一種重組腺病毒rAd-ORF2-TCE及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組腺病毒rAd-ORF2-TCE，其是將PCV2的免疫原性蛋白基因ORF2與三個(gè)T細(xì)胞表位串聯(lián)基因TCE融合連接后重組至腺病毒載體獲得的；本發(fā)明還涉及重組腺病毒rAd-ORF2-TCE在豬病毒性免疫疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的重組腺病毒rAd-ORF2-TCE能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平特異性抗體以及刺激機(jī)體產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞增殖，血清中IFN-γ以及IL-2濃度均獲得顯著性提高，與單獨(dú)PCV2的ORF2相比，動(dòng)物機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫水平均獲得顯著性提高。
【專利說明】—種重組腺病毒rAd-0RF2-TCE及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種重組腺病毒rAd-0RF2-TCE及其應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)是斷奶后仔豬系統(tǒng)消耗綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(porcinedermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、仔豬先天性震顫及豬呼吸道疾病等的主要致病因素。PCV2屬于圓環(huán)病毒科，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。PCV2無(wú)囊膜，呈二十面對(duì)稱體，直徑約17nm，該病毒包含有11個(gè)開放讀碼框，其中ORFl和0RF2是2個(gè)最大的編碼框。ORFl編碼病毒的復(fù)制蛋白R(shí)印和R印，，這2種蛋白與病毒的復(fù)制密切相關(guān)。0RF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白包含有病毒特異類型抗原表位，能夠誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫以抵抗PCV2的感染，因此衣殼蛋白(capsid protein, Cap)已經(jīng)廣泛用于血清學(xué)診斷及作為最佳的目的抗原來設(shè)計(jì)疫苗以抵抗PCV2相關(guān)疾病。目前，PCV2相關(guān)疾病仍然是養(yǎng)豬業(yè)中流行最為廣泛的疾病之一，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管目前已經(jīng)有多種商品PCV2疫苗上市，這些疫苗在很大的程度上有效控的控制PCV2感染，但是PCV2相關(guān)疾病依然流行，因?yàn)檫@些疫苗并不能完全阻止PCV2的感染和傳播。因此有必要研究更為有效的疫苗來控制PCV2相關(guān)疾病。
[0003]表位疫苗是以抗原上某些特定表位為基礎(chǔ)制備的疫苗，主要包括表達(dá)自身蛋白的亞單位表位疫苗、合成肽疫苗、重組表位疫苗、表位核酸疫苗等。目前該種類型的疫苗已經(jīng)成為研制感染性疾病、惡性腫瘤以及自身免疫性疾病等疫苗的新設(shè)計(jì)方向。為了克服由于抗原表位結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分子量小，單獨(dú)使用時(shí)免疫原性較弱，且在體內(nèi)容易被降解，很難引起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答而獲得長(zhǎng)期的免疫效果的缺陷，本研究通過基因工程的方法將Stevenson等已鑒定的PCV20RF1和0RF3上3個(gè)具有免疫優(yōu)性的T細(xì)胞表位基因進(jìn)行串聯(lián)后與保護(hù)性抗原基因0RF2融合表達(dá)，期望`融合表達(dá)蛋白能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平中和抗體以及能夠增強(qiáng)靶動(dòng)物的體液免疫和細(xì)胞免疫水平。
[0004]細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)在清除病毒感染過程中發(fā)揮了重要的作用，近年來，PCV20RF1和0RF3的具有免疫顯性的T細(xì)胞表位已經(jīng)被鑒定。Stevenson等研究PCV2T細(xì)胞抗原表位(T lymphocyte epitope, TCE)時(shí)，采用合成線性的含有20aa的多肽,通過動(dòng)物試驗(yàn)測(cè)定它們誘導(dǎo)外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞中T淋巴細(xì)胞的增殖能力，篩選獲得了 3個(gè)具有免疫優(yōu)勢(shì)的多肽片段，分別是由PCV20RF1編碼的2個(gè)多肽(第81~100位和201~220位氨基酸)，由PCV20RF3編碼的另一個(gè)多肽(第31~50位氨基酸)。另外Stevenson等(2007)的研究還發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞反應(yīng)主要是針對(duì)PCV2的ORFl和0RF3基因編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白。目前大量研究結(jié)果表明，具有保護(hù)性抗原基因與多表位基因融合具有協(xié)同作用，能誘導(dǎo)更好的體液免疫和細(xì)胞免疫。