCR技術(shù)和高通量測(cè)序，獲得TCR或BCR的序列，從而分析TCR或BCR的重排信息；采用本發(fā)明提供的2個(gè)循環(huán)的多重PCR技術(shù)，相比現(xiàn)有多重PCR的25～30個(gè)循環(huán)，能大大降低引物擴(kuò)增偏好引入的測(cè)序誤差；此外，本發(fā)明還提供了一種利用DNA標(biāo)簽序列矯正多重PCR的引物偏差的方法，進(jìn)一步降低引物擴(kuò)增偏好引入的測(cè)序誤差以及高通量測(cè)序固有的測(cè)序錯(cuò)誤。
【專利說明】TCR或BCR高通量測(cè)序的方法及利用標(biāo)簽序列矯正多重PCR引物偏差的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種TCR或BCR高通量測(cè)序的方法以及一種利用標(biāo)簽序列矯正多重PCR引物偏差的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]T或B淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟過程中，通過V (D) J基因組合、連接多樣性，以及體細(xì)胞高頻突變、基因轉(zhuǎn)換和類別轉(zhuǎn)換等途徑形成數(shù)量龐大且種類多樣的TCR或BCR受體庫，免疫細(xì)胞群中TCR的多樣性多達(dá)1016，BCR的多樣性多達(dá)1014，傳統(tǒng)的方法比如SSCP技術(shù)、GeneScan技術(shù)、熒光定量溶解曲線技術(shù)等，常存在覆蓋率范圍窄的缺點(diǎn)，不能滿足數(shù)量繁多、種類多樣的的檢測(cè)。
[0003]高通量測(cè)序可以滿足龐大的序列測(cè)序要求。但是，使用Roche454測(cè)序平臺(tái)和Illumina的solexa或Genome Analyzer測(cè)序平臺(tái)等高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序時(shí),一般需要進(jìn)行測(cè)序前樣本的文庫構(gòu)建，由于TCR或BCR的多樣性，引物的擴(kuò)增偏好性以及模板豐度的差異等因素，建庫時(shí)引物設(shè)計(jì)顯得尤為重要；此外，現(xiàn)有技術(shù)建庫時(shí)，常在引物的5’端連接標(biāo)簽序列來追蹤特異的目標(biāo)序列，但是標(biāo)簽序列使得引物序列延長，提高了引物的復(fù)雜性，多對(duì)引物同時(shí)使用時(shí)，采用普通的PCR無法滿足高通量測(cè)序建庫的要求，還可能會(huì)引起PCR引物的擴(kuò)增誤差。
[0004]因此，有必要提供一種TCR或BCR高通量測(cè)序的方法以及構(gòu)建高通量測(cè)序文庫時(shí)矯正PCR引物擴(kuò)增偏差的 方法以及降低高通量測(cè)序固有的測(cè)序錯(cuò)誤。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于此，本發(fā)明第一方面提供了一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，該方法根據(jù)TCR或BCR的V區(qū)基因特征設(shè)計(jì)了上游引物，根據(jù)TCR或BCR的C區(qū)或J區(qū)基因特征設(shè)計(jì)了下游引物，再采用2個(gè)循環(huán)的多重PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，并結(jié)合高通量測(cè)序，能快速、便捷的獲得較準(zhǔn)確的TCR或BCR的序列，能更全面地反映TCR或BCR的種類，且降低了現(xiàn)有技術(shù)中高通量測(cè)序誤差。本發(fā)明第二方面提供了一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體全長基因進(jìn)行高通量測(cè)序的方法。本發(fā)明第三方面提供了一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體CDR3區(qū)基因進(jìn)行高通量測(cè)序的方法。本發(fā)明第四方面提供了一種利用DNA標(biāo)簽序列以及高通量測(cè)序?qū)淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行定量分析的方法。本發(fā)明第五方面提供了一種利用DNA標(biāo)簽序列矯正多重PCR的引物偏差的方法，該方法能降低測(cè)序文庫構(gòu)建過程中由于引物序列對(duì)模板的擴(kuò)增偏好引入的誤差以及降低高通量測(cè)序固有的測(cè)序錯(cuò)誤。
[0006]第一方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，包括M種上游引物和至少一種下游引物，所述M種上游引物的設(shè)計(jì)方法為:根據(jù)T淋巴細(xì)胞受體TCR或B淋巴細(xì)胞受體BCR的可變區(qū)V區(qū)基因序列的特征，分別設(shè)計(jì)M種與所述TCR或BCR的V區(qū)基因家族上游序列互補(bǔ)的上游引物，其中，所述M為自然數(shù)；所述至少一種下游引物的設(shè)計(jì)方法為:根據(jù)TCR或BCR的恒定區(qū)C區(qū)的基因序列的特征，設(shè)計(jì)至少一種與TCR或BCR的C區(qū)基因序列互補(bǔ)的下游引物，或根據(jù)TCR或BCR的連接區(qū)J區(qū)的基因序列的特征，設(shè)計(jì)至少一種與TCR或BCR的J區(qū)基因序列互補(bǔ)的下游引物。
[0007]優(yōu)選地，所述上游引物和下游引物分別與所述待測(cè)TCR全長或TCR的⑶R3區(qū)基因兩條鏈的3’末端互補(bǔ)。
[0008]優(yōu)選地，所述上游引物和下游引物分別與所述待測(cè)BCR全長或BCR的⑶R3區(qū)基因兩條鏈的3’末端互補(bǔ)。
[0009]優(yōu)選地，所述設(shè)計(jì)M種上游引物的過程中，為根據(jù)BCR的Vh1、Vh2、Vh3、Vh4、Vh5、Vh6和Vh7家族的leader區(qū)基因序列的特征分別設(shè)計(jì)至少一條上游引物，分別得到全長_VH1、全長_VH2、全長_VH3、全長_VH4、全長_VH5、全長-Vh6和全長_VH7的上游引物。
