高密度發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種高密度發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。為了解決傳統(tǒng)優(yōu)化調(diào)控方法中的不足，進(jìn)一步增加普魯蘭多糖產(chǎn)量，提高普魯蘭多糖發(fā)酵過(guò)程中的效率，降低發(fā)酵過(guò)程中色素的產(chǎn)生，本發(fā)明通過(guò)兩階段調(diào)控pH和溶氧，從而實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，將普魯蘭多糖產(chǎn)量提高50%以上，而且在一定程度上降低了色素的產(chǎn)生，為后續(xù)提取減少了麻煩，進(jìn)一步降低了普魯蘭多糖的成本。
【專利說(shuō)明】高密度發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種高密度發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法，特別涉及一種兩階段調(diào)控PH和溶氧來(lái)生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物多糖主要指大部分細(xì)菌、少量的真菌和藻類產(chǎn)生的多糖。由于具有安全性高、副作用小、理化特性獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)且生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)、地域、病蟲(chóng)害等條件的限制而使其在食品和非食品工業(yè)備受關(guān)注，尤其在醫(yī)藥領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。常見(jiàn)的微生物多糖有:黃原膠、結(jié)冷膠、熱凝膠、普魯蘭多糖等。
[0003]微生物多糖發(fā)酵大部分屬于高粘度發(fā)酵，由于微生物多糖多屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，在微生物處于穩(wěn)定期開(kāi)始大量產(chǎn)生，所以目前研究提高微生物多糖產(chǎn)量的方法基本上都是將微生物多糖發(fā)酵分為兩個(gè)階段:第一階段是通過(guò)優(yōu)化條件使菌體大量產(chǎn)生；第二階段是菌體進(jìn)入穩(wěn)定期以后通過(guò)改變條件使多糖大量產(chǎn)生。
[0004]高密度發(fā)酵采用兩階段工藝，一方面可以減少菌體培養(yǎng)階段的設(shè)備規(guī)模，節(jié)省大型發(fā)酵罐在發(fā)酵過(guò)程中的功率消耗和能量消耗，另一方面可以提高細(xì)胞培養(yǎng)和多糖合成的生產(chǎn)強(qiáng)度，使生產(chǎn)過(guò)程達(dá)到節(jié)能降耗的目的。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)中大多都是通過(guò)菌種誘變、培養(yǎng)基優(yōu)化來(lái)提高普魯蘭多糖產(chǎn)量，但由于普魯蘭多糖發(fā)酵屬于高粘度發(fā)酵，在發(fā)酵后期，隨著粘度的增加，菌體對(duì)底物的利用效率大大降低，色素產(chǎn)生嚴(yán)重，對(duì)后續(xù)提取過(guò)程帶來(lái)了極大的不便，而通過(guò)傳統(tǒng)優(yōu)化的方法進(jìn)行調(diào)控，對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的增加往往不是很明顯，而且發(fā)酵效率也不能得到很好提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決傳統(tǒng)優(yōu)化調(diào)控方法中的不足，進(jìn)一步增加普魯蘭多糖產(chǎn)量，提高普魯蘭多糖發(fā)酵過(guò)程中的效率，降低發(fā)酵過(guò)程中色素的產(chǎn)生，本發(fā)明通過(guò)兩階段調(diào)控PH和溶氧，從而實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，大大提高普魯蘭多糖的生產(chǎn)強(qiáng)度。
[0007]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0008]高密度發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法，通過(guò)兩階段調(diào)控pH和溶氧，第一階段使菌體大量生長(zhǎng)，菌體得到大量的積累；第二階段改變PH和溶氧，使普魯蘭多糖大量產(chǎn)生。具體包括如下步驟:
[0009](I)將菌株接于種子培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶活化，轉(zhuǎn)速為150-250rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為30-35小時(shí)。
[0010](2)活化后的種子培養(yǎng)液以2-5% (v/v)的量接于新的種子搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150-250rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為16-20小時(shí)。
[0011](3)將步驟(2)所得種子液以2-5% (v/v)的量接于5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)菌體生長(zhǎng)情況即OD62tl值對(duì)pH和溶氧進(jìn)行調(diào)控:當(dāng)菌體OD62tl < 0.7(種子干重小于12g/L)時(shí)，溶氧降至60%左右時(shí)，將溶氧與攪拌串聯(lián)，使溶氧維持在50%-60%之間，同時(shí)利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調(diào)控pH使其穩(wěn)定在2.8-3.2之間使菌體大量產(chǎn)生；當(dāng)菌體OD620 ^ 0.7 (種子干重不小于12g/L)時(shí)，將溶氧設(shè)定在25%-30%之間，同時(shí)利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調(diào)控pH使其穩(wěn)定在4.8-5.2之間使菌體大量合成普魯蘭多糖；溫度28°C，發(fā)酵時(shí)間72-96小時(shí)。