因此，如何構(gòu)建具有良好免疫原性的T細(xì)胞表位基因表達(dá)載體，生產(chǎn)更有效的疫苗來控制PCV2相關(guān)疾病是一個(gè)亟需解決的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種重組腺病毒rAd-0RF2-TCE，其是將PCV2的免疫原性蛋白基因0RF2與人工化學(xué)法合成的具有免疫顯性的三個(gè)T細(xì)胞表位串聯(lián)基因TCE (位于PCV2的ORFl基因81_100aa，201_220aa區(qū)域和位于PCV2的0RF3基因上31-50aa區(qū)域)融合連接后重組至腺病毒載體后獲得，該重組腺病毒rAd-0RF2-TCE在提高T淋巴細(xì)胞增殖水平及特異性抗體表達(dá)的同時(shí)，還可以顯著提高細(xì)胞因子IFN- Y、IL-2的含量，具有更好的免疫效果。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案提供一種重組腺病毒rAd-0RF2_TCE，其是將PCV2的免疫原性蛋白基因0RF2與TCE基因融合連接后重組至腺病毒載體獲得的。
[0007]本發(fā)明首要的問題是闡明PCV-0RF2與TCE基因至腺病毒載體后的成功表達(dá)及其免疫學(xué)活性。因此，腺病毒穿梭載體的成功構(gòu)建成為本研究是否成功的關(guān)鍵和前提條件。我們?cè)诳偨Y(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，將重疊延伸PCR法將PCV-0RF2基因與TCE基因通過疏水甘氨酸接頭進(jìn)行PCR擴(kuò)增融合，取得兩個(gè)基因同時(shí)高效表達(dá)的效果。
[0008]本發(fā)明的重組腺病毒rAd-0RF2-TCE，采用重疊延伸PCR法將0RF2基因與TCE基因通過疏水甘氨酸接頭進(jìn)行PCR擴(kuò)增融合，得到如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，再重組至腺病毒載體。該融合基因重組腺病毒后轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，在該細(xì)胞中融合表達(dá)，使豬圓環(huán)病毒的0RF2基因的免疫原性加強(qiáng)，能夠有效提高動(dòng)物機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫水平。
[0009]本發(fā)明的重組腺病毒rAd-0RF2_TCE，具體的一種構(gòu)建過程可如下述:以細(xì)胞培養(yǎng)物中抽提的PCV2基因組DNA作模板，PCR擴(kuò)增出0RF2基因，以人工化學(xué)法合成TCE基因，然后分別將這兩個(gè)基因克隆到pMD18-T Simple Vector中并鑒定；再采用重疊延伸PCR法將0RF2和TCE基因通過疏水甘氨酸接頭進(jìn)行PCR擴(kuò)增融合，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后定向克隆至pShuttle-CMV，獲得重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體pShuttle-CMV-0RF2-TCE。將獲得的轉(zhuǎn)移載體pShuttle-CMV-0RF2-TCE經(jīng)線性化后，轉(zhuǎn)化攜帶腺病毒載體骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，再抽提同源重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH`5a感受態(tài)細(xì)胞，再抽提無(wú)內(nèi)毒素同源重組質(zhì)粒，線性化后在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞得所述重組腺病毒rAd-0RF2-TCE，重組腺病毒rAd-0RF2-TCE經(jīng)過至少3輪噬斑純化。獲得的重組腺病毒rAd-0RF2_TCE作為在豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的疫苗。
[0010]本發(fā)明將PCV2的主要免疫原性蛋白0RF2與TCE基因融合后在腺病毒中成功表達(dá)，獲得的重組腺病毒rAd-0RF2-TCE免疫小鼠試驗(yàn)，結(jié)果表明該重組腺病毒rAd-0RF2_TCE能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平特異性抗體以及刺激機(jī)體產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞增殖，血清中IFN- Y以及IL-2濃度均獲得顯著性提高，與單獨(dú)PCV2的0RF2相比，動(dòng)物機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫水平均獲得顯著性提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是本發(fā)明實(shí)施例轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建過程；
[0012]圖2是0RF2-linker的擴(kuò)增結(jié)果，其中M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000; 1:陰性對(duì)照；2-4:0RF2-1 inker 基因的 PCR 產(chǎn)物；