[0010]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述全長-VhI的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:1~SEQ IDNO:7所示,所述全長-VH2的上游引物的堿基序列如SEQ ID N0:8所示,所述全長_VH3的上游引物的堿基序列如SEQ ID N0:9~SEQ ID NO: 14所示，所述全長_VH4的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 15~SEQ ID NO: 18所示，所述全長_VH5的上游引物的堿基序列如SEQID NO: 19~SEQ ID NO: 20所示，所述全長_VH6的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 21所示，所述全長_Vh7的上游引物的堿基序列SEQ ID NO:22所示。
[0011]優(yōu)選地，所述設(shè)計(jì)M種上游引物的過程中，為根據(jù)BCR的Vh1、Vh2、Vh3、Vh4、Vh5、Vh6和Vh7家族的CDR3區(qū)上游的保守區(qū)FR3基因序列的特征分別設(shè)計(jì)至少一條上游引物，分別得到 CDR3-Vh1、CDR3-Vh2、CDR3-Vh3、CDR3-Vh4、CDR3-Vh5、CDR3-Vh6 和 CDR3_VH7 的上游引物。
[0012]進(jìn)一步優(yōu)選地，`所述⑶R3-VH1的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:28~SEQ IDNO: 33所示，所述⑶R3-Vh2的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 34所示，所述⑶R3_VH3的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 35所示，所述⑶R3_VH4的上游引物的堿基序列如SEQID N0:36所示，所述CDR3-VH5的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 37所示，所述CDR3_VH6的上游引物的堿基序列如SEQ ID勵(lì):38所示，所述^1?3-￥117的上游引物的堿基序列如SEQID NO:39 所示。
[0013]優(yōu)選地，所述設(shè)計(jì)至少一種下游引物的過程中，為根據(jù)BCR膜表面免疫球蛋白mIgG、mIgA、mIgM、mIgE或mlgD的C區(qū)基因序列的特征分別設(shè)計(jì)至少一種下游引物,分別得到 mlgG、mlgA、mlgM、mlgE 或 mlgD 下游引物。
[0014]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述mlgG的下游引物的序列如SEQ ID NO: 23所示，所述mlgA的下游引物的堿基序列如SEQ ID N0:24所示，所述mlgM的下游引物的堿基序列如SEQ ID NO:25所示，所述mlgE的下游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 26所示，所述mlgD下游引物的堿基序列如SEQ ID NO:27所示。
[0015]本發(fā)明通過在TCR或BCR的可變區(qū)(variable)基因設(shè)置上游引物序列，在TCR或BCR的連接區(qū)(joining) J基因或恒定區(qū)(constant) C基因設(shè)置下游引物序列，通過多重PCR擴(kuò)增出目的鏈的PCR產(chǎn)物構(gòu)建高通量測(cè)序文庫。本發(fā)明采用2個(gè)循環(huán)的多重PCR技術(shù)，相比采用25~30個(gè)循環(huán)，本發(fā)明提供的方法能充分發(fā)揮標(biāo)簽序列的功能，降低PCR引物擴(kuò)增偏好引入的測(cè)序誤差。
[0016]采用本發(fā)明帶標(biāo)簽序列的引物構(gòu)建高通量測(cè)序文庫時(shí)，2個(gè)循環(huán)的多重PCR尤為關(guān)鍵，因?yàn)檫M(jìn)行了 2個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增后，每個(gè)DNA分子已經(jīng)帶上獨(dú)特的標(biāo)簽，若再進(jìn)行擴(kuò)增，會(huì)使得帶該標(biāo)簽的DNA分子更換新的標(biāo)簽，從而無法追蹤該DNA分子在樣品中的初始情況；因此，設(shè)計(jì)帶標(biāo)簽的多對(duì)引物進(jìn)行多重PCR時(shí)，采用2次循環(huán)，若采用25~30個(gè)循環(huán)的多重PCR，將導(dǎo)致極高比例的擴(kuò)增錯(cuò)誤。
[0017]需要指明的是，本發(fā)明提供的多重PCR引物不帶標(biāo)簽時(shí)，也可以采用25~30個(gè)循環(huán)的多重PCR構(gòu)建高通量測(cè)序文庫。
[0018]編碼B淋巴細(xì)胞受體的基因位于不同的染色體上，其中，C基因片段編碼BCR重鏈和輕鏈的恒定區(qū)(C區(qū));輕鏈V基因和J基因編碼輕鏈可變區(qū)(V區(qū));重鏈V、J基因片段和D基因片段編碼重鏈可變區(qū)(V區(qū))。B淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟過程中，通過V (D)J基因組合、連接多樣性，以及體細(xì)胞高頻突變、基因轉(zhuǎn)換和類別轉(zhuǎn)換等途徑形成數(shù)量龐大且種類多樣的BCR受體庫。
[0019]當(dāng)在可變區(qū)(variable)基因的leader區(qū)設(shè)置上游引物序列時(shí)，可擴(kuò)增BCR全長，當(dāng)在可變區(qū)(variable)基因的CDR3區(qū)上游(即FR3區(qū))設(shè)置上游引物序列時(shí)，可擴(kuò)增BCR的CDR3區(qū)。本發(fā)明對(duì)BCR的V基因7大類家族ORF (分別為FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4)的同源性進(jìn)行了分析，并在V基因的leader區(qū)設(shè)計(jì)了 22條BCR上游引物，在⑶R3區(qū)上游設(shè)計(jì)了 12條BCR上游引物。
