煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用，該煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體由序列表中的序列2經(jīng)點(diǎn)突變所得，所述點(diǎn)突變?yōu)樵谠撔蛄械牡?19位，第149位及第59位的至少一個突變。本發(fā)明通過對煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶基因序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，最終獲得具有高催化活性的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體。且該突變體可通過簡單的純化方案進(jìn)行高效率的純化，降低了NAD生產(chǎn)成本，提高了相應(yīng)產(chǎn)品的市場競爭力。
【專利說明】煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]煙酸胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide,縮寫 NAD),也稱氧化型輔酶I。是一種轉(zhuǎn)遞質(zhì)子(更準(zhǔn)確來說是氫離子)的輔酶，它出現(xiàn)在細(xì)胞很多代謝反應(yīng)中。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一種基本的氧化還原輔酶，不論是在呼吸作用還是光合作用過程，它都起著核心樞紐作用。另外，NADH不能直接為分子態(tài)氧所氧化，但能通過NADH脫氫酶的作用進(jìn)行脫氫變成MD。在呼吸鏈中，通過這種作用，可使黃素、醌、細(xì)胞色素等逐步被還原，最后氧被還原成水。這種以NAD為媒介的底物被O2所氧化的途徑，是好氧生物的主要有機(jī)物的氧化途徑。
[0003]目前，工業(yè)界、醫(yī)藥界或作為生化試劑使用的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)基本上是通過酵母菌發(fā)酵而來。
[0004]煙酰胺腺嘌呤二核苷酸也可通過體外酶催化轉(zhuǎn)化法制備。體外酶催化轉(zhuǎn)化法是將細(xì)菌表達(dá)的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(Nicotinamide mononucleotideadeny Iy I transferase, Nmnat)在體外將前體煙酰胺單核苷酸(NMN)和三磷酸腺苷(ATP)催化合成NAD，如呂小群等(2010年，笫二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，笫31卷笫II期，笫1251-1254頁)描述了一種 體外酶催化生產(chǎn)NAD的方法。在呂小群等描述的方法中，煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶需用鎳凝膠柱純化，成本較高，從而增加NAD的生產(chǎn)成本。若用煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶粗提物，又因粗提物中存在大量其它可降解ATP和煙酰胺單核苷酸的酶，令昂貴的前體ATP和煙酰胺單核苷酸大量消耗，從而增加NAD的生產(chǎn)成本。
[0005]因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用，旨在解決目前煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶純化效率及催化活力低，NAD生產(chǎn)成本高的問題。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其中，由序列表中的序列2經(jīng)點(diǎn)突變所得，所述點(diǎn)突變?yōu)樵谠撔蛄械牡?19位，第149位及第59位的至少一個突變。
[0008]所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其中，所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體還包括其變體，其中包括所述序列2所示氨基酸序列中除第119位、第149位和第59位外的其它位點(diǎn)的保守取代形式、增加或缺失一個或幾個氨基酸形式、氨基端截斷形式、羧基端截斷形式，及所述序列2的部分或全部串聯(lián)重復(fù)形式。
[0009]所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其中，所述點(diǎn)突變具體為:所述序列2的第119位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼帷?br> [0010]所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其中，所述點(diǎn)突變具體為:所述序列2的第149位的天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?br> [0011]所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其中，所述點(diǎn)突變具體為:所述序列2的第59位的絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸。
[0012]所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其中，所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體具有如序列表中序列3、序列4或序列5所示的氨基酸序列。
[0013]一種編碼如上所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體的基因，其中，所述基因由序列表中序列I所示的核苷酸序列經(jīng)定點(diǎn)突變所得。
[0014]一種如上所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體的應(yīng)用，其中，所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體用于以三磷酸腺苷和煙酰胺單核苷酸為底物制備煙酰胺腺嘌呤
二核苷酸。
[0015]有益效果:本發(fā)明提供一種煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用，通過對煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶基因序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，最終獲得具有高催化活性的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體。且該突變體可通過簡單的純化方案進(jìn)行高效率的純化，降低了 NAD生產(chǎn)成本，提高了相應(yīng)產(chǎn)品的市場競爭力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶親本與突變體F119Y之聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。`
【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明提供一種煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0018]本發(fā)明提供一種煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其中，由序列表中的序列2(親本序列)經(jīng)點(diǎn)突變所得，所述點(diǎn)突變?yōu)樵谠撔蛄械牡?19位，第149位及第59位的至少一個突變。
[0019]另外，所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體還包括其變體，其中包括所述序列2所示氨基酸序列中除第119位、第149位和第59位外的其它位點(diǎn)的保守取代形式、增加或缺失一個或幾個氨基酸形式、氨基端截斷形式、羧基端截斷形式，及所述序列2的部分或全部串聯(lián)重復(fù)形式。
[0020]較佳實(shí)施例中，所述親本序列中的第119位的苯丙氨酸(Phe)突變?yōu)槔野彼?Tyr);所述親本序列中的第149位的天冬氨酸(Asp)突變成谷氨酸(Glu);和/或所述親本序列中的第59位的絲氨酸(Ser)突變成蘇氨酸(Thr)。經(jīng)上述定點(diǎn)突變后，所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體的具體實(shí)施例具有如序列表中序列3、序列4或序列5所示的氨基酸序列。