[0013]圖3是Iinker-TCE基因的擴(kuò)增結(jié)果，其中M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；1:陰性對(duì)照；2-4 =TCE-1inker 基因的 PCR 產(chǎn)物；[0014]圖4是0RF2-TCE的擴(kuò)增結(jié)果，其中M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ; 1-4:0RF2_TCE基因的PCR產(chǎn)物；5:陰性對(duì)照；
[0015]圖5是重組質(zhì)粒PMD18-T-0RF2-TCE的Bgl I1、Hind III雙酶切鑒定結(jié)果，其中M =DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ； 1-3:pMD18T-0RF2_TCE的雙酶切產(chǎn)物；4:重組質(zhì)粒PMD18-T-0RF2-TCE ；
[0016]圖6 是重組質(zhì)粒 pShuttle-CMV-0RF2_TCE 的 Bgl I1、Hind III 雙酶切鑒定，其中 M:DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL5000 ; 1-2:重組質(zhì)粒 pShuttle-CMV-0RF2_TCE ;3_4:pShuttle-CMV-0RF2-TCE 的雙酶切產(chǎn)物；
[0017]圖7是本發(fā)明實(shí)施例重組載體的構(gòu)建過程；
[0018]圖8是重組質(zhì)粒pAd-CMV-0RF2_TCE的Pac I酶切鑒定，其中Ml:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL15000 ；1-4:pAd-0RF2-TCE 的 Pac I 酶切產(chǎn)物；5_6:重組質(zhì)粒 pAd-0RF2_TCE ；
[0019]圖9是pAd-CMV-0RF2-TCE轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞后出現(xiàn)的CPE，其中A:有CPE的AD293細(xì)胞正常AD293細(xì)胞；
[0020]圖10是重組腺病毒rAd-CMV-0RF2-TCE的一步法RT-PCR鑒定，其中M =DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ;2，3代表第2代病毒；5，6代表第5代病毒；8，9代表第10代病毒。2，5，8以Pl和P4為引物，3，6，9以P3和P4為引物；2，5，8是0RF2-TCE—步法RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3，6，9是TCE基因一步法RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0021]圖11是rAd-CMV-0RF2_TCE表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定，其中1-2:重組腺病毒rAd-0RF2-TCE轉(zhuǎn)染的AD293細(xì)胞；3:感染無(wú)外源基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染的AD293細(xì)胞；M:預(yù)染彩虹低分子標(biāo)準(zhǔn)蛋白Maker;
[0022]圖12是間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，其中A:重組腺病毒轉(zhuǎn)染的AD293細(xì)胞；B:正常細(xì)胞；
[0023]圖13是免疫小鼠后抗體檢測(cè)水平，其中上標(biāo)字母“a”表示在同一時(shí)期與其他組比較抗體增長(zhǎng)水平差異顯著(p〈0.05)；
[0024]圖14是小鼠外周血⑶3+T淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化結(jié)果，其中同一組上標(biāo)不同字母表示差異顯著(P〈0.05)；
[0025]圖15是小鼠外周血⑶4+T淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化結(jié)果，其中同一組上標(biāo)不同字母表示差異顯著(P〈0.05)；
[0026]圖16是小鼠外周血⑶8+T淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化結(jié)果，其中同一組上標(biāo)不同字母表示差異顯著(P〈0.05)。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0028]一、重組腺病毒rAd-0RF2_TCE轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
[0029]參照NCBI已發(fā)表的PCV20RF2基因序列與人工合成的TCE的基因序列，應(yīng)用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)了以下兩對(duì)引物，由上海英俊公司合成，用于擴(kuò)增目的基因片段。
[0030]Pl (如 SEQ ID N0.2 所示):5~GAAGATCTATGACGTATCCAAGGAGGCG~3 為 0RF2 上游引物，劃線部分為Bgl II酶切位點(diǎn)；
[0031]P2 (如 SEQ ID N0.3 所示):5-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCAGGGTTAAGTGGGGGGTCT-3為0RF2下游引物，劃線部分為編碼15個(gè)氨基酸的疏水性多肽(Gly4Ser) 31inker 序列；
[0032]P3 (如 SEQ ID N0.4 所示):5-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCATGTGCCACATCGAGAAAGC-3為TCE上游引物，劃線部分與P2的linker序列反向互補(bǔ)；