[0012](4)每隔8小時(shí)取樣記錄測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo):pH、溶氧、菌體干重、普魯蘭多糖產(chǎn)量。
[0013]所述菌株具體為出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans) BCSWGHPL101,于 2012年12月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)CGMCC N0.7055，分類命名出芽短梗霉 Aureobasidium pullulans。
[0014]所述菌體干重測(cè)定:準(zhǔn)確取30mL發(fā)酵液5000rpm離心20min,去除上清,菌體蒸懼水洗滌離心2-3次，然后進(jìn)行抽濾，80°C烘箱烘干稱重，此質(zhì)量乘以1000除以30即粗干重，以g/L記。
[0015]所述普魯蘭多糖粗糖測(cè)定:準(zhǔn)確取30mL發(fā)酵液15000rpm離心20min去除菌體,上清液用兩倍無(wú)水乙醇醇沉，所得沉淀烘干稱重，此質(zhì)量乘以1000除以30即粗產(chǎn)量，以g/L記。
[0016]有益效果
[0017]本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法，操作簡(jiǎn)單，不僅解決了普魯蘭高粘度發(fā)酵過(guò)程中對(duì)底物利用率低的問(wèn)題，而且增加了普魯蘭多糖的產(chǎn)量，提高了普魯蘭多糖的生產(chǎn)強(qiáng)度，而且在一定程度上降低了色素的產(chǎn)生，為后續(xù)提取減少了麻煩，進(jìn)一步降低了普魯蘭多糖的成本。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1
[0019](I)將CGMCC N0.7055菌株接于種子培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶活化，轉(zhuǎn)速為150rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為35小時(shí)。
[0020](2)活化后的種子培養(yǎng)液以2-5% (v/v)的量接于新的種子搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為20小時(shí)。
[0021](3)將所得種子液以2-5% (v/v)的量接于5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)菌體生長(zhǎng)情況即OD62tl值對(duì)pH和溶氧進(jìn)行調(diào)控:當(dāng)菌體OD62tl < 0.7(種子干重小于12g/L)時(shí)，溶氧降至60%左右時(shí)，將溶氧與攪拌串聯(lián)，使溶氧維持在50%，同時(shí)利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調(diào)控PH使其穩(wěn)定在2.8之間使菌體大量產(chǎn)生；當(dāng)菌體OD62tl ^ 0.7(種子干重不小于12g/L)時(shí)，將溶氧設(shè)定為25%，同時(shí)利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調(diào)控pH使其穩(wěn)定在4.8之間使菌體大量合成普魯蘭多糖；溫度28°C，轉(zhuǎn)速300rpm，發(fā)酵時(shí)間72小時(shí)。
[0022] 種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖100g/L、酵母浸粉3g/L、氯化鈉2.5g/L、硫酸銨lg/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP041g/L、FeS04.7H200.05g/L，其余為水，ρΗ7.0。
[0023]發(fā)酵培養(yǎng)基成分:蔗糖150g/L、尿素 2g/L、氯化鈉 2.5g/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP042g/L、FeS04.7H200.05g/L,其余為水，初始 pH6.0。
[0024]發(fā)酵完成后，菌體粗干重為16.53g/L，粗多糖產(chǎn)量為:78.8g/L。與未進(jìn)行調(diào)控(pH自然，通風(fēng)比1:1，轉(zhuǎn)速300rpm)的對(duì)照試驗(yàn)相比產(chǎn)量提高了 57.6% ;離心之后上清在654nm下OD值為0.132，與未進(jìn)行調(diào)控相比(0D值為0.25)，色素降低了 47.2%。
[0025]注:飽和硫酸鈉溶氧為零；轉(zhuǎn)速500rpm，通風(fēng)量為7L/min時(shí)溶氧為100%。
[0026]實(shí)施例2
[0027](I)將CGMCC.N0.7055菌株接于種子培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶活化，轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為32小時(shí)。
[0028](2)活化后的種子培養(yǎng)液以2-5% (v/v)的量接于新的種子搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為18小時(shí)。
[0029](3)將所得種子液以2-5% (v/v)的量接于5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)菌體生長(zhǎng)情況即OD62tl值對(duì)pH和溶氧進(jìn)行調(diào)控:當(dāng)菌體OD62tl < 0.7(種子干重小于12g/L)時(shí)，溶氧降至60%左右時(shí)，將溶氧與攪拌串聯(lián)，使溶氧維持在55%，同時(shí)利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調(diào)控PH使其穩(wěn)定在3.0使菌體大量產(chǎn)生；當(dāng)菌體OD62tl ^ 0.7 (種子干重不小于12g/L)時(shí)，將溶氧設(shè)定為28%，同時(shí)利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調(diào)控pH使其穩(wěn)定在5.0之間使菌體大量合成普魯蘭多糖；溫度28°C，轉(zhuǎn)速300rpm，發(fā)酵時(shí)間88小時(shí)。
[0030]種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖100g/L、酵母浸粉3g/L、氯化鈉2.5g/L、硫酸銨lg/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP041g/L、 FeS04.7H200.05g/L，其余為水，ρΗ7.0。