[0020]本發(fā)明的提供的全長上游引物序列(全長-Vh1、全長_VH2、全長_VH3、全長_VH4、全長_Vh5、全長_Vh6和全長_Vh7的上游引物)和下游引物序列(mlgG、mlgA、mlgM、mlgE或mlgD下游引物)配對(duì)，可覆蓋BCR輕重鏈V區(qū)的⑶R1、⑶R2和⑶R3三個(gè)高變區(qū)，三者均參與對(duì)抗原的識(shí)別，共同決定BCR的抗原特異性；本發(fā)明的提供的CDR3上游引物序列(CDR3-Vh1、CDR3-Vh2、CDR3-Vh3、CDR3_Vh4、CDR3_Vh5、CDR3_Vh6 和 CDR3_VH7 的上游引物)和下游引物序列(mlgG、mlgA、mlgM、 mlgE或mlgD下游引物)配對(duì),可對(duì)BCR的Q)R3高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序,該區(qū)是最重要的、研究最多BCR可變區(qū)。
[0021]本發(fā)明提供的BCR高通量測(cè)序文庫能獲得的長度和數(shù)量豐富的BCR序列，有利于BCR序列的多態(tài)性程度分析及BCR序列的長度多態(tài)性分布分析。
[0022]優(yōu)選地，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端分別包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列為由6~8個(gè)核苷酸序列組成的序列條碼，其中，所述序列條碼之間至少有一個(gè)核苷酸不同。
[0023]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的標(biāo)簽序列可以給待測(cè)樣品中的每個(gè)RNA分子或DNA分子都加上了一個(gè)標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列由ATCG四種基本堿基隨機(jī)組合，且所述標(biāo)簽序列互不相同，例如，標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè)時(shí)(本發(fā)明實(shí)施例中表示為8N標(biāo)簽序列)，可以獲得IO9個(gè)不同的標(biāo)簽序列組合；標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是七個(gè)時(shí)，可以獲得IO8個(gè)不同的標(biāo)簽序列組合；標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是六個(gè)時(shí)，可以獲得IO7個(gè)不同的標(biāo)簽序列組合，所述標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè)，或者七個(gè)，或者六個(gè)。
[0024]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的標(biāo)簽序列可以給待測(cè)樣品中的每個(gè)RNA分子或DNA分子都加上了一個(gè)標(biāo)簽序列。
[0025]由于二代測(cè)序存在固有的測(cè)序錯(cuò)誤(sequencing errors),因此有一些堿基會(huì)被讀錯(cuò)，對(duì)序列的判斷有影響。本發(fā)明采用的帶標(biāo)簽的多重PCR引物能降低高通量測(cè)序誤差，甚至能檢測(cè)出單個(gè)堿基突變。因?yàn)楫?dāng)帶有標(biāo)簽序列的引物進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增后，每個(gè)序列都帶上了不同于其它序列的標(biāo)簽序列，通過計(jì)算標(biāo)簽序列的個(gè)數(shù)就可以知道每種DNA片段在起始DNA混合物中的拷貝數(shù)，做到定量分析；此外，每個(gè)序列被PCR擴(kuò)增，經(jīng)過測(cè)序后，即可獲得每個(gè)DNA序列的多個(gè)測(cè)序結(jié)果，通過分析每個(gè)DNA序列的多個(gè)測(cè)序結(jié)果，確定正確的堿基序列，因此可以降低高通量測(cè)序的儀器、測(cè)序方法本身的系統(tǒng)誤差，從而提高測(cè)序的準(zhǔn)確性。
[0026]優(yōu)選地，所述通過分析每個(gè)DNA序列的多個(gè)測(cè)序結(jié)果，確定正確的堿基序列的步驟，包括:將所述DNA測(cè)序結(jié)果按照標(biāo)簽序列進(jìn)行分類整理，獲得屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果；比較所述屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)所述所有的DNA測(cè)序結(jié)果中每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次；判斷所述每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次是否達(dá)到預(yù)定的閾值；若達(dá)到預(yù)定的閾值，則確定所述屬于同一個(gè)DNA序列的所述位置的堿基，按照所述方法，即可確定所述屬于同一個(gè)DNA序列的所有位置的堿基。
[0027]優(yōu)選地，統(tǒng)計(jì)所述所有的DNA測(cè)序結(jié)果中每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次后，每個(gè)位點(diǎn)喊基是根據(jù)該位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率最聞?wù)叩暮盎_定的。
[0028]若待測(cè)樣品為RNA序列,基于同樣的原理,可以確定屬于同一個(gè)RNA序列的所有位
置的堿基。
[0029]特別要說明的是，本發(fā)明第三方面提供的檢測(cè)B淋巴細(xì)胞受體的方法以人的BCR為樣本，其僅為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例，除此以外，還可以根據(jù)需要選用鼠、斑馬魚等為樣本進(jìn)行引物序列設(shè)計(jì)。