[0033]P4 (如 SEQ ID N0.5 所示):5~CCCAAGCTTTTAGGGAAAATGCAGAAGCG~3 為 TCE 下游引物，其中劃線部分為Hind III酶切位點(diǎn)。
[0034]以細(xì)胞培養(yǎng)物中抽提的PCV2基因組DNA作模板，PCR擴(kuò)增出0RF2基因，以人工合成的TCE的基因序列，通過PCR法獲得TCE基因，然后分別將這兩個(gè)基因克隆到PMD18-TSimple Vector中并鑒定。采用重疊延伸PCR法將0RF2和TCE基因通過疏水甘氨酸接頭進(jìn)行PCR擴(kuò)增融合得融合基因0RF2-TCE SEQ ID N0.1，核苷酸序列如下:
[0035]ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACGCACGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAGGCGAACCACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCCGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTATGGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCTGCCACATCGAGAAAGCGAAAGGAACAGATCAGCAGAATAAAGAATACTGCAGTAAAGAAGGTGGCAAGTGGTGGGATGGTTACCATGGTGAAGAAGTGGTTGTTATTGATGACTTTTATGGCTGGGGTGGCCCCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTGGTCTTCCAATCACGCTTCTGCATTTTCCCTAA`[0036]0RF2-TCE融合基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后定向克隆至pShuttle-CMV，獲得pShuttle-CMV-0RF2-TCE。具體過程如圖1和下述。
[0037]1、0RF2-TCE融合基因的擴(kuò)增
[0038]以P-0RF2，P-TCE為模板，對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳，得到分別為744bp (699+45)，198bp的條帶，見圖2，3。以0RF2-1 inker, TCE-1inker為模板，采用重疊延伸PCR法將0RF2和TCE基因通過疏水甘氨酸接頭進(jìn)行PCR擴(kuò)增融合得融合基因0RF2-TCE并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳，得到條帶為942bp，見圖4。
[0039]2、0RF2-TCE 基因的 T/A 克隆
[0040]Bgl II ,Hind III雙酶切重組質(zhì)粒pMD18_T-0RF2_TCE，結(jié)果獲得大小約為2692bp及942bp的兩個(gè)片段，見圖5。
[0041]3、重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體pShuttle-CMV-0RF2_TCE的構(gòu)建
[0042]Bgl I1、Hind III雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-0RF2_TCE結(jié)果均獲得大小近7500bp和942bp的兩個(gè)片段，見圖6。
[0043]二、重組腺病毒載體pAd-CMV-0RF2-TCE構(gòu)建和重組腺病毒rAd-0RF2_TCE的獲取
[0044]將獲得的轉(zhuǎn)移載體pShuttle-CMV-0RF2-TCE經(jīng)線性化后，轉(zhuǎn)化攜帶腺病毒載體骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，再抽提同源重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，再抽提無(wú)內(nèi)毒素同源重組質(zhì)粒，線性化后在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞得所述重組腺病毒rAd-0RF2-TCE。具體過程見圖7及下述。
[0045]1、重組腺病毒載體pAd-CMV-0RF2_TCE的構(gòu)建
[0046]菌液PCR鑒定檢測(cè)到大小約為942bp的基因片段，抽提同源重組質(zhì)粒pAd-CMV-0RF2-TCE，用Pac I酶切得到約23kb、4.5kb兩個(gè)片段見圖8，與預(yù)期的酶切片段大小相符，重組腺病毒載體pAd-CMV-0RF2-TCE構(gòu)建成功。
[0047]2、重組腺病毒載體pAd-CMV-0RF2_TCE的包裝及鑒定
[0048]將Pac I線性化后的重組腺病毒pAd-CMV-0RF2_TCE轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，IOd左右細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)，而對(duì)照未見有明顯變化(圖9)。重組病毒液處理后，PCR擴(kuò)增及從重組病毒液提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，分別P1/P4和P3/P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出與0RF2-TCE、TCE長(zhǎng)度相符的片段既大小約942bp，198bp的片段，見圖10。
[0049]3、Western blot:處理的病毒儲(chǔ)液經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)印顯色，重組腺病毒rAd-CMV-0RF2-TCE在約65ku處有一條明顯的條帶，而正常的AD293細(xì)胞對(duì)照則沒有(圖11所示)，說明重組腺病毒在細(xì)胞中得到了表達(dá)。