[0031]發(fā)酵培養(yǎng)基成分:蔗糖150g/L、尿素 2g/L、氯化鈉 2.5g/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP042g/L、FeS04.7H200.05g/L,其余為水，初始 pH6.0。
[0032]發(fā)酵完成后，菌體粗干重為16.63g/L，粗多糖產(chǎn)量為:80.67g/L。與未進(jìn)行調(diào)控(pH自然，通風(fēng)比1:1，轉(zhuǎn)速300rpm)的對(duì)照試驗(yàn)相比產(chǎn)量提高了 61.34% ;離心之后上清在654nm下OD值為0.112，與未進(jìn)行調(diào)控相比(0D值為0.25)，色素降低了 55.2%。
[0033]實(shí)施例3
[0034](I)將CGMCC.N0.7055菌株接于種子培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶活化，轉(zhuǎn)速為250rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為30小時(shí)。
[0035](2)活化后的種子培養(yǎng)液以2-5% (v/v)的量接于新的種子搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為250rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為16小時(shí)。
[0036](3)將所得種子液以2-5% (v/v)的量接于5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)菌體生長(zhǎng)情況即OD62tl值對(duì)pH和溶氧進(jìn)行調(diào)控:當(dāng)菌體OD62tl < 0.7(種子干重小于12g/L)時(shí)，溶氧降至60%左右時(shí)，將溶氧與攪拌串聯(lián)，將溶氧設(shè)定為60%，同時(shí)利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調(diào)控pH使其穩(wěn)定在3.2使菌體大量產(chǎn)生；當(dāng)菌體OD62tl ^ 0.7 (種子干重不小于12g/L)時(shí)，使溶氧維持在30%之間，同時(shí)利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調(diào)控PH使其穩(wěn)定在5.2之間使菌體大量合成普魯蘭多糖；溫度28°C，轉(zhuǎn)速300rpm，發(fā)酵時(shí)間96小時(shí)。
[0037]種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖100g/L、酵母浸粉3g/L、氯化鈉2.5g/L、硫酸銨lg/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP041g/L、FeS04.7H200.05g/L，其余為水，ρΗ7.0。
[0038]發(fā)酵培養(yǎng)基成分:蔗糖150g/L、尿素 2g/L、氯化鈉 2.5g/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP042g/L、FeS04.7H200.05g/L,其余為水，初始 pH6.0。
[0039]發(fā)酵完成后，菌體粗干重為18.70g/L，粗多糖產(chǎn)量為:76.2g/L。與未進(jìn)行調(diào)控(pH自然，通風(fēng)比1:1，轉(zhuǎn)速300rpm)的對(duì)照試驗(yàn)相比產(chǎn)量提高了 52.4% ;離心之后上清在654nm下OD值為0.129，與未進(jìn)行調(diào)控相比(0D值 為0.25)，色素降低了 48.4%。
【權(quán)利要求】
1.一種高密度發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法，具體步驟如下: (1)將菌株接于種子培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶活化，轉(zhuǎn)速為150-250rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為30-35小時(shí); (2)活化后的種子培養(yǎng)液以2-5%(v/v)的量接于新的種子搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150-250rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為16-20小時(shí); (3)將步驟(2)所得種子液以2-5%(v/v)的量接于5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)菌體生長(zhǎng)情況即OD62tl值對(duì)pH和溶氧進(jìn)行調(diào)控:當(dāng)菌體OD62tl < 0.7 (種子干重小于12g/L)時(shí)，溶氧降至60%左右時(shí)，將溶氧與攪拌串聯(lián)，使溶氧維持在50%-60%之間，同時(shí)利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調(diào)控pH使其穩(wěn)定在2.8-3.2之間使菌體大量產(chǎn)生；當(dāng)菌體OD620 ^ 0.7 (種子干重不小于12g/L)時(shí)，將溶氧設(shè)定在25%-30%之間，同時(shí)利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調(diào)控pH使其穩(wěn)定在4.8-5.2之間使菌體大量合成普魯蘭多糖；溫度28°C，發(fā)酵時(shí)間72-96小時(shí)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種高密度發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法，其特征在于:所述菌種為出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) BCSWGHPL101,保藏編號(hào) CGMCC N0.7055。
【文檔編號(hào)】C12P19/10GK103740785SQ201310754978
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月28日
【發(fā)明者】喬長(zhǎng)晟, 宋亞瓊, 郝華旋, 馬正旺 申請(qǐng)人:天津北洋百川生物技術(shù)有限公司