[0030]優(yōu)選地，所述T淋巴 細(xì)胞受體(TCR)或B淋巴細(xì)胞受體(BCR)待測(cè)RNA序列為采用RNA試劑盒提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞的獲得的總RNA的序列。
[0031]第二方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，包括如下步驟:
[0032]取待測(cè)樣品；
[0033]采用mlgG、mlgA、mlgM、mlgE及mlgD下游引物與所述全長-Vh1、全長_VH2、全長_VH3、全長_VH4、全長_VH5、全長-Vh6和全長-Vh7的上游引物隨機(jī)組合成配對(duì)引物，然后進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增BCR全長；
[0034]將所得多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行建庫后進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得檢測(cè)結(jié)果。
[0035]優(yōu)選地，所述多重PCR反應(yīng)為2個(gè)循環(huán)的多重PCR反應(yīng)。
[0036]優(yōu)選地，所述全長-VhI的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 7所示，所述全長_VH2的上游引物的堿基序列如SEQ ID N0:8所示，所述全長-VH3的上游引物的堿基序列如SEQ ID N0:9~SEQ ID NO: 14所示，所述全長_VH4的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 15~SEQ ID NO: 18所示，所述全長_VH5的上游引物的堿基序列如SEQ IDNO: 19~SEQ ID NO: 20所示，所述全長_VH6的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 21所示，所述全長_Vh7的上游引物的堿基序列SEQ ID NO: 22所示。
[0037]優(yōu)選地，所述mlgG的下游引物的序列如SEQ ID NO: 23所示，所述mlgA的下游引物的堿基序列如SEQ ID N0:24所示，所述mlgM的下游引物的堿基序列如SEQ ID N0:25所示，所述mlgE的下游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 26所示，所述mlgD下游引物的堿基序列如SEQ ID NO:27所示。
[0038]當(dāng)所述取待測(cè)樣品為DNA樣品時(shí)，進(jìn)行多重PCR的體系參照普通實(shí)驗(yàn)室采用的體系進(jìn)行配置；當(dāng)所述取待測(cè)樣品為RNA樣品時(shí)，要先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再合成第二鏈DNA,此時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的步驟相當(dāng)于一個(gè)循環(huán)的多重PCR，合成第二鏈DNA的步驟也相當(dāng)于一個(gè)循環(huán)的多重PCR。
[0039]第三方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，包括如下步驟:
[0040]取待測(cè)樣品；
[0041]采用mlgG、mlgA、mlgM、mlgE 及 mlgD 下游引物與所述 CDR3_VH1、CDR3_VH2、CDR3-Vh3、CDR3-Vh4、CDR3-Vh5、CDR3-Vh6和CDR3_VH7的上游引物隨機(jī)組合成配對(duì)引物，然后進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增BCR⑶R3區(qū)；
[0042]將所得多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行建庫后進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得檢測(cè)結(jié)果。
[0043]優(yōu)選地，所述多重PCR反應(yīng)為2個(gè)循環(huán)的多重PCR反應(yīng)。
[0044]優(yōu)選地，所述CDR3-VH1的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 28~SEQ ID NO: 33所示，所述⑶R3-Vh2的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 34所示，所述⑶R3_VH3的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 35所示，所述⑶R3-VH4的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 36所示，所述⑶R3-Vh5的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 37所示，所述⑶R3_VH6的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:38所示，所述⑶R3-VH7的上游引物的堿基序列SEQ ID NO:39所示。
[0045]優(yōu)選地，所述 mlgG的下游引物的序列如SEQ ID NO: 23所示，所述mlgA的下游引物的堿基序列如SEQ ID N0:24所示，所述mlgM的下游引物的堿基序列如SEQ ID N0:25所示，所述mlgE的下游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 26所示，所述mlgD下游引物的堿基序列如SEQ ID NO:27所示。
[0046]當(dāng)所述取待測(cè)樣品為DNA樣品時(shí)，進(jìn)行多重PCR的體系參照普通實(shí)驗(yàn)室采用的體系進(jìn)行配置；當(dāng)所述取待測(cè)樣品為RNA樣品時(shí)，要先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再合成第二鏈DNA,此時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的步驟相當(dāng)于一個(gè)循環(huán)的多重PCR，合成第二鏈DNA的步驟也相當(dāng)于一個(gè)循環(huán)的多重PCR。