[0050]4、間接免疫熒光試驗(yàn):通過間接免疫熒光試驗(yàn)，接種pAd-CMV-0RF2_TCE的細(xì)胞發(fā)出明顯的綠色熒光，而正常細(xì)胞對(duì)照則無(wú)，見圖12。
[0051]5、重組腺病毒的TCID5tl的測(cè)定用DMEM維持液將純化后的第5代病毒作10倍梯度稀釋，由10_3稀釋到10_13，分別接種于長(zhǎng)滿AD293細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔100微升，同時(shí)設(shè)定8孔對(duì)照孔。5%C02，37°C靜置培養(yǎng)7d，觀察病變，按Reed-Muench 法，計(jì)算病毒 TCID5tl 為 IOia 2/ml。
[0052]6、動(dòng)物試驗(yàn):取SPF級(jí)PCV-2抗``體陰性6-8周齡BALB/c小鼠，隨機(jī)分成4組，每組15只。接種重組腺病毒病毒量為IO8TCID5tl，其中第I組為實(shí)驗(yàn)組接種重組腺病毒rAd-0RF2-TCE,第2組接種重組腺病毒rAd_0RF2，第3組接種腺病毒空載體，第4組注入DMEM培養(yǎng)基，均為肌肉注射。在初次免疫后第2周，加強(qiáng)免疫一次。分別于首次免疫后7天,14天,21天,28天,35天,42天采血，分離血清，用間接ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)檢測(cè)PCV2特異性抗水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定，雙抗夾心ELISA法檢測(cè)血清細(xì)胞因子IFN-Y，IL-2的含量。分別見圖13，14，15，16以及下表1和表2。結(jié)果表明，本發(fā)明重組腺病毒能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平特異性抗體以及刺激機(jī)體產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞增殖，血清中IFN- Y以及IL-2濃度均獲得顯著性提高，與單獨(dú)PCV2的0RF2相比，動(dòng)物機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫水平均獲得顯著性提高。
[0053]表1.不同時(shí)期血清中IFN-Y的濃度
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種重組腺病毒rAd-0RF2-TCE，其特征在于，其是將PCV2的免疫原性蛋白基因0RF2與三個(gè)T細(xì)胞表位串聯(lián)基因TCE融合連接后重組至腺病毒載體獲得的。
2.如權(quán)利要求1所述的重組腺病毒rAd-0RF2-TCE，其特征在于，所述0RF2基因以細(xì)胞培養(yǎng)物中抽提的PCV2基因組DNA作模板，PCR擴(kuò)增獲得；所述TCE基因是參照GeneBank發(fā)表的PCV2基因序列，以人工化學(xué)法合成。
3.如權(quán)利要求2所述的重組腺病毒rAd-0RF2-TCE，其特征在于，所述0RF2基因和TCE基因分別克隆到PMD18-T Simple Vector中并進(jìn)行鑒定。
4.如權(quán)利要求3所述的重組腺病毒rAd-0RF2-TCE，其特征在于，其是采用重疊延伸PCR法將0RF2基因與TCE基因通過疏水甘氨酸接頭進(jìn)行PCR擴(kuò)增融合，得到如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，再重組至腺病毒載體獲得的。
5.如權(quán)利要求4所述的重組腺病毒rAd-0RF2-TCE，其特征在于，重組腺病毒rAd-0RF2-TCE獲得過程中，SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后定向克隆至pShuttle-CMV，獲得重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體pShuttle-CMV-0RF2-TCE。
6.如權(quán)利要求5所述的重組腺病毒rAd-0RF2-TCE，其特征在于，重組腺病毒獲得過程中，將獲得的轉(zhuǎn)移載體pShuttle-CMV- 0RF2-TCE經(jīng)線性化后，轉(zhuǎn)化攜帶腺病毒載體骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，再抽提同源重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，再抽提無(wú)內(nèi)毒素同源重組質(zhì)粒，線性化后在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞即得所述重組腺病毒rAd-0RF2-TCE。
7.如權(quán)利要求6所述的重組腺病毒rAd-0RF2-TCE，其特征在于，所述重組腺病毒rAd-0RF2-TCE經(jīng)過至少3輪噬斑純化。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的重組腺病毒rAd-0RF2-TCE在豬病毒性免疫疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N7/01GK103805573SQ201310754470
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】羅滿林, 陳瑞愛, 莫永正, 高娟 申請(qǐng)人:廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司