[0021]本發(fā)明還提供一種編碼所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體的基因的DNA，所述基因的DNA由序列表中序列I所示的核苷酸序列經(jīng)定點(diǎn)突變所得，。通過該基因的DNA可轉(zhuǎn)錄表達(dá)所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體。主要得到的是序列表中序列3、序列4或序列5所示的氨基酸序列。該煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體可用于以三磷酸腺苷(ATP)和煙酰胺單核苷酸為底物制備煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。[0022]所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體的制備的大致過程為:首先構(gòu)建含有親本煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶基因的載體質(zhì)粒，然后設(shè)定定點(diǎn)突變的位點(diǎn)以及突變后的氨基酸種類，再合成適當(dāng)?shù)囊?，以所述的含親本煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶基因的載體質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增DNA片段、裝配所擴(kuò)增的DNA片段以及PCR擴(kuò)增全長突變基因。然后將該全長突變基因克隆到適當(dāng)?shù)妮d體上并轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)篩選出具有煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性的陽性克隆。最后從陽性克隆中提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行DNA序列測定分析，以確定引入的突變，在確定目的片段插入到載體上后，可通過LB培養(yǎng)基篩選，從而獲得一系列耐熱并具高催化活性的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體。上述描述中，其中，親本是指來自Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661 (詹氏甲燒球菌屬)的煙酸胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(Nmnat)，其核苷酸序列如序列I所示(參考GenBank L77117)，氨基酸序列如序列2所示(參考GenBank NP_247520)
在上述制備方法中，所采用的載體可以為原核表達(dá)載體，如pRSET和pES21等；可以為克隆載體，如 PUC18/19 和 pBluscript-SK。
[0023]進(jìn)一步的，所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體基因可以在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)，當(dāng)然也可在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞胞外表達(dá)。
[0024]進(jìn)一步地,所述載體的宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。所述原核細(xì)胞可以為大腸桿菌。所述真核細(xì)胞可以為釀酒酵母或畢赤巴斯德酵母。
[0025]該突變體可以通過低成本的熱處理純化方案進(jìn)行純化，例如將本發(fā)明突變體粗提物經(jīng)70°C熱處理10分鐘后離心收集上清液，即為部分純化的酶。并且經(jīng)上述熱處理純化的突變體仍具有高的催化活性，總的來看，本發(fā)明的突變體具有比親本高出至少50%的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶催化活性。
[0026]另外，本發(fā)明提供的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體的較高催化活性使其可以未經(jīng)純化以粗酶形式使用，也可以是經(jīng)部分純化的或完全純化的酶。當(dāng)然，還可利用固化技術(shù)將本發(fā)明煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體制成固相酶或固相細(xì)胞形式的固化酶。
[0027]在本申請文本中所用的氨基酸三字母或單字母表達(dá)方式，采用IUPAC規(guī)定的氨基酸代碼(Eur.J.Biochem., 138:9-37，1984)。
[0028]以下用具體的實(shí)施例對本發(fā)明制備的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體及其性能進(jìn)行說明。下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。
[0029]實(shí)施例1
煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶編碼基因的擴(kuò)增與克隆:
根據(jù)基因庫(GenBank NP_247520)基因序列設(shè)計引物btmj-F和btmj-R (如表1所示)。用引物對 btmj-F 和 btmj-R 從 Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661 中擴(kuò)增煙酸胺
單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶編碼基因。
[0030]其擴(kuò)增條件為:20mM Tris-HCl (pH 8.8)，10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4,2 mMMgSO4,0.1% Triton X-100,50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP，400 nM引物 btmj-F, 400 nM 引物 btmj-R, 1.0 U Pfu DNA 聚合酶(Promega, USA),用接種環(huán)挑取少許Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661菌體，再用無菌水調(diào)整反應(yīng)體積至50 ml。
[0031]PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為:95°C 3分鐘，35圈循環(huán):95°C 50秒、50°C 30秒和72°CI分鐘，最后72°C 10分鐘。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI酶切后與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI酶切的載體pRSET-A (源自Invitrogen，USA)連接，得質(zhì)粒pRSET-btmj。經(jīng)DNA測序，確定該被克隆的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列，具體示于序列表中序列1，相應(yīng)的氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0032]表1
【權(quán)利要求】
1.一種煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于，由序列表中的序列2經(jīng)點(diǎn)突變所得，所述點(diǎn)突變?yōu)樵谠撔蛄械牡?19位，第149位及第59位的至少一個突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于，所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體還包括其變體，其中包括所述序列2所示氨基酸序列中除第119位、第149位和第59位外的其它位點(diǎn)的保守取代形式、增加或缺失一個或幾個氨基酸形式、氨基端截斷形式、羧基端截斷形式，及所述序列2的部分或全部串聯(lián)重復(fù)形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于，所述點(diǎn)突變具體為:所述序列2的第119位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼帷?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于，所述點(diǎn)突變具體為:所述序列2的第149位的天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于，所述點(diǎn)突變具體為:所述序列2的第59位的絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于，所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體具有如序列表中序列3、序列4或序列5所示的氨基酸序列。
7.一種編碼如權(quán)利要求1-6任一項所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體的基因，其特征在于，所述基因由序列表中序列I所示的核苷酸序列經(jīng)定點(diǎn)突變所得。
8.—種如權(quán)利要求1-6任一項 所述的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體的應(yīng)用，其特征在于，所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體用于以三磷酸腺苷和煙酰胺單核苷酸為底物制備煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。
【文檔編號】C12N15/54GK103710321SQ201310752930
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】傅榮昭 申請人:邦泰生物工程(深圳)有限公司