[0047]本發(fā)明第四方面提供了一種利用DNA標(biāo)簽序列以及高通量測(cè)序?qū)淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行定量分析的方法,包括:
[0048](I)提供或者制備M對(duì)TCR或BCR多重PCR引物
[0049]所述多重PCR引物的下游引物的5’端和上游引物的5’端分別包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列為由6~8個(gè)核苷酸序列組成的序列條碼，其中，所述序列條碼之間至少有一個(gè)核苷酸不同；
[0050](2 )取待測(cè)DNA樣品，采用步驟(1)所述M對(duì)TCR或BCR多重PCR弓丨物進(jìn)行2個(gè)循環(huán)的多重PCR，使得每條待測(cè)DNA序列帶上標(biāo)簽序列；或
[0051 ] 取待測(cè)RNA樣品，采用步驟(1)所述M對(duì)TCR或BCR多重PCR引物的上游引物和下游引物分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和cDNA第二鏈的合成反應(yīng)，得到帶上標(biāo)簽序列的DNA序列，其中，所述上游引物和下游引物為M條上游或下游引物的混合引物；
[0052](3)取步驟(2)得到的產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序；
[0053](4)生物信息學(xué)分析，對(duì)TCR或BCR進(jìn)行定量分析，方法如下:
[0054]帶相同標(biāo)簽的DNA來源于同一條DNA模板，計(jì)算同一條DNA所帶標(biāo)簽的種類，記為R，R即為該DNA在待測(cè)樣品中的條數(shù)；即可得該DNA在待測(cè)樣品中的初始含量。
[0055]第五方面，本發(fā)明提供了一種利用DNA標(biāo)簽序列矯正多重PCR的引物偏性的方法，包括以下步驟:
[0056](I)提供或制備M對(duì)TCR或BCR多重PCR引物
[0057]所述多重PCR引物的下游引物的5’端和上游引物的5’端分別包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列為由6~8個(gè)核苷酸序列組成的序列條碼，其中，所述序列條碼之間至少有一個(gè)核苷酸不同；
[0058](2)制備多重PCR的模板
[0059]提供或制備N種已知序列的TCR或BCR DNA片段，等摩爾比混合后作為多重PCR模板，其中，N大于M ；
[0060](3)多重 PCR
[0061 ] 取步驟(2 )制備的多重PCR模板，與步驟(1)提供的多重PCR引物進(jìn)行多重PCR，得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序；
[0062](4)生物信息學(xué)分析，矯正多重PCR的引物偏性，方法如下:
[0063](4a)帶相同標(biāo)簽的DNA來源于同一條DNA模板，計(jì)算出該DNA模板經(jīng)過多重PCR后測(cè)序得到的條數(shù)，記為Q，其中，第N種DNA模板經(jīng)過多重PCR后測(cè)序得到的條數(shù)為Qn ；
[0064](4b)任一選取2種`以上的DNA模板的Qn，如果Qn都相同，則說明對(duì)該序列進(jìn)行多重PCR的引物在擴(kuò)增時(shí)沒有偏性；反之，則有偏性，并判斷出現(xiàn)偏性的具體引物對(duì)。
[0065]優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述M對(duì)TCR或BCR多重PCR引物為⑶R3_VH1、⑶R3_VH2、CDR3-Vh3、CDR3-Vh4、CDR3_Vh5、CDR3_Vh6 和 CDR3_VH7 上游引物以及 mlgG、mlgA、mlgM、mlgE及mlgD下游引物隨機(jī)組合配對(duì)而成，其中，所述⑶R3-Vh1的上游引物的堿基序列如SEQ IDN0:28~SEQ ID NO:33所示，所述CDR3_VH2的上游引物的堿基序列如SEQ ID N0:34所示，所述⑶R3-Vh3的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 35所示，所述⑶R3_VH4的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:36所示，所述⑶R3-VH5的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:37所示，所述⑶R3-Vh6的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 38所示，所述⑶R3_VH7的上游引物的堿基序列SEQ ID NO: 39所示，所述mlgG的下游引物的序列如SEQ ID NO: 23所示，所述mlgA的下游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 24所示，所述mlgM的下游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 25所示，所述mlgE的下游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 26所示，所述mlgD下游引物的喊基序列如SEQ ID N0:27所不。
[0066]優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述N種已知序列的TCR或BCR DNA片段的制備方法為:
[0067]采用mlgG、mlgA、mlgM、mlgE及mlgD下游引物與所述全長-Vh1、全長_VH2、全長_VH3、全長_VH4、全長_VH5、全長-Vh6和全長-Vh7的上游引物隨機(jī)組合成配對(duì)引物，然后進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增BCR全長；
[0068]再將PCR產(chǎn)物通過TA克隆后插入質(zhì)粒載體，將所得質(zhì)粒載體進(jìn)行測(cè)序并篩選陽性克隆，得到高通量基因測(cè)序的對(duì)照文庫；
[0069]將所得對(duì)照文庫進(jìn)行序列分析并和IMGT數(shù)據(jù)庫中V、D和J區(qū)基因片段的胚系參考序列進(jìn)行比對(duì)，再將所得對(duì)照文庫按V、D和J區(qū)基因進(jìn)行歸類，得到N種質(zhì)?？寺?，所述N種質(zhì)?？寺“?N種已知序列的TCR或BCR DNA片段，即得N種已知序列的TCR或BCRDNA片段。[0070]本發(fā)明提供的一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法以及一種利用DNA標(biāo)簽序列矯正多重PCR的引物偏差的方法的有益效果為:(I)本發(fā)明提供的對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法能獲得豐富的TCR或BCR重排信息；本發(fā)明提供的全長BCR多重PCR引物以及BCR的CDR3多重PCR可分別用于構(gòu)建BCR全長高通量測(cè)序文庫以及BCR的CDR3區(qū)高通量測(cè)序文庫；(2)本發(fā)明提供的2個(gè)循環(huán)的多重PCR技術(shù)結(jié)合本發(fā)明的帶標(biāo)簽的多重PCR引物能獲得誤差更小的高通量測(cè)序信息；
(3)本發(fā)明提供的對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法對(duì)每一個(gè)待測(cè)TCR或BCR序列加上DNA標(biāo)簽序列，可以在高通量測(cè)序中實(shí)現(xiàn)TCR或BCR序列的定量分析并進(jìn)一步減少高通量測(cè)序誤差；(4)本發(fā)明提供的利用DNA標(biāo)簽序列矯正多重PCR的引物偏差的方法，該方法能進(jìn)一步降低高通量測(cè)序文庫構(gòu)建過程中由于引物序列對(duì)模板的擴(kuò)增偏好引入的誤差。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0071]圖1為本發(fā)明實(shí)施例6多重PCR所得的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0072]圖2~圖3為本發(fā)明實(shí)施例5所得序列的VDJ重組信息進(jìn)行分析的結(jié)果圖；
[0073]圖4為本發(fā)明實(shí)施例5所得序列經(jīng)過SN標(biāo)簽篩除重復(fù)計(jì)數(shù)的拷貝數(shù)后的分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0074]實(shí)施例1
[0075]本發(fā)明實(shí)施例1提供了一種B淋巴細(xì)胞受體(BCR)RNA樣品的制備方法，包括如下步驟:
[0076](I)收集健康人的新鮮外周血樣本各10毫升(ml)；
[0077](2)采用密度梯度離心原理(Ficoll密度為1.077，PBMC平均密度為1.072)，并通過反復(fù)離心洗滌，獲得相對(duì)較純的PBMC，步驟如下:
[0078]a.將步驟(1)所得血液用PBS或0.09%NaCl分別按1:1稀釋；
[0079]b.向15ml離心管中加入所得稀釋血液0.5倍體積的淋巴細(xì)胞分離液；
[0080]c.將步驟a所得稀釋血液緩慢加入步驟b所得的淋巴細(xì)胞分離液的表面，保持分離液和血液分層,然后用swing angle離心機(jī)離心,轉(zhuǎn)速600g,在下離心20min-25min,離心機(jī)加速/減速設(shè)置為4 (緩慢升降速);
[0081]d.輕柔收集淋巴細(xì)胞帶，置于新的15ml離心管(每人/I支)，并加PBS至5ml，操作時(shí)盡量避免吸到分離液及過多的血漿，然后在室溫下，以2500rpm，離心5min，離心機(jī)加速/減速設(shè)置為9，棄上清；
[0082]e.再向15ml離心管中加入5ml PBS，混勻使細(xì)胞重懸，然后在室溫下，以1800rpm，離心5min，離心機(jī)加速/減速設(shè)置為9，棄部分上清，保留Iml上清，然后混勻使細(xì)胞重懸，將細(xì)胞重懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管；
[0083]f.采用Qiagen Rneasy mini kit提取步驟e所得細(xì)胞的總RNA,并用Nanodrop2000 (Thermo)測(cè)定RNA的濃度及純度,然后保存總RNA。
[0084]實(shí)施例2[0085]本發(fā)明實(shí)施例2提供了一種采用BCR全長引物進(jìn)行2個(gè)循環(huán)的多重PCR，構(gòu)建BCR全長高通量測(cè)序文庫，進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，包括如下步驟:
[0086](I)將實(shí)施例1所得總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法如下:
[0087](1.1)冰上配置如下體系:
[0088]
【權(quán)利要求】
1.一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，其特征在于，包括M種上游引物和至少一種下游引物，所述M種上游引物的設(shè)計(jì)方法為:根據(jù)T淋巴細(xì)胞受體TCR或B淋巴細(xì)胞受體BCR的可變區(qū)V區(qū)基因序列的特征，分別設(shè)計(jì)M種與所述TCR或BCR的V區(qū)基因家族上游序列互補(bǔ)的上游引物，其中，所述M為自然數(shù)；所述至少一種下游引物的設(shè)計(jì)方法為:根據(jù)TCR或BCR的恒定區(qū)C區(qū)的基因序列的特征，設(shè)計(jì)至少一種與TCR或BCR的C區(qū)基因序列互補(bǔ)的下游引物，或根據(jù)TCR或BCR的連接區(qū)J區(qū)的基因序列的特征，設(shè)計(jì)至少一種與TCR或BCR的J區(qū)基因序列互補(bǔ)的下游引物。
2.如權(quán)利要求1所述的一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，其特征在于，所述設(shè)計(jì)M種上游引物的過程中，為根據(jù)BCR的VH1、Vh2、Vh3、Vh4、Vh5、Vh6和Vh7家族的leader區(qū)基因序列的特征分別設(shè)計(jì)至少一條上游引物，分別得到全長_VH1、全長_VH2、全長_VH3、全長_VH4、全長_VH5、全長-Vh6和全長_VH7的上游引物。
3.如權(quán)利要求2所述的一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，其特征在于， 所述全長-VhI的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 7所示， 所述全長_Vh2的上游引物的堿基序列如SEQ ID N0:8所示， 所述全長_Vh3的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:9~SEQ ID NO: 14所示， 所述全長_Vh4的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 15~SEQ ID NO: 18所示， 所述全長_Vh5的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 19~SEQ ID NO:20所示， 所述全長_Vh6的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:21所示， 所述全長_VH7的上游引物的堿基序列SEQ ID NO:22所示。
4.如權(quán)利要求1所述的一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，其特征在于，所述設(shè)計(jì)M種上游引物的過程中，為根據(jù)BCR的VH1、Vh2、Vh3、Vh4、Vh5、Vh6和Vh7家族的CDR3區(qū)上游的保守區(qū)FR3基因序列的特征分別設(shè)計(jì)至少一條上游引物，分別得到 CDR3-Vh1、CDR3-Vh2、CDR3-Vh3、CDR3-Vh4、CDR3-Vh5、CDR3-Vh6 和 CDR3_VH7 的上游引物。
5.如權(quán)利要求4所述的一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，其特征在于， 所述CDR3-Vh1的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:28~SEQ ID NO:33所示， 所述⑶R3-VH2的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 34所示， 所述⑶R3-Vh3的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:35所示， 所述⑶R3-Vh4的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:36所示， 所述⑶R3-Vh5的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:37所示， 所述⑶R3-Vh6的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:38所示， 所述⑶R3-VH7的上游引物的堿基序列SEQ ID NO:39所示。
6.如權(quán)利要求1所述的一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，其特征在于，所述設(shè)計(jì)至少一種下游引物的過程中，為根據(jù)BCR膜表面免疫球蛋白mIgG、mIgA、mIgM、mIgE或mlgD的C區(qū)基因序列的特征分別設(shè)計(jì)至少一種下游引物,分別得到 mlgG、mlgA、mlgM、mlgE 或 mlgD 下游引物。
7.如權(quán)利要求6所述的一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，其特征在于，所述mlgG的下游引物的序列如SEQ ID NO:23所示，所述mlgA的下游引物的堿基序列如SEQ ID N0:24所示，所述mlgM的下游引物的堿基序列如SEQ ID N0:25所示，所述mlgE的下游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 26所示，所述mlgD下游引物的堿基序列如SEQ ID NO:27所示。
8.如權(quán)利要求1所述的一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，其特征在于，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端分別包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列為由6~8個(gè)核苷酸序列組成的序列條碼，其中，所述序列條碼之間至少有一個(gè)核苷酸不同。
9.一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)取待測(cè)樣品； (2)采用mlgG、mlgA、mlgM、mlgE及mlgD下游引物與所述全長-Vh1、全長_VH2、全長_VH3、全長_VH4、全長_VH5、全長-Vh6和全長-Vh7的上游引物隨機(jī)組合成配對(duì)引物，然后進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增BCR全長；或 采用 mlgG、mlgA、mlgM、mlgE 及 mlgD 下游引物與所述 CDR3_VH1、CDR3_VH2、CDR3_VH3、CDR3-Vh4、CDR3-Vh5、CDR3_Vh6和CDR3_VH7的上游引物隨機(jī)組合成配對(duì)引物，然后進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增BCR CDR3區(qū)； (3)將所得多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行建庫后進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得檢測(cè)結(jié)果。
10.如權(quán)利要求9所述的一種對(duì)T淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，其特征在于，所述多重PCR反應(yīng)為2個(gè)循環(huán)的多重PCR反應(yīng)。
11.一種利用DNA標(biāo)簽序列以及高通量測(cè)序?qū)淋巴細(xì)胞受體或B淋巴細(xì)胞受體進(jìn)行定量分析的方法，其特征在于，包括: (I)提供或者制備M對(duì)TCR或BCR多重PCR弓丨物 所述多重PCR引物的下游引物的5’端和上游引物的5’端分別包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列為由6~8個(gè)核苷酸序列組成的序列條碼，其中，所述序列條碼之間至少有一個(gè)核苷酸不同； (2 )取待測(cè)DNA樣品，采用步驟(1)所述M對(duì)TCR或BCR多重PCR引物進(jìn)行2個(gè)循環(huán)的多重PCR，使得每條待測(cè)DNA序列帶上標(biāo)簽序列；或 取待測(cè)RNA樣品，采用步驟(1)所述M對(duì)TCR或BCR多重PCR弓丨物的上游引物和下游引物分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和cDNA第二鏈的合成反應(yīng)，得到帶上標(biāo)簽序列的DNA序列，其中，所述上游引物和下游引物為M條上游或下游引物的混合引物； (3)取步驟(2)得到的產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序； (4)生物信息學(xué)分析，對(duì)TCR或BCR進(jìn)行定量分析，方法如下: 帶相同標(biāo)簽的DNA來源于同一條DNA模板，計(jì)算同一條DNA所帶標(biāo)簽的種類，記為R，R即為該DNA在待測(cè)樣品中的條數(shù)；即可得該DNA在待測(cè)樣品中的初始含量。
12.一種利用DNA標(biāo)簽序列矯正多重PCR的引物偏差的方法，其特征在于，包括以下步驟: (I)提供或制備M對(duì)TCR或BCR多重PCR弓丨物 所述多重PCR引物的下游引物的5’端和上游引物的5’端分別包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列為由6~8個(gè)核苷酸序列組成的序列條碼，其中，所述序列條碼之間至少有一個(gè)核苷酸不同； (2)制備多重PCR的模板 提供或制備N種已知序列的TCR或BCR DNA片段，等摩爾比混合后作為多重PCR模板，其中，N大于M; (3)多重PCR 取步驟(2 )制備的多重PCR模板，與步驟(1)提供的多重PCR引物進(jìn)行多重PCR，得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序； (4)生物信息學(xué)分析，矯正多重PCR的引物偏性，方法如下: (4a)帶相同標(biāo)簽的DNA來源于同一條DNA模板，計(jì)算出該DNA模板經(jīng)過多重PCR后測(cè)序得到的條數(shù)，記為Q，其中，第N種DNA模板經(jīng)過多重PCR后測(cè)序得到的條數(shù)為Qn ； (4b)任一選取2種以上的DNA模板的Qn，如果Qn都相同，則說明對(duì)該序列進(jìn)行多重PCR的引物在擴(kuò)增時(shí)沒有偏性；反之，則有偏性，并判斷出現(xiàn)偏性的具體引物對(duì)。
13.如權(quán)利要求11所述的利用DNA標(biāo)簽序列矯正多重PCR的引物偏差的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述
M 對(duì) TCR 或 BCR 多重 PCR 引物為 CDR3_VH1、CDR3_VH2、CDR3_VH3、CDR3_VH4、CDR3_VH5、CDR3-Vh6和CDR3-Vh7上游引物以及mIgG、mIgA、mIgM、mIgE及mlgD下游引物隨機(jī)組合配對(duì)而成，其中， 所述CDR3-Vh1的上游·引物的堿基序列如SEQ ID NO:28~SEQ ID NO:33所示， 所述⑶R3-VH2的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 34所示， 所述⑶R3-Vh3的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:35所示， 所述⑶R3-Vh4的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:36所示， 所述⑶R3-Vh5的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:37所示， 所述⑶R3-Vh6的上游引物的堿基序列如SEQ ID NO:38所示， 所述⑶R3-VH7的上游引物的堿基序列SEQ ID NO:39所示， 所述mlgG的下游引物的序列如SEQ ID N0:23所示，所述mlgA的下游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 24所示，所述mlgM的下游引物的堿基序列如SEQ ID NO: 25所示，所述mlgE的下游引物的堿基序列如SEQ ID N0:26所示，所述mlgD下游引物的堿基序列如SEQ IDNO:27所示。
14.如權(quán)利要求11所述的利用DNA標(biāo)簽序列矯正多重PCR的引物偏差的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述N種已知序列的TCR或BCR DNA片段的制備方法為: 采用mlgG、mlgA、mlgM、mlgE及mlgD下游引物與所述全長-Vh1、全長_VH2、全長_VH3、全長_VH4、全長_VH5、全長-Vh6和全長-Vh7的上游引物隨機(jī)組合成配對(duì)引物，然后進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增BCR全長； 再將PCR產(chǎn)物通過TA克隆后插入質(zhì)粒載體，將所得質(zhì)粒載體進(jìn)行測(cè)序并篩選陽性克隆，得到高通量基因測(cè)序的對(duì)照文庫； 將所得對(duì)照文庫進(jìn)行序列分析并和IMGT數(shù)據(jù)庫中V、D和J區(qū)基因片段的胚系參考序列進(jìn)行比對(duì)，再將所得對(duì)照文庫按V、D和J區(qū)基因進(jìn)行歸類，得到N種質(zhì)?？寺?，所述N種質(zhì)?？寺“?N種已知序列的TCR或BCR DNA片段，即得N種已知序列的TCR或BCR DNA片段。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103710454SQ201310752881
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】徐瑩, 李周芳, 童寅, 張萌, 葛良進(jìn), 賀建奎 申請(qǐng)人:南方科技大學(xué), 深圳市瀚?；蛏锟萍加邢薰